Ein Verfahren zur Auswahl Struktur-Schalt Aptamere zu einem Farbmetrik Gold-Nanopartikeln Assay angewandt

Summary

Es wird ein Protokoll zur Auswahl von strukturwechselnden Aptameren für kleine Molekülziele bereitgestellt, basierend auf einer einstellbaren Methode zur Auswahl magnetischer Beads. Aptamere, die mit strukturwechselnden Eigenschaften ausgewählt wurden, sind vorteilhaft für Assays, die eine Konformationsänderung erfordern, um das Vorhandensein eines Ziels zu signalisieren, wie z. B. der beschriebene Goldnanopartikel-Assay.

Abstract

Kleine Moleküle bieten eine reichhaltige Ziele für Biosensorik Anwendungen aufgrund ihrer physiologischen Auswirkungen als Biomarker für verschiedene Aspekte der menschlichen Gesundheit und Leistung. Nukleinsäure-Aptamere wurden zunehmend als Erkennungselemente auf Biosensorplattformen angewendet, aber die Auswahl Aptamere gegen kleine Molekül-Ziele erfordert eine spezielle Design-Überlegungen. In dieser Arbeit wird die Abänderung und die kritischen Schritte eines Verfahrens zur Struktur-Schalt Aptamere, um Kleinmoleküle Ziele auszuwählen. Bindungssequenzen aus einer DNA-Bibliothek, um komplementäre DNA-Fängersonden auf magnetischen Kügelchen hybridisiert sind aus nonbinders über ein Zielinduzierte Konformationsänderung getrennt. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, weil Sequenzen Bindung der Trägermatrix (Kügelchen) werden nicht weiter verstärkt werden, und es spielt keine Immobilisierung des Zielmoleküls erfordern. Allerdings ist die Schmelztemperatur der Einfangsonde und der Bibliothek bei oder etwas über Raumtemperatur gehalten wird, so dass Sequenzen tHut dehybridisieren basierend auf Thermodynamik wird auch in der überstehenden Lösung vorliegen. Dies begrenzt effektiv die Partitionierung Effizienz (die Fähigkeit, getrennte Zielbindungssequenzen von nonbinders) und daher viele Selektionsrunden werden benötigt, um Hintergrundsequenzen entfernt werden. Das berichtete Verfahren unterscheidet sich von früheren Struktur-Schalt Aptamerselektion durch Umsetzung der negativen Selektionsschritte, vereinfacht Bereicherung Überwachung, und die Erweiterung der Länge der Fangsonde folgende Auswahl Bereicherung verbesserte Stringenz bereitzustellen. Die gewählte Struktur vermittelnden Aptamere sind vorteilhaft in einem Gold-Nanopartikel-Assay-Plattform, die das Vorhandensein eines Zielmoleküls von der Konformationsänderung des Aptamers berichtet. Die Gold-Nanopartikel-Assay wurde angewandt, da sie eine einfache, schnelle kolorimetrische Anzeige, die vorteilhaft in einer klinischen oder bereitgestellte Umgebung ist. Gestaltung und Optimierung Überlegungen für den Test als Proof-of-principl vorgestelltE Arbeit in Puffer eine Grundlage für den weiteren Ausbau des Werks in Richtung Kleinmolekül-Biosensorik in physiologischen Flüssigkeiten zur Verfügung zu stellen.

Introduction

Kleine Moleküle, die lange als spielen eine lebenswichtige Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, wie physiologische Toxizität oder Ernährung, Zellsignalisierung und als pharmazeutische Behandlungen für Krankheiten ¹ anerkannt. Verschiedene kleine Moleküle sind auch als Biomarker Hinweis auf physiologischen Bedingungen wie Stress ^2,3, Müdigkeit ⁴ und ⁵ Krankheit vorgeschlagen. Zum Beispiel, erhöhte Cortisolspiegel korrelieren mit Stress, die zu einer verminderten physiologischen Leistungsfähigkeit und anderen gesundheitlichen Bedingungen ^8.6 führen kann. Ebenso sind Variationen in den Verhältnissen von bestimmten Peptiden im Speichel prädiktiv Müdigkeit, wo physiologische Manifestationen einschließlich Konzentrationsmangel, beeinträchtigter Reaktionszeit und die kognitive Funktion ^4. Daher kann die Entwicklung von zielspezifische Biosensoren, um die Ebenen von kleinen Molekülen beobachten einen wertvollen Maßstab für die Beurteilung der Gesundheit und Leistungsfähigkeit eines indiv liefernIdual.

Historisch hat kleine Moleküldetektion durch arbeitsintensive Trennungstechniken oder durch Antikörper-basierte Erkennungs ^6,7 durchgeführt. In jüngerer Zeit haben Nukleinsäure-Aptamere ^9,10 als Erkennungselemente, die bestimmte Vorteile gegenüber Antikörpern in spezifischen Anwendungen besitzen taucht. Mit ihrer Fähigkeit, ein Ziel in verschiedenen Größen von Metallionen ¹¹ bis ¹² Geweben binden, Aptamere wurden weithin als Erkennungselemente in der Biosensorik Plattformen ^13,14 aufgebracht. Im Vergleich zu Antikörpern sind Aptamere chemisch synthetisiert, und es ist deshalb einfach, reproduzierbar chemische Modifikationen zur Oberflächen Immobilisierung oder Berichts einzuführen. Aptamere können mit hoher Zielspezifität unter den gewünschten Bedingungen durch Modifizieren der verwendeten Selektionsbedingungen eingestellt werden, wodurch Antikörper an physiologischen Bedingungen ^15,16 begrenzt. Außerdem sind Aptamere fähig höheren Ligandendichte aufgrund thEir kleinere Größe, was zu höheren Zielsignalisierungseffizienz auf einem Biosensor-Plattform und die verbesserte Stabilität der Aptamere können für eine wiederholte Verwendung und langfristig Sensorspeicher ^16.

Aptamere werden unter Verwendung eines Verfahrens wie SELEX, wobei eine anfängliche Sequenzbibliothek von 10 ¹³ -10 ¹⁵ einzigartige Moleküle zu einer angereicherten Endvorrat enthält mehrere (10 ¹ -10 ²⁾ Sequenzen, mit dem Potenzial, das Zielmolekül zu binden, entwickelt es erzeugt. Die endgültige angereicherten Pool wird dann sequenziert, und die Dissoziationskonstanten (K _d) von Bindungsassays der höchsten Kopienzahl-Sequenzen mit dem Zielmolekül erhalten wird. Evolution des Pools zu einer endgültigen angereicherte Population wird durch Überwachen des Prozentsatzes des Pools der Bindung des Ziel in jeder Runde bis maximale Anreicherung erhalten wird verfolgt. Diese über eine Anzahl von Entwicklungsrunden, wobei Bindungssequenzen aus nonbinders und ampl partitioniert erfolgtified Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Fähigkeit, effektiv aufzuteilen und zu halten Bindemittel ist eine der Hauptdeterminanten für die Effizienz der Auswahl und wirkt sich direkt auf die Eigenschaften der ausgewählten Aptamere ^15. Die SELEX Partitionierung Stufe ist schwieriger für kleine Moleküle, da sie nicht die Größe oder verschiedene funktionelle Gruppen, die die Partitionierung Prozess der Protein-Targets ^1,15 helfen besitzen. Beispielsweise beruhen viele Protein Partitionierung Plattformen Größe oder Ladung basierende Trennung ist jedoch die Eigenschaften des gebundenen DNA-Kleinmolekül-Ziel-Komplexe sind im allgemeinen nicht signifikant anders als die der nichtbindenden Sequenzen, was zu einer unwirksamen Partitionierung ^1. Alternative SELEX Partitionierung Verfahren können Immobilisierung oder Markierung des Targets, die die Bindungseigenschaften eines kleinen Moleküls möglicherweise ändern. Folglich Design eines Auswahlverfahrens, um Aptamere erzeugen für kleines Molekül richtet requires besondere Aufmerksamkeit.

Eine Vielzahl von Modifikationen wurden dem Original-SELEX-Methode angewendet worden, um die Partitionierung Effizienz des Verfahrens zu verbessern, verbessern die Affinität oder Spezifität der Sequenzen im Finale den Pool oder machen es sich auf andere Anwendungen ^15,16. Ein SELEX Modifikation auswählen kann, für kleine Moleküle wurde entwickelt, um Struktur-Schalt Aptamere oder Aptameren, die eine Konformationsänderung bei der Wechselwirkung mit dem Zielmolekül ^17,18 laufen zu erzeugen. In einem Beispiel dieses Verfahrens wird die Bibliothek auf einem kurzen Stück des nicht-bindenden komplementären DNA (cDNA) an Magnetkügelchen immobilisiert ¹⁷ hybridisiert. Bei der Zielbindungs ​​die Konformationsänderung des Bindungssequenzen können sie von der cDNA dehybridisieren, Freigabe in der überstehenden Lösung, während die verbleibenden nonbinders an die cDNA hybridisiert / Beads werden magnetisch partitioniert und verworfen. Dieses Verfahren ist Advaneilig bei kleinen Molekülen, weil es nicht erforderlich Immobilisierung bzw. Markierung des Zielmoleküls, um die Trennung zu erzielen.

Aptamere sollen strukturSchalt sind besitzen eine wertvolle Funktion für jeden potenziellen Biosensorplattform, die eine Änderung in Aptamerstruktur erfordert, um die Anwesenheit eines Zielmoleküls zu detektieren. Insbesondere können Aptamere mit Gold-Nanopartikeln (AuNPs) kombiniert werden, um Tests, die auf der Struktur-Schaltprinzip funktionieren, um eine colorimetrische Reaktion in Gegenwart von Zielmolekül nach Salz Herausforderung ^19,20 produzieren erstellen. In einem AuNP Assay wird die Einzelstrang-DNA (ssDNA) Aptamer zunächst adsorbiert an die AuNP Oberfläche und schützt sie vor Salz Herausforderung. Die Anwesenheit der Ziel induziert eine Konformationsänderung im Aptamer, das AuNP Oberfläche aussetzt, was zu einem roten zu blauen Farbwechsel, die Salzzugabe. AUNP Tests haben auch gezeigt, um Signalgegebenen mikromolaren Affinität Aptamer amplifizierens Ziel auf Niveaus Grßenordnungen niedriger als die Dissoziationskonstante (K _d) ²¹ zu erfassen. Diese Funktion ist besonders für Kleinmolekül-Ziele, wo Affinitäten typischerweise im Bereich von niedrigen mikromolaren bis millimolaren Konzentrationen ^1,15 attraktiv. Im Allgemeinen ist der Test auch eine schnelle und relativ einfach durchzuführen, die Förderung der weiteren Untersuchung der Aptamer-AuNP Assays als Biosensor-Detektionsplattformen.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein universelles Protokoll für die Auswahl der Struktur-Schalt Aptamere für kleine Moleküle für Biosensorik Anwendungen mit dem Stress-Marker Cortisol als Vertreter Moleküls liefern. Ein AuNP Biosensor-Detektionsschema ist interessant wegen seiner Einfachheit der Bedienung und farbmetrischen Auslesen, aber strukturSchalt Aptamere auch für den Hilfssensorplattform Ausgänge, wie elektrochemische ²² oder Fluoreszenz ^23, die auch eine Erkennung über eine Änderung der Aptamer conformation auf Zielbindungs. Im Vergleich zu früheren Methoden wurden mehrere negative Selektion Schritte in das Design ^17,18 eingearbeitet und eine einfache UV-basierte Anreicherung Nachweisschema wurde (Abbildung 1) durchgeführt. Dieses Protokoll ist im Gegensatz zu den Radioliganden Bereicherung Erkennungsschema in Legacy-Verfahren ¹⁷ verwendet. Das vorgeschlagene Verfahren aufgenommen auch eine Zunahme in der Länge der cDNA Einfangsonden in der Auswahl, die Partitionierung Effizienz zu erhöhen und wirksam Abstimmung der Stringenz der Selektion nach maximaler Anreicherung wurde ²⁴ beobachtet. Der abgestimmte Stringenz führen zu einer niedrigeren Gesamtanteil der DNA durch das Ziel in der Endvorrat eluiert, aber zu einer höheren Kopienzahlen aus einer Sequenz im Vergleich zu der höchsten Kopienzahl-Sequenz aus einer früheren Runde, die mit erhöhter Affinität gebunden. Die höchste Kopienzahl-Sequenz aus dem letzten Pool wurde auf eine AuNP Test angewendet, um zu veranschaulichen, dass die Folge war offen für eine Plattformdas erfordert eine strukturelle Veränderung der Ziel zeigen verbindlich. Dieser Puffer basierten Assay zeigt, dass die Reaktion des AuNP Assay kann durch Ändern der Dichte der DNA modifiziert werden, um die Oberfläche aufgebracht wird, und dient als Proof-of-Prinzip arbeiten, um die zukünftige Forschung Anstrengungen zur Entwicklung niedermolekularer aptamerbasierten AuNP Biosensoren widmen physiologischen Flüssigkeiten.

Protocol

1. Bibliothek und Primer Design und Synthese

1. Entwerfen Sie die erste Bibliothek und Primer (dieses Thema wurde ausführlich in früheren Publikationen überprüft) ^25,26.
   1. Synthetisieren die folgenden Sequenzen für diese Studie mit Standard- Phosphoramidit-Chemie:
      Bibliothek: GAATGGATCCACATCCATGG-N ₄₀ -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
      Forward Primer: GGAATGGATCCACATCCATGG
      Reverse Primer: Biotin-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA
   2. Design der cDNA Einfangsonden komplementär zur 5'-Region der Bibliothek sein. Wählen der anfänglichen Länge durch Analyse von Online-Schmelztemperatur Software, um eine Schmelztemperatur etwas oberhalb RT bereitzustellen, wobei jede nachfolgende Basis Zuführen eines erhöhten Schmelztemperatur.
      mer Capture-Sonde: CCATTCC-Biotin
      mer Capture-Sonde: TCCATTCC-Biotin
      mer Capture-Sonde: ATCCATTCC-Biotin
2. Reinigen Sie die Bibliothek von Standard-HPLC. Die Entsalzung ist ausreizient für die Primer und Einfangsonden. Rekonstituieren Oligonukleotide in Nuklease freiem Wasser in der gewünschten Konzentration und bei -20 ° C für bis zu mehreren Monaten.

2. Buffer, Bibliothek, und Probenvorbereitung

1. Bereiten 500 ml Puffer in Millipore oder Nuklease-freies reines Wasser mit Konzentrationen von 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl _2, pH 7,4. Filtern der Puffer durch ein steriles 0,2 um-Membran; Lagerung über Monate möglich bei Umgebungsbedingungen.
   1. Alternativ dazu können andere Puffer, wie PBS (phosphatgepufferte Salzlösung), HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure) usw.
2. Gründung von zwei Thermomixer; setzen ein auf 95 ° C und die andere halten bei Umgebungsbedingungen (~ 20 ° C in dieser Arbeit). Bereiten Sie einen Eiskübel.
3. Heat / Snap kühlen die DNA-Bibliothek, indem 100 ul-Bibliothek (~ 2,5 nmol 10 ¹⁵ -10 ¹⁶ Sequenzen) im Thermomixer setzen eint 95 ° C für 5 min. Das Röhrchen auf Eis, während die magnetischen Beads werden vorbereitet (Abschnitte 3.1-3.6). Bestimmen Sie die tatsächliche Konzentration der DNA-Bibliothek durch UV-Absorption bei λ = 260 nm und Anwendung der entsprechenden Umrechnungsfaktor für die Bibliothek.
4. Bereiten Sie die Zielstammlösungen in einem geeigneten Medium für die Ziel Löslichkeit.
   1. Bereiten 100 mM Analyten Aktien in DMSO. Diese Bestände lebensfähig für ca. 1 Monat sind, wenn sie bei Umgebungsbedingungen gelagert, aber unterschiedliche Ziele unterschiedliche Abbauprofile zeigen.

3. Herstellung der Magnetic Beads und Erste Runde der Auswahl

1. Vortex 6.7 x 10 ⁸ Kügelchen / ml Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen und entfernen 400 ul auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Das Röhrchen wird auf dem Magneten für 2 min und Überstand.
2. Waschen der Kügelchen durch Zugabe von 400 ul Bindungspuffer, Vortexen und Absaugen des Überstands nach der Platzierungdas Rohr auf dem Magneten, um die Perlen zu trennen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
3. Immobilisierung der Fangsonde an den magnetischen Kügelchen durch Resuspendieren der Kügelchen in 400 & mgr; l Bindungspuffer mit 50 uM (final) Einfangsonde und Inkubieren für 10 min unter leichtem Rühren auf das Thermomixer bei Umgebungsbedingungen.
4. Dreimal mit 400 ul Bindungspuffer Waschen der Kügelchen durch Wiederholung der in Abschnitt 3.2 zum kostenlosen Fangsonde zu entfernen Waschschritte.
5. Resuspendieren der Beads in 400 ul Bindungspuffer. Entfernen 100 ul des Wulstes Lösung für die nächsten Schritte, und bewahren die verbleibenden 300 & mgr; l bei 4 ° C für weitere Selektionsrunden für eine von drei Wochen verwendet.
6. Zweimal waschen Sie die Perlen mit 200 ul Bindungspuffer, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben.
7. Fügen Sie die 100 ul Schnapp gekühlt DNA aus Abschnitt 2.3 zu den gewaschenen Perlen und Inkubation für 30 min unter leichtem Schütteln unter Verwendung des Thermomixer bei Umgebungsbedingungen.
   NHINWEIS: Die DNA-Konzentrationen in den ersten Runden sind höher als die der nachfolgenden Runden Sequenzverlust in früheren Runden wo einzigartige Sequenzen theoretisch vorliegen minimieren.
8. Quantifizierung der DNA im Überstand mittels UV-Absorption, wie in Kapitel 2.3 und subtrahieren diese von der ersten Menge in Abschnitt 3.7 hinzugefügt, um die Menge an DNA an die Perlen gebunden zu bewerten.
   1. Mit 200 ul Bindungspuffer, gefolgt von zwei zusätzlichen Waschungen mit 200 ul Bindungspuffer unter leichtem Schütteln auf einem Thermomischer für 5 Minuten bei Umgebungsbedingungen Waschen der Kügelchen.
9. Resuspendieren der Kügelchen in 200 & mgr; l von 100 & mgr; M Ziel in Bindungspuffer verdünnt und Drehen auf der Thermomixer für 30 Minuten bei Umgebungsbedingungen. Bereiten Sie die Arbeitslösungen zu Beginn eines jeden Tages vor der Auswahl frischer, da der Ziel und Kontrolle wurde beobachtet, dass der wässrigen Lösung im Laufe der Zeit zu aggregieren aus. Bewahren Sie die überstehende Lösung, die das Ziel-Sequenz enthält, eluierts für eine weitere Studie.
10. Führen die negative Selektion nach der Beendigung 1-2 Runden durch Zugabe von 200 ul von 1 uM Progesteron an den in Abschnitt 3.8.1 hergestellten Perlen. Vorsichtig schütteln für 30 Minuten auf dem Thermomixer bei Umgebungsbedingungen.
11. Verwenden Sie die magnetische Halterung, um die Perlen zu erfassen und den Überstand verwerfen, Waschen der Kügelchen zweimal in 200 ul Bindungspuffer vor Cortisol hinaus, wie in Abschnitt 3.9.

4. Anreicherung Überwachung, PCR und Einzelstrang-DNA-Generation

1. In der überstehenden Lösung in einen Dialysekassette Auswahl Bereicherung zu überwachen. Dialyse notwendig ist Cortisol aus der eluierten DNA in viel höheren Konzentrationen zu entfernen, weil Cortisol vorliegt als die DNA, und hat auch eine UV-Absorptionsspitze, die die Standard-DNA-UV λ _max = 260 nm überlappt.
   1. Führen Sie diesen Schritt jedes zweite Runde (Runde 2, 4, 6, und 8) in den ersten Runden der Selektion. Dies mildert Probe loss, wenn möglicherweise einige Kopienzahl jeder Sequenz vorhanden sind (höchste Diversität). Für schnellere Ergebnisse können alternative Verfahren, wie Größenausschluss Spalten ebenso verwendet werden.
2. Dialysieren Kassette mit Probe in frischen 250 ml Bindepuffer für 2 h bei Umgebungsbedingungen zweimal. Ersetzen Puffer und Inkubation bei 4 ° CO / N.
3. Analysieren Sie den dialysiert Pool durch UV-Spektroskopie, um den Prozentsatz der DNA durch das Ziel eluiert bestimmen (im Vergleich zu Ergebnissen der Abschnitt 3.8).
4. Vorbereiten einer 3% igen Agarose-Gel mit 1% w / v Ethidiumbromid. In dieser Arbeit vorzubereiten eines Gels aus 1,5 g Agarose, 50 ml TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH = 8,0) und 10 ul Ethidiumbromid.
5. Zyklus-Optimierung der dialysiert Pool, der von der Durchführung einer kleinen PCR (5 x 50 ul Aliquots) mit ~ 5-15 Zyklen. Für die PCR-Komponenten verwenden, 1x PCR-Reaktionspuffer (alle Endkonzentrationen), 200 uM dNTPs, 10% Reaktionsvolumen von DNA-Template, 500 nM von jedem Primer und 2,5U-Polymerase (2,5 U / ul Lager).
   1. Run PCR mit optimierten Bedingungen bei 95 ° C für 2 min, gefolgt von wiederholten Zyklen von 95 ° C (30 sec), 55 ° C (30 sec) und 72 ° C (1 min), dann eine 72 ° C (10 min) Endausbau Halten bei 4 ° C.
   2. Verwenden Sie ein 25 bp Standardleiter für den Vergleich und die Visualisierung auf einem Gel-Imager. Auswahl der Anzahl von Zyklen, die die höchste Intensität Band im richtigen Größenmarker erzeugt, ohne unerwünschte Nebenprodukte.
   3. Analysieren der Ergebnisse der Optimierungszyklus durch die Kombination von 10 ul jedes PCR-Zyklus mit 2 ul 6xBLAU / Orange Ladefarbstoff, und geladen in 5 separate Vertiefungen der 3% igen Agarose-Gel in Schritt 4.4 (125 V für 45 min) hergestellt.
6. Führen Sie eine groß angelegte PCR unter Verwendung der Bedingungen und entsprechenden Zyklusnummer in Abschnitt 4.5 festgelegt. In der Regel 6-8 ml PCR-Reaktionen wurden benötigt, um die 1 bis 2,5 nmol pro Runde in dieser Auswahl verwendet erhalten. Verwenden Sie 8-Strip Rohre zu vereinfachenHandhabung der vielen Rohren erforderlich, um dieses Volumen für die PCR-Amplifikation aliquotieren.
7. Bereiten Sie eine 3% Agarose-Gel, wie in Abschnitt 4.4 beschrieben, und bestätigen, dass die PCR-Produktbande wird an der richtigen Stelle auf den Spuren von Abschnitten 4.5.2-4.5.3.
8. Konvertieren Sie die gesamte doppelsträngigen DNA-Produkt von Abschnitt 4.7, um Einzelstrang-DNA durch die wie folgt vor:
   1. Fügen Sie 300 ul Streptavidin-beschichteten Kügelchen (nicht magnetisch), um eine kleine Säule von Fritten blockiert. Mit 5 ml Bindungspuffer durch die Anbringung eines Luer-Lock-Spritze und mit leichtem Druck auf den Kolben Waschen der Kügelchen. Nehmen Sie die Spritze aus der Spalte und ziehen Sie den Kolben aus der Spritze off-line nach der Zugabe der einzelnen Materialien, so dass die Kugeln nicht durch Kolben Aspiration gestört.
   2. Fügen Sie das PCR-Produkt und geben sie durch die Säule mit leichtem Druck auf den Kolben. Benutzen mehrerer Kolonnen, daß nicht mehr als 1-1,2 ml PCR-Produkt wird auf jede Säule gegeben. Entsorgen Sie die letzten flow durch seit der DNA auf der Säule durch den Biotinrest auf der Antisense-Strang gehalten werden.
   3. Mit 5 ml Bindungspuffer Die Säule wird.
   4. Dehybridisieren die DNA durch Zugabe von 0,5 ml 0,2 M NaOH. Bewahren Sie das Eluat, da sie die Einzelstrang-DNA Sinn enthält.
9. Entsalzen die ssDNA in 0,2 M NaOH, indem die 0,5 ml auf eine Entsalzungssäule von einem Waschen mit Nuklease freiem Wasser vorbereitet. Entsorgen Sie die ersten 0,5 ml Flüssigkeit, dann fügen Sie 1 ml Nuclease freies Wasser und sammeln diese entsalzt ssDNA Probe. Für jede 0,5 ml-Anteil wird die Verwendung von mehreren Entsalzungssäulen erforderlich.
   1. Bestimmen Sie die Konzentration der DNA durch UV-Absorption bei λ = 260 nm eluiert.
   2. Vakuum-Trocknen der Probe und Rekonstitution in einem geeigneten Volumen Bindungspuffer. Wenn es nicht für die nächste Runde der Selektion erhalten genug DNA, wiederholen Abschnitte 4.6-4.9.2.

5. Nachtrags Runden von Auswahl und Sequenzierung

1. Stellen Sie die Stringenz der Selektionsbedingungen in Abhängigkeit von den Ergebnissen der Bereicherung Überwachung (Abschnitt 4.1). Im Allgemeinen machen, um die höchste Affinität Bindemittel aus dem Pool auszuwählen Bedingungen stringenter in aufeinanderfolgenden Auswahlrunden.
   ANMERKUNG: Dies könnte auch eine Kombination der Erhöhung der DNA-Konzentration, was die Anzahl, Zeit, oder das Volumen der Waschschritte, Verringern der Zielkonzentration, Erhöhung der Konzentration des negativen Auswahl-Verbindung oder eine Vielzahl von anderen Verfahren ^27.
   1. Anwenden geeigneten Kontrollen nach Bedarf, um die Spezifität der Sequenzen für das Zielmolekül zu gewährleisten. In dieser Arbeit, tragen Sie eine negative Selektion Molekül (Progesteron) auf das System (Tabelle 1) beginnt in Runde 3 und die Erhöhung der Konzentration in der gesamten Auswahl. Ab Runde 11, Pre-Inkubation der DNA-Pool für 30 min mit 10 bis 20 uM Progesteron vor der Immobilisierung auf den Perlen (vor Abschnitt 3.7).
   2. Erhöhen der Länge der Capture-Sonde nach maximaler Anreicherung beobachtet.
2. Bereiten Sie die letzte Pool (rund 15) und anderen Pools, die maximal angereicherten (rund 13) und minimal angereichert (Runde 6) Bedingungen für die Sequenzierung von PCR-Amplifikation mit Primer kompatibel und ein High-Fidelity-Polymerase.
   1. Ein 50 & mgr; l Reaktionsvolumen unter Verwendung von Endkonzentrationen von 1x (Reaktionspuffer), 200 uM (dNTP), 400 nM (jeder Primer), 0,5 ul DNA-Pool, und 0,5 ul Polymerase eingestellt. Zyklus zu optimieren für jede Runde unter Verwendung der in Abschnitt 4.5 beschriebenen Schritte unter Verwendung der gleichen PCR-Bedingungen, mit der Ausnahme einer 7 min Halten bei 72 ° C für die abschließende Extension.
   2. Senden 50 ul der hergestellten Pools zu einer Sequenzierungseinrichtung in Mikrozentrifugenröhrchen mit Kappen gründlich mit nicht-klebenden Folie verschweißt. Platzieren Sie die Röhrchen in einem 15 ml konischen Röhrchen mit Luftpolsterfolie und Schiffs O / N mit Eisbeutel auf die Sequenzierung Anlage verpackt.
3. Bestimmen Sie die Kopienzahl jeder Sequenz, die Bereicherung der sequenzierten Pool (en) zu beurteilen.
   1. Verwenden Sie Code-Schreiben / Sortierschritte (siehe Zusatz-Code-Datei) für die Sequenzdaten der nächsten Generation im FASTA-Format, um die Frequenz / Kopienzahl jeder Sequenz in den Daten für alle durch die Sequenzierung Anlage geliefert Pools wiederholt festzustellen:
4. Analysieren Sie die Spezifität und Affinität der höchsten Kopienzahl-Sequenzen. Die Art der Wechselwirkung (Protein oder kleines Molekül), strukturellen Eigenschaften des Aptamer bei der Bindung, und die erwartete Affinität wird diktieren, wobei das Verfahren geeignet ist. Dieses Thema wird in weiteren Einzelheiten in einer Anzahl von Referenzen ^1,28-30 prüft.

6. AuNP Synthese und Erkennung

1. Synthetisieren die AuNPs mit dem Citrat-Reduktionsmethode ^21. Mischen Sie 98 ml Millipore-Wasser mit 2 ml 50 mM HAuCl ₄ und zum Kochen gebracht.
2. Als 10 ml von 38,8 mM NatriumcitratSobald Rückfluss beginnt. Farbe wird nach einigen Minuten zu einer roten Farbe. Weiterhin Rühren der Lösung für 20 min mit der Wärmeabgabe.
3. Lassen Sie den AuNP Lösung auf RT durch einen 0,2 um Polyestermembran abkühlen dann filtern. Speichern Sie alle AuNP Suspensionen in einem dunklen bernsteinfarbenen Flasche.
4. Errechnen AuNP Konzentration durch UV-Absorption unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von 2,4 x 10 ⁸ l mol ^-1 cm ^{-1 31.} Die Konzentration betrug 10 nM in dieser Arbeit, mit einer Größe von 17 ± 0,6 nm durch dynamische Lichtstreuung ²¹ bestimmt.
5. Inkubieren der DNA mit 10 nM AuNP für 1 h bei Umgebungsbedingungen mit Aluminiumfolie geschützt. Vary das Volumen AuNP genügend Lösung, damit alle gewünschten Tests durchgeführt werden kann (~ 1-2 ml). Ladedichten von 73, 120 und 200 D / NP (DNA-Moleküle pro AuNP) wurden in dieser Arbeit untersucht, und das Volumen und die Konzentration wird entsprechend variieren.
6. Verdünnen Sie die DNA / AuNP Lösung 1: 1 mit HEPES-Puffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl _2, pH = 7,4). Man läßt das Gemisch bei RT äquilibrieren mit Aluminiumfolie abgedeckt.
   HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderliche Zeit benötigen, um durch den Forscher optimiert werden. In dieser Arbeit Zeiten im Bereich von mehreren Minuten bis zu O / N untersucht.
7. Bereiten Analyten (Cortisol, Cholsäure, 2-methoxynaphthalin) Stammlösungen bei 100 mM in DMSO und mit Alufolie abdecken. Stellen Sie frischen Ausgangslösungen vor jedem Experiment durch Verdünnung der Stamm zu 100 uM in einer 1/3 Verdünnung der Cortisol Bindungspuffer (Abschnitt 2.1). Weiteren Verdünnung der Ausgangslösung mit der 1/3 Bindungspuffer, so daß ein konstantes Volumen (10 ul) der Ziel zugegeben, um eine Reihe von Konzentrationen zu erzeugen.
8. Optimieren Sie die durch Zugabe von 80 ul der DNA / AuNP Lösung mit 10 ul 3.1 Bindungspuffer erforderliche Salzkonzentration (als "leer" bezeichnet).
   1. Inkubieren für 20 min bei RT fügen verschiedene Volumina von NaCl solutIonen. Achten Sie auf das Volumen von Salz, das eine kaum visuell wahrnehmbare Veränderung in Richtung eines blauen Farbton nach Salzzugabe (13-40 ul 1 M NaCl in dieser Arbeit verwendet) induziert. Dies bietet einen guten Ausgangspunkt, kann aber eine weitere Anpassung nach den Ergebnissen einschließlich Ziel Zusätzlich müssen.
9. Kombinieren 80 ul der DNA / AuNP Lösung mit 10 ul der Ziellösung und Inkubation für 20 min bei RT. Nutzen Sie eine Platte mit 96 Vertiefungen und Mehrkanalpipette, um mehrere Zielkonzentrationen gleichzeitig zu analysieren, zu denen stets eine leere (Abschnitt 6.8).
   1. Fügen Sie den entsprechenden Volumen von NaCl-Lösung (13 ul 1 M NaCl wurde in dieser Arbeit angewendet) und sofort analysieren die Absorption bei 650 und 530 nm mit einem Plattenlesegerät.
10. Zeichnen Sie die Ergebnisse als Verhältnis der Extinktionswerte (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ gegenüber der Soll-Konzentration normiert relativ zu der Leermessung.

Results

Die Stringenz der Bedingungen wurde zunächst gering vorhanden Bindemittel in einer geringen Kopienzahl in den ersten paar Runden zu behalten gehalten. Die erste Runde, insbesondere, implementiert die niedrigste Stringenz zu Bindemittel in der Regel als einzigartige Sequenzen, durch die hohe Cortisol und DNA-Konzentrationen, und das Fehlen von negativen Selektionsschritte gezeigt, präsentiert zu bewahren. Der Erfolg dieses Aptamer Auswahl wird durch die Evolution der Becken von einem niedrigen Prozentsatz von dem Ziel (Runde 2) zu einem höheren Anteil vom Ziel, das in den Runden 12-13 (Tabelle 1) relativ konstant bleibt eluiert wurde demonstriert. Diese Hochebene von DNA durch die Ziel eluiert ist traditionell ein Endpunkt in der Auswahl ("Anreicherung"). Jedoch kann dieses Verfahren weiter erhöht die Stringenz der Selektion nach Anreicherung durch Erhöhen der Länge des cDNA-Einfangsonde (Abbildung 1). Eine Verlängerung dieser Sonde erhöht die Stärke der Hybridisierung zwischen der CDNA und der Pool, die Erhöhung der Schmelztemperatur (T _m) des Komplexes, und die eine stärkere Wechselwirkung zwischen Target und Reihenfolge, um die Bindungssequenzen in Lösung freizusetzen. Die erste Runde der Selektion implementiert eine schwächere cDNA Interaktion aufgrund einer weniger G Basis am 5'Ende der Bibliothek. Dies steht im Einklang mit den in der Regel niedriger Stringenz in der ersten Runde, und wird voraussichtlich keine wesentlichen Einfluss auf das andere als Auswahl, indem es mehr Potenzial Bindemittel sowie Hintergrundsequenzen (dehybridisieren über Thermodynamik basiert), um zum nächsten Auswahlrunde weiterzugeben. Diese Hintergrundsequenzen wurden minimiert die Auswahl weiter zu Bereicherung durch die Umsetzung höherer Stringenz in den folgenden Auswahlrunden. Wenn die cDNA wurde aus einer 7-mer auf ein 8-mer in Runde 14 verlängert wird, der Prozentsatz der DNA durch die Ziel eluiert wird aus 15,3% bis 11,1% für eine T _m reduziert erhöhte sich von 19,2 ° C bis 26,7 ° C. Die cDNA wweitere 9-mer in Runde 15 mit einem _Tm von 31,3 ° C verlängert, fallen die Gesamtzahl auf 3,3% eluiert.

Weitere Informationen über die Anreicherung kann durch Sequenzierung mehrere Pools, beide bereichert und nicht-angereicherten Beispiele, um das Fortschreiten der Pools in jeder Runde zu verfolgen, erhalten werden. Next Generation Sequencing (NGS) hat als eine leistungsfähige Methode zur Sequenzierung in Auswahl entstanden, vor allem wegen höherer Folge lautet (Gesamtzahl der Sequenzen angegeben) erhält man im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung. Diese höheren Reihenfolge liest stellen eine größere Abdeckung der gesamten Anzahl von Sequenzen in den Pool und bietet ein vollständigeres Bild über die Vielfalt der Sequenzen. NGS beseitigt auch das Klonieren Vorspannung ³² und ermöglicht die Sequenzierung von mehreren Pools in einem einzigen Ansatz mit Zusatz von Barcodes ^24,33. NGS wurde verwendet, um das Fortschreiten der Anreicherung von drei verschiedenen Pools in dieser Stichprobenauswahl (Abbildung 2) zu untersuchen. Schwimmbädervon Runde 6 (leichte Anreicherung im Vergleich zu rund 2% von eluiert), rund 13 (höchste Anreicherung), und rund 15 (höchster Stringenz) wurden als repräsentative Punkte der Auswahl gewählt. Die Kopienzahl der einzelnen einzigartige Sequenz wurden aufgetragen als ein Prozentsatz der Gesamtzahl der Sequenzsätze für jeden Pool. Die bestplatzierten (höchste Kopienzahl) Folge nur konstituiert 0,1% aller Sequenzen in Runde 6 (33.435 Gesamtsequenzen, 22.463 einzigartige Sequenzen). Da der Pool wird maximal in Runde 13 angereichert, um die Sequenz erhöht bestplatzierten 15,4% des gesamten Pool (17.681 Gesamtsequenzen, 2987 einzigartige Sequenzen), 150x höher als in Runde 6 trotz nur einer ~ 5x Erhöhung der Anreicherung durch UV beobachtet umfassen . Runde 15 (28.919 Gesamtsequenz lautet 2980 einzigartige Sequenzen) sprang auf 44,9% aller durch die einzelne bestplatzierten Sequenz repräsentiert Sequenzen, obwohl die UV Bereicherung Überwachung zeigte, dass die Menge von der Ziel eluiert war ~ 5x niedriger als die der Runde 13 ( Tabelle 1

15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

Vorherige Studien untersuchten die Bindung der beiden Sequenzen durch Mikro Thermophorese und Gleichgewichtsdialyse ^24. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Bindung für Cortisol Sequenz 15-1 (K _d = 6,9 ± 2,8 & mgr; M durch Gleichgewichtsdialyse; 16,177; 0,6 uM von mikroskaligen Thermophorese), während eine minimale Bindung wurde zwischen Cortisol und Folge 15-3 beobachtet. Dies zeigt, daß die erhöhte Länge der Einfangsonde in Runde 15 in eine höhere Stringenz zu analysieren, die eine höhere Affinität Bindemittel unterstützt. Zusätzlich zeigten weder Sequenz beobachtbarer Bindung mit dem negativen Selektionsmolekül, Progesteron, zeigt, dass die Zugabe des negativen Selektionsschritte war vorteilhaft für das Verfahren.

Die Tatsache, dass eine höhere Affinität Bindemittel entstanden folgende maximale Anreicherung nach erhöhter Stringenz wurden in weiteren Runden der Selektion (hergestellt von der herkömmlichen Methode der Analyse des Prozentsatzes von DNA durch die Ziel eluiert bestimmt) validiert das Verfahren zur Verlängerung der Länge des cDNA-Capture Sonde nach der Bereicherung. Dieses Ergebnis zeigt, die Nummer von einem sequenzierten Pool und Affinität für das Ziel zu kopieren, kann nur unter bestimmten Bedingungen ^24,34 zugeordnet werden, in conhingegen mit vorherigen Bericht was auf eine direkte Korrelation ^35. Es unterstreicht auch den Nutzen der Überwachung Anreicherung durch NGS, und nicht nur durch die% eluiert Strategie in den meisten Selektionen gemeinsam, die natürlich von einer Runde zur nächsten variieren kann als höher stringenten Bedingungen angewendet werden. Allerdings% eluiert nützlich für die Überwachung Bereicherung bei ähnlichen Bedingungen über mehrere Runden angewendet. So rundet 6-10 alle Beteiligten den gleichen Bedingungen, ohne wesentliche Änderung der Anreicherung (Tabelle 1). Wenn dies über mehrere Runden beobachtet, sind die Umstände, die zu streng, um die Anreicherung zu fördern, und der Forscher sollte Stringenz in die nächste Runde zu verringern. Zum Beispiel die Cortisol-Konzentration wurde von 35 um bis 100 um in den Runden 11 bis 13 erhöht, und die eluierte% von 2,5% im rund 10 bis 14,5% in Runde 12. Daher erhöht% eluierten als Führung zur Einstellung der zu dienen Stringenz im Verlauf einer Auswahl, wenn Similar Bedingungen von Runde zu Runde verglichen, und kann zusätzliche Informationen zu NGS zur Bestimmung einer Auswahl Endpunkt liefern.

Sequenz 15-1 wurde auf eine AuNP Assay angewendet, um zu bestimmen, ob eine Sequenz in der Weise ausgewählt werden, um eine Struktur zu erzeugen vermittelnden Aptamer würde in einem Assay, der auf einem Strukturwandel folgenden Zielbindungs ​​um eine Antwort zu erzeugen stützt funktionieren. Zurück anfänglichen Studien zeigten, dass die AuNP Assay mit 15-1 reagierten auf die Stress Biomarker Cortisol, aber nicht auf zwei andere Marker von Stress, Epinephrin und Norepinephrin oder Cholsäure, ein Marker für eine Lebererkrankung strukturell ähnlich Cortisol ^24. Die Antwort wurde in den normalen Bereich von freiem Cortisol in humanem Serum (~ 150-600 nM) ⁶ bestätigt werden, dass die für eine strukturelle Veränderung auf Cortisol Bindung ausgewählt Aptamer erzeugt eine Reaktion im AuNP Test berichtet beobachtet. In dieser aktuellen Arbeit, Charakterisierung des Systems einen Schritt weiter, indem genommendie Abdeckung (Dichte) von 15-1 auf der AuNP Oberfläche. Mit dem gleichen Satz von Bedingungen wurde die DNA Abdeckung von 73 D / NP (DNA Moleküle / AuNP) erhöht wird, bis 120 D / NP und 200 D / NP (3). Cholsäure erzeugt eine minimale Reaktion, mit der Ausnahme von 10 & mgr; M bei 200 D / NP. Die Reaktion des Assay als Abdeckung abgenommen wurde erhöht ebenso die Nachweisgrenzen (LOD). Die Nachweisgrenze betrug 29,5 nM für 73 D / NP, 145,2 nM für 120 D / NP und 27,3 & mgr; M 200 D / NP. Dieses Ergebnis stimmt mit der Arbeit von Smith et al., Die veranschaulicht, dass die Antwort einer AuNP Assay, das Kokain Aptamer vermindert wird, wenn das Aptamer Deckung von 60 D / NP 300 D / NP ³⁶ erhöht. Dies bedeutet, dass der Erfassungsbereich für das Ziel von Interesse eingestellt beruhen auf der Optimierung der DNA-Flächendeckung in der AuNP Assay. Dies könnte nützlich sein beim Vergleich beispielsweise der Bereich der freien Cortisol in humanem Serum (~ 150-600 nM) gegen menschlichen Speichel (~ 5-25 nM) ^{6,37. Während physiologischen Flüssigkeiten sind weitaus komplexer als dieses Puffers Test werden die Ergebnisse stellen eine Erweiterung auf der Proof-of-Prinzip Arbeit demonstriert je nach Anwendungsfall, dass AuNP Bedingungen angepasst werden können, und dass die Vorbereitung auf die Erweiterung der mittleren bis biologischen Flüssigkeiten wäre von Interesse für die Biosensor-Community.}

Abbildung 1. Übersicht über Struktur-Schaltauswahlmethode ist. Ein kleiner biotinylierter cDNA Einfangsonde auf mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen immobilisiert. Die cDNA ist komplementär zu der 5'-Region der Bibliothek, Hybridisierung der Bibliothek an die Kügelchen. Als Ziel zugegeben wird eine Konformationsänderung induziert, um Bindungssequenzen von dem Wulst freizugeben, damit Partitionierung indem ein Magnet erleichtert. Der Überstand wird zurückgehalten, um die Anreicherung zu überwachen (% DNA durch th eluiertE Soll) durch UV nach Dialyse des Ziels von der DNA. Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn das Zielmolekül absorbiert im gleichen UV-Bereich, wie DNA. Sequenzen werden dann PCR amplifiziert und bereit für den nächsten Selektionsrunde. Da die Auswahl fortschreitet, wird die negative Selektion angewendet, wo Sequenzen, die durch den negativen Selektionsmolekül eluiert werden verworfen, und die Kügelchen mit potentiellen Ziel Bindemittel werden dann mit Soll inkubiert. Die Länge der cDNA-Sonde wird nach maximaler Anreicherung (% eluiert wurde), um die Stringenz der Selektion zu erhöhen erhöht. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von ²⁴ abgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Runde	[Cortisol] (um)	[Progesteron] (um)	Gebundene DNA (pmol)	% Von Target Eluierte	cDNA-Länge
1	100	0	357,57	N / A	7-mer
2	50	0	145,49	1.4	7-mer
3	50	1	188,74	N / A	7-mer
4	50	5	336,4	2.3	7-mer
5	35	5	88,05	N / A	7-mer
6	35	10	303,89	3.1	7-mer
7	35	10	255,01	N / A	7-mer
8	35	10	236,81	2.1	7-mer
9	35	10	318,95	2.6	7-mer
10	35	10	297,18	2.5	7-mer
11	100	10	147,61	N / A	7-mer
12	100	10	154,36	14,5	7-mer
13	100	10	150,39	15,3	7-mer
14	75	20	247,71	11.1	8-mer
15	50	40	409,63	3.3	9-mer

Tabelle 1. Auswahl Progression und Bereicherung durch Elution% ²⁴ < strong>. N / A (nicht zutreffend) für Runden, wo Dialyse / UV Bereicherung Überwachung wurde in der frühen Auswahlrunden durchgeführt, um den Verlust von Sequenzen niedriger Kopienzahl zu verringern wiesen. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von ²⁴ abgedruckt.

Abbildung 2. Auswahl Anreicherung von Next-Generation-Sequenzierung bestimmt (A) Runde. 6; (B) Rund 13; (C) Rund 15 Sequenzen wurden gemäß Nummer kopieren Platz. Die höchste Kopienzahl-Sequenz stieg von bilden einen geringen Anteil an der gesamten sequenzierten Pool in Runde 6 (0,1%) zu einem hohen Prozentsatz in Runde 15 (44,9%) als der Pool war für Cortisol Bindungssequenzen angereichert. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von ²⁴ abgedruckt.et = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 3. AuNP Assay Antwort von unterschiedlicher Aptamer 15-1 Abdeckung. Die Dichte des Aptamer mit der AuNPs inkubiert wurde von 73 D / NP (rotes Dreieck) erhöht, bis 120 D / NP (grünes Quadrat) und 200 D / NP ( blauer Kreis). Cortisol Antworten sind kräftige Farben, ist Cholsäure Reaktion in hellen Farben. Der Test-Antwort für Cortisol bei niedrigeren Dichten verbessert und damit eine Senkung der Nachweisgrenze und den Bereich der Ziel innerhalb festgestellt werden. Die Bedingungen, mit der höchsten Cortisol (73 D / NP) wurden weiter in dem linearen Bereich, um mehr Punkte in der erwarteten normalen Bereich von freiem Cortisol in Humanserum (~ 150-500 nM) und Speichel, zur Verfügung zu 5-25 gekennzeichnet (nM ) ^6,37. Die minimale Reaktion der Cholsäure nach den gleichen 73 D / NP Bedingungen hat seinen in früheren Arbeiten ²⁴ beschrieben. Alle Grundstücke stellen den Mittelwert ± SEM für Doppel- oder Dreifachmessungen.

. Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse von PCR-Zyklus Optimierung von links nach rechts stellen die Brunnen: 4 Zyklen, 6 Zyklen, 8 Zyklen, 10 Zyklen, 12 Zyklen, negativ (keine DNA-Template), 25 bp DNA-Leiter-Standard. Optimale Bedingungen sind bei 8 Zyklen, in dem die einzelnen Produkt-Band ist mit hoher Intensität ohne Überverstärkung bei höheren Zyklen präsentieren Produkte beobachtet.

Abbildung 5. AuNP Assay Inkubationszeit Optimierung. Die Inkubationszeit der AuNP / DNA Schritt bei 73 D / NP wurde aus O reduziert / N (3) bis 30 min, und die Ziel incuBewährung wurde sofort durch Salzzugabe, anstatt nach 20 min (3) folgt. (A) wird eine Antwort für Cortisol (blaue Rauten) beobachtet, aber nicht für Cholsäure (grüne Kreise) oder 2MNP (2-methoxynaphthalin; rote Quadrate). Alle Grundstücke stellen den Mittelwert ± SEM für Doppel- oder Dreifachmessungen. (B) Von links nach rechts: blank, 10 uM Cortisol, 10 uM Cholsäure, 10 uM 2MNP. Sichtwechsel kann mit dem bloßen Auge zu Cortisol beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

Die Tatsache, dass kleine Moleküle von biologischem Interesse, aber nur dann als 19% aller gemeldeten Aptamere macht Methoden zur Auswahl von Aptameren, die für kleine Moleküle, von großer Bedeutung sind, konzipiert. SELEX kleiner Moleküle ist eine besondere Herausforderung, da weniger funktionellen Gruppen Strukturmotive, und die Oberfläche sind für eine Wechselwirkung mit Sequenzen verglichen, um Proteine ​​zu ¹ zur Verfügung, und es wurde geschätzt, dass weniger als 30% der Auswahl für alle Ziele, die versucht haben in ein Aptamer resultierte ^38. Deshalb muss man außerordentlich bewusst experimentellen Entwurf und Ausführung, um ein Aptamer an ein kleines Molekül Ziel erfolgreich zu wählen.

Die in dieser Arbeit beschriebenen Aptamerselektion Verfahren ist vorteilhaft, weil es die für kleine Moleküle, ohne chemische Modifikation, die ihre Bindungseigenschaften zu verändern kann zu erfordern. Es ist auch Elution basiert, die die seit t bedeuteter DNA, und nicht die Ziel wird zunächst gebunden dann von den magnetischen Kügelchen durch die Ziel eluierte DNA in Wechselwirkung mit dem Wulst Matrix wird nicht für die nächste Selektionsrunde amplifiziert werden, da Bindemittel an das Molekül von Interesse sind, in den Überstand freigesetzt Puffer und unspezifische Matrixbindemittel gebunden bleiben. Umgekehrt wird ein negativer Selektionsverfahren gegen die Matrix für Verfahren, die das Ziel in jeder Runde Immobilisierung an den festen Träger durch DNA, die mit der Matrix wechselwirkt wird zusätzlich zu den Ziel Bindemittel ¹ verstärkt werden benötigt. Die aktuelle Methode wurde als T _m begrenzte Auswahl Strategie. Dies bedeutet, dass die T _m des cDNA / Pool-Hybridisierung wurde nahe RT gehalten. Morse verwendet eine ähnliche Strategie, aber angewendet eines 6-mer-cDNA-Sonde mit einer T _m <10 ° C mit Auswahlbedingungen bei 4 ° C ^17. Unsere Anwendung für ein Biosensor-Assay bei RT durchgeführt, so dass die Länge der cDNA wurde entsprechend eingestelltly. Dies hält die Stringenz der Selektion niedrig genug, so dass potentielle Bindemittel nicht verloren gehen, weil die Zielbindungsinteraktion in einem entfernten Ort, die eine Konformationsänderung in der Lage zu stören cDNA Bindung hervorruft auftritt. Jedoch ist die Partitionierung Effizienz des vorgeschlagenen Verfahrens gering, da einige Sequenzen werden ausschließlich auf Thermodynamik basiert dehybridisieren. Im Gegensatz dazu Nuţiu et al. Angewendet einen 15-mer cDNA, und konnten nur Aptamere für zwei der vier Ziele zu identifizieren, möglicherweise, weil die T _m des 15-mer war zu hoch, um eine Freigabe durch ein kleines Molekül Ziel ermöglichen ^18. Daher wird, während die aktuelle Auswahlstrategie wird viele Runden, um Hintergrund-Sequenzen zu entfernen, durch die Steuerung der Stringenz der Selektion und der Minimierung der Verluste von möglichen Bindemitteln die Erfolgswahrscheinlichkeit erhöht.

Viele Forscher neu Aptamerselektion nicht bewusst sind wichtige Aspekte in die PCR der ZusammenhangPotenzial Bindemitteln. Zyklusoptimierung (Abschnitt 4.5) erforderlich ist, weil im Laufe der Amplifikation von DNA-Bibliotheken erzeugt unerwünschte Nebenprodukte (typischerweise in der Größe größer) bei hohen Taktzahlen, und das gewünschte Produkt kann vollständig mit einem Überschuß von nur 5 Zyklen ³⁹ verschwinden. Im Falle der Überverstärkung, die PCR-Produkte nicht mehr die Sequenzen durch die Ziel eluiert repräsentieren, und die Chancen zur Wahl Erfolg deutlich vermindert. 4 zeigt ein Beispiel der Zyklusoptimierung von Runde 5 in dieser Arbeit. Die niedrigste Zyklus erzeugt eine minimale Produkt Band, die Band Steigerungen Menge über 8 Zyklen; bei 10 Zyklen die Band beginnt ein Übergang zu einer höheren Größe über Amplifikationsprodukt und wird fast vollständig aus dem Über amplifizierte Produkt innerhalb von 12 Zyklen besteht. Ein weiteres Detail, dass viele Forscher unerfahren in SELEX kann übersehen ist, dass der gesamte Pool muss im großen Maßstab die PCR-Amplifikation amplifiziert werden (Abschnitt 4.6) in der Tannest rund um den Verlust von Bindemittel zu mildern. Die Anzahl der einzelnen Sequenzen aus Oligonukleotiden möglich ist 4 ^{N ist,} wobei 4 die vier Nukleinsäurebasen, und N ist die Anzahl der Basen in der Zufallsregion der Bibliothek. Für diese Arbeit, N = 40, was zu einer Sequenzen Raum von 1,2 x 10 ²⁴ mögliche einzigartige Sequenzen. Der 2,5 nmol Bibliothek in der ersten Runde der Selektion verwendet wird, entspricht ~ 10 ¹⁵ Molekülen, so dass jede Kopie der DNA wahrscheinlich in der Anfangspool als eine einzigartige Sequenz dargestellt. Daher muß das gesamte Volumen der DNA aus den Kügelchen durch die Ziel eluiert amplifiziert werden, um eine Kopie von jedem potentiellen Bindemittel für die nächste Selektionsrunde zu erhalten. Sobald diese anfängliche Amplifikation stattgefunden hat, werden mehrere Kopien für die Selektion in den folgenden Runden, wo eine homogene Lösung zum Abtasten als verfügbar angenommen.

Die Konzentration der Ziel sollte auch sorgfältig in jeder Runde zu berücksichtigen. Nuţiu et al. Gebrauchda Konzentration von 1 mM Ziel während des Auswahlverfahrens sowie ausgewählte ATP-Aptamer mit K _d = 600 & mgr; M ^18. Sowohl die aktuelle Arbeit und die Erforschung von Morse ¹⁷ begann mit 100 uM Ziel, verringert im Laufe der Auswahl und führte zu Aptameren im niedrigen mikromolaren Bereich. Genau das, was rund um die Stringenz zu erhöhen (niedrigere Zielkonzentration) hängt, wenn die Anreicherung beobachtet. Ein weiterer wichtiger Schritt ist, um eine ordnungsgemäße negativen Selektionsschritte gelten so Aptamere zeigen Spezifität für das Zielmolekül. Welche Kontrollen verwendet werden ist abhängig von der beabsichtigten Anwendung des ausgewählten Aptamer. Zum Beispiel wurde Aptamer 15-1 ausgebildet, um als Erkennungselement in einer Biosensor-Assay für Cortisol funktionieren, so Progesteron wurde als negative Selektionsmolekül verwendet, da es ein metabolischer Vorläufer von Cortisol, die in physiologischen Flüssigkeiten ⁴⁰ zu finden ist. Das ATP-Aptamer durch Nuţiu et al gewählt. </ Em> nicht enthalten einen negativen Selektionsschritt, und interagiert mit strukturell ähnliche Moleküle wie ADP, AMP, Adenosin und dATP ^18.

Eine letzte Bemerkung zur Prüfung ist, dass die AuNP Assay erfordert häufig erhebliche Optimierung für jedes Aptamer / Ziel-Paar. Auf der Suche nach dem Volumen von Salz, das eine kaum visuell wahrnehmbare Veränderung in Richtung eines blauen Farbton nach Salzzugabe induziert ist ein guter Ausgangspunkt, aber Anpassung der Ausgangspunkt erforderlich sein, um eine Antwort zu beobachten. Wir haben auch gefunden, daß der Assay erzeugt drastisch unterschiedliche Reaktionen in Abhängigkeit von der Konzentration des Puffers (der Auswahlpuffer verdünnt werden, da die hohe Salzkonzentration von Puffern verursacht oft Aggregation) und der Zusammensetzung, den Grad der DNA-Abdeckung (3), die Probenvorbereitung (einige organischen Lösemittel verwendet, um die Ziel auflösen kann einen hohen Hintergrund, die Masken Zielantwort), Temperatur, Salztyp und die Konzentration und Incuba verursachenrungszeit (sowohl DNA mit AuNP und DNA / AuNP mit Ziel). Unter vollständig optimierten Bedingungen werden typischerweise mit einem Ziel Inkubationszeit <5 min beobachtet, was die Vorteile einer schnellen Zielansprechen des AuNP Biosensor Plattform. Zum Beispiel ist in Abbildung 5 die Inkubationszeit des Aptamers / AuNP Schritt wurde aus O / N (3) auf 30 min reduziert, und das Salz wurde sofort (<10 sec) nach Zugabe des Targets statt 20 min später (Figur 3 hinzugefügt ) bei einer Ladedichte von 73 D / NP. Dies erhöhte die Cortisol Reaktion auf ~ 82% höher als jene des Rohlings (5A) bei 10 uM Zielkonzentration gegen die ~ 40% unter Verwendung der obigen Bedingungen (Abbildung 3). Diese Antwort kann ausgezeichnet mit dem bloßen Auge (5B) sein. Man beachte, dass der lineare Bereich Cortisol Detektion unterscheidet unter Verwendung der obigen Bedingungen, was darauf hindeutet, dass diese Bedingungen für eine gewünschte optimiertErfassungsbereich. Cholsäure und 2-methoxynaphthalin (2MNP) Kontrollen keine signifikante Reaktion (5A-B) zu produzieren. Die Forscher müssen sich bewusst sein, dass die Reduzierung dieser Inkubationszeiten erhöhte Reaktion des Analyten mit dem AuNP Oberfläche, was zu einer Gesamt verbesserte Signal (Ziel) oder im Hintergrund (Nicht-Zielmoleküle) beitragen können, zu erleichtern. Daher ist eine sorgfältige AuNP Assay Design und Leistung Charakterisierung für jedes Aptamer / Zielpaar erforderlich.

In diesem Verfahren wird ein Protokoll zur Auswahl von kleinen Molekülstruktur vermittelnden Aptamere, in einem Biosensor-Plattform funktionieren, wie die beschriebene AuNP Assay, der eine Konformationsänderung der DNA auf das Vorhandensein von Ziel zu erfassen erforderlich. Jedoch könnte dieses Verfahren auch für andere Biosensorsystemen wie elektrochemische oder Fluoreszenz, die auf der gleichen Voraussetzung für nahezu beliebig großen Zielfunktion angewendet werden. Die Macht des Protokolls weiter experimentell entwickelt werdenmehrere Ansätze. Erstens kann die Auswahl selbst möglicherweise durch Untersuchung Optimierungsverfahren, wie die Bestimmung der idealen T _m des cDNA / library Hybridisierung, die eine Interaktion, die schwach genug ist, um mit einem kleinen Molekül Ziel interagieren, aber stark genug, um den Betrag zu reduzieren, ist bietet verbessern Hintergrundsequenzen dehybridisiert ausschließlich aus der Thermodynamik. Dadurch wird die Anzahl der Zyklen für die Auswahl erforderlich kondensieren, das spart Zeit in der Arbeit und die Verringerung der Reagenzienverbrauch. Weitere Untersuchungen Modifikationen der Auswahl wäre, die günstigste Konzentration von Perlen und DNA zu bestimmen, so dass eine heterogene Population von Sequenzen an die Ziel-insbesondere in der ersten Runde, ausgesetzt. Der Erfolg dieser Proof-of-principle Experimente bieten eine Grundlage, um weitere Ressourcen zur Optimierung und Anpassung der AuNP Puffer Assay zur physiologischen Flüssigkeiten zu investieren. Es ist ein legitimes Bedürfnis nach einem schnellen, robusten Plattform Biosensorik dass funktion als Diagnosewerkzeug des physiologischen Zustands eines Individuums, und die weitere Entwicklung des AuNP Test im menschlichen Serum, würde Schweiß oder Speichel eine diese Stromlücke zu erfüllen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads M280 Streptavidin	Invitrogen	112.06D	Kompatibel mit DynaMag-2 Magnet
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D	Kompatibel mit Dynabeads M280 Streptavidin
Streptavidin Sepharose High Performance	GE Healthcare	17-5113-01	Dies ist ein Streptavidin Produkt mit hoher Dichte für die ssDNA-Präparation
Hydrocortison	Sigma	H4001	≥ 98%
Progesteron	Sigma	P0130	&ge≥ 99%
Cholsäure	Sigma	C1129	≥ 98%
NanoDrop ND-1000	NanoDrop	ND-1000	Ersetzt durch ND-2000 Modell
Tris Base	Promega	H5135	&ge≥ 99,9%
Natriumchlorid	Sigma	S9888	≥ 99,5%
Magnesiumchlorid Hexahydrat	Fluka	63068	≥ 98%
500 ml Filtersystem	Corning	430769	0,22 &Mikro; m Celluloseacetat-Membran
DNA-Bibliothek	Operon	Custom	HPLC aufgereinigt
Alle anderen DNA	IDT	Custom	Capture Sonden und Primer — entsalzt; entsalzt; Aptamere —
HPLC-Thermomischer	Eppendorf	R	Jedes Modell mit Temperatur- und Mischgeschwindigkeitsregelung funktioniert
PfuUltra II Fusion HotStart DNA-Polymerase, 400 rxn	Agilent	600674	Taq-Polymerase kann ebenso verwendet werden
Desoxynukleotid-Mix, PCR-Grade	Agilent	Andere Marken funktionieren hier
10x Klonierter Pfu-DNA-Polymerase-Puffer	Agilent	200532	Dieser Puffer wurde optimiert für PfuUltra II-Polymerase
GeneAmp PCR-System	Applied Biosystems	9700	Jedes Modell, das es Forschern ermöglicht, den Deckel zur Zyklusoptimierung zu öffnen, funktioniert
Agarose-LE	Ambion	AM9040	≥ 99,9%
Ethidiumbromid	Sigma	E-1510	Akute Toxizität, Inhalation; Verdacht auf Karzinogen
Leere Synthesesäulen, 1 & Mikro; m Expedite Style	Glen Research	20-0021-01	Dieses Modell ist aufgrund der Luer-Lok-Armatur ideal zum Koppeln mit Spritzenersatzfiltern
Expedite	Glen Research	20-0021-0F	1 & micro; m Größe
Illustra NAP-25 Säulen	GE Healthcare	17-0852-01	Jede Marke mit Harz-Gel-Filtrationssäule in DNA-Qualität funktioniert
Slide-A-Lyzer Dialysekassette	ThermoFisher Scientific	66205	2k MWCO
verwendetes Gold(III)-chloridhydrat	Sigma	254169	99,999% Reinheit ist wichtig
Natriumcitrat-Dihydrat	SAFC	W302600	Wir haben festgestellt, dass die von verschiedenen Herstellern hergestellte Verbindung die AuNP-Assays stark beeinflusst
. SpectraMax	Molecular Devices	M5	Ergebnisse waren ähnlich wie bei Bio-TEK System
Synergy	Bio-TEK	HT	Ergebnisse waren ähnlich wie bei Molecular Devices System
HEPES Buffer	Amresco	J848	Jede Marke, die ein sterilisiertes Produkt herstellt, funktioniert
250 ml Filter System	Corning	430767	0,22 µ m Celluloseacetat-Membran
UV-Spektralphotometer	Varian	Cary 300	Andere Marken werden hier arbeiten
5 ml Spritze	Becton-Dickinson	309646	Dieses Modell ist ideal aufgrund der Luer-Lok-Armatur zum Koppeln mit der Expedite-Säule
ThermoEC Minicell Primo	ThermoFisher Scientific	EC320	Kompatibel mit Netzteil
	Netzteil Fisher Scientific	FB300	Kompatibel mit ThermoEC Minicell Primo
Dimethylsulfoxid	Sigma	D8418	Entflammbar flüssiges
2-Methoxynaphthalin	Sigma	148245	99
Assay-Platte	Corning	3370	96-Well, flacher Boden, steril