Die Maus Femoralarterie Drahtverletzungsmodell der Restenose ist technisch anspruchsvoll. In diesem Protokoll zeigen wir die wichtigsten technischen Details unerlässlich für die erfolgreiche Durchführung von Draht Verletzung konsequente Neointima für Studien der Restenose zu induzieren.
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Methodenartikel
Ein Mausmodell von arterieller Restenose: Technische Aspekte der Femoral Draht Injury
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kardiovaskuläre Erkrankungen durch Arteriosklerose ist die häufigste Todesursache in der entwickelten Welt. Einengung des Gefäßlumens, aufgrund atherosklerotischen Plaque Entwicklung oder dem Aufbrechen der etablierten Plaques, unterbricht den normalen Blutfluss führt zu verschiedenen Begleiterkrankungen wie Herzinfarkt und Schlaganfall. In der Klinik endovaskulären Verfahren wie Angioplastie werden üblicherweise durchgeführt, um den Hohlraum wieder zu öffnen. Jedoch haben diese Behandlungen unvermeidbar beschädigt die Gefßwand sowie die Gefäßendothel Auslösen eines übermäßigen Heilungsreaktion und die Entwicklung einer neointimalen Plaque, die in das Lumen verursacht Gefäß Restenose (Wiederverengung) erstreckt. Restenose bleibt eine Hauptursache für Versagen endovaskulären Behandlungen für Atherosklerose. Somit sind vorklinischen Tiermodellen von Restenose für die Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen sowie Translationsansätze Gefäßinterventionen von entscheidender Bedeutung. Unter mehreren murinen Experimental Modellen wird Femoralarterie Drahtverletzung gilt als die am besten geeignete für die Untersuchung der Restenose nach Angioplastie akzeptiert, weil es ähnelt der Angioplastie-Verfahren, die sowohl Endothel und Gefäßwand verletzt. , Haben viele Forscher jedoch Schwierigkeiten Verwendung dieses Modell aufgrund seiner hohen technischen Schwierigkeitsgrad. Dies ist vor allem, weil ein Metalldraht muss in die Oberschenkelarterie, die etwa dreimal geringer als die Draht eingeführt werden, um eine ausreichende Verletzungen erzeugen prominente Neointima induzieren. Hier beschreiben wir die wesentlichen chirurgischen Details, die wichtigsten technischen Schwierigkeiten dieses Modells effektiv zu überwinden. Indem Sie die vorgestellten Verfahren, die Durchführung der Maus Femoralarterie Drahtverletzung wird einfacher. Sobald vertraut, kann das gesamte Verfahren innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen werden.
Einleitung
In der Ära der erweiterten Anwendung endovaskulärer Behandlungen für verschiedene Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist die Restenose nach Angioplastie eines der Hauptprobleme für Patienten, die sich solchen Behandlungen unterziehen. Die Schädigung des Gefäßendothels zum Zeitpunkt der Angioplastie führt in Verbindung mit dem atherosklerotischen Hintergrund zu einer übermäßigen Proliferation der glatten Muskelzellen in der medialen Schicht, was zu einer neointimalen Hyperplasie führt. 1,2 Ein lebensfähiges Tiermodell, das die neointimale Hyperplasie nach der Angioplastie rekapituliert, ist daher nicht nur für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen wichtig, sondern auch für die Entwicklung wirksamer Therapeutika zur Behandlung dieser Pathologie.
Mäuse stellen aus folgenden Gründen ein hervorragendes Modelltier dar, um neointimale Hyperplasie zu rekapitulieren: Die genetischen Hintergründe von Versuchsmäusen sind gut etabliert; eine große Auswahl an genetisch veränderten Stämmen steht zur Verfügung; 2 Es ist einfach, Wurfgeschwister mit dem gleichen Hintergrund zu bekommen; Und die Kosten für die Tiere sind relativ gering. Das arterielle Ligaturmodell und das Drahtverletzungsmodell sind die beiden häufigsten Mausmodelle der mechanisch induzierten neointimalen Hyperplasie. Das arterielle Ligaturmodell ist einfach zu erstellen, unterscheidet sich aber physiologisch von der eigentlichen Angioplastie. Das Drahtverletzungsmodell ahmt tatsächliche Angioplastieverfahren weitgehend nach, ist aber aufgrund der geringen Größe der Mausarterien technisch schwierig. 2,3 Sata et al. beschrieben zunächst eine Drahtverletzungsmethode für Oberschenkelarterien von Mäusen, die auf der anatomischen Struktur des Gefäßsystems und der Verwendung von flexiblem Draht in geeigneter Größe basierte. Mit dieser Technik gelang es ihnen, bei verschiedenen Mäusestämmen reproduzierbar eine neointimale Hyperplasie zu induzieren. 4
Obwohl die Verletzung des Femurdrahtes ein gut etabliertes Modell ist, sind einige der technischen Aspekte der Technik im Vergleich zu anderen Modellen wie der Ligatur eine große Herausforderung. 5 Der Zweck dieses Artikels ist es, unsere Verfahren für Mausdraht-Verletzungsmodelle im Detail zu beschreiben, die eine modifizierte Version von Satas ursprünglicher Methode darstellen. Wir haben zwei Hauptmodifikationen vorgenommen: 1) Nur die Arterien werden geschlungen und 2) Es wird kein Lidocain verwendet.
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Protokoll
HINWEIS: Ethics Statement: Alle Verfahren entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press, 8. Auflage, 2011), und Protokolle von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der University of Wisconsin zugelassen. Alle Operationen wurden unter Isofluran-Narkose (durch Einatmen, Durchflussrate von 2 ml / min) durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren. Die Tiere wurden in einer Kammer allmählich mit CO 2 gefüllt euthanasiert.
1. Narkoseeinleitung und Hautschnitt
- Verwenden männlichen C57BL / 6-Mäuse mit einem Alter von 12-16 Wochen und das Gewicht 23-28 g. Anesthetize das Tier durch Isofluran über einen geschlossenen Kreisnarkosegerät. Überprüfen Sie die Betäubung durch Kneifen seine Zehen. Tragen Sie etwas künstliche Tränen Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern.
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage mit dem linken Hinterbein leicht verschleppt und Kniegelenk slightly gebeugt. Rasieren Sie die Haare um den linken Oberschenkel Region und desinfizieren Sie die Haut mit Chlorhexidin, angewendet dreimal mit sterilen Wattestäbchen Applikatoren. Verwenden Sie eine heiße Perle Sterilisator, die Instrumente während der Operation sterilisiert zu halten.
- Legen Sie eine sterilisierte Gaze Tuch über das linke Bein. Einen 1,5 cm gerader Längs Hautinzision links medialen Oberschenkel vom Kniegelenk auf der Leiste (1A).
2. Exposition der Femoralarterie und Zweige
HINWEIS: 1B zeigt die Bruttogefäßanatomie in den Oberschenkel. Die oberflächliche Oberschenkelarterie (SFA) können durch ein Präpariermikroskop beobachtet, wenn die Inzision richtig entlang der Mittellinie des medialen Oberschenkel vorgenommen werden.
- Öffnen Sie die dünne Faszie über dem SFA mit feinen Pinzette und dann die Schleife die SFA mit 9-0 Nylonnaht.
HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird der N. femoralis ist einfach wie setzenide, aber die angrenzenden femoralis erfordert besondere Aufmerksamkeit, weil ihre Wand ist so dünn, dass es leicht perforiert und blutet. Der Schlüssel Technik ist es, auf die Arterie selbst zu konzentrieren; solange der Präparation wird in der Nähe der Arterie durchgeführt wird, ist jede versehentliche Venenschäden vermeidbar. - Sobald die SFA geschlungen, halten Sie die Naht mit Moskito Pinzette und ziehen Sie sie leicht nach unten. Dieses Manöver macht weitere Präparation leichter, aber um eine Beschädigung der Arterie nicht zu kräftig ziehen.
- Weiter sezieren die Arterie proximal zu entlarven und Schleife die A. femoralis communis (CFA) mit 9-0 Nylonnaht.
HINWEIS: Normalerweise Schleifen des CFA an einem Punkt distal der A. epigastrica (1B) ist ausreichend für Drahteinführung. Halten Sie die CFA Fadenschleife mit Moskito Pinzette auf die gleiche Weise. - Ziehen Sie den CFA Fadenschleife nach oben und der SFA Fadenschleife nach unten, um die Gabelung der SFA und tiefe Oberschenkelarterie (EDA) zu entdecken. Das EDA, der Hauptzweig der CFA,fließt in den Oberschenkelmuskel (1B).
HINWEIS: Der Draht wird später von der DFA eingefügt werden. - Schleife das EDA mit besonderer Vorsicht, da die angrenzenden Vene unter der Arterie verheddert. Im Falle von Blutungen aus der Vene ist ein 30- bis 60 sec einfache Kompression mit Gaze Regel ausreichend, um die Hämostase zu erzeugen.
- Sobald der DFA mit 9-0 Nylonnaht geschleift, sicherzustellen, dass alle drei Nahtschleifen sind an die richtige Position (Abbildung 2A).
- Fahren Sie mit der Dissektion der DFA distal, um die Arterie an einer Stelle so weit wie möglich von der Gabelung zu ligieren. Geschnitten zusätzliche Naht lassen aber eine bestimmte Länge, so dass die beiden Enden mit Moskito Pinzette, die die Herstellung von DFA Drahteinsetzlöcher leichter Stabilisierung statt.
3. Erstellen von Draht Injury
- Legen Draht über DFA
- Belastung der CFA, SFA und DFA Nähten, um eine temporäre hemostat etablieren.
- Machen Sie ein kleines Loch in der DFEin mit Mikroschere. Stecken Sie die Spitzen der gebogenen Mikropinzetten, um das Loch groß genug für einen Draht mit einem 0,015 Zoll Durchmesser erweitern (2B zeigt den Größenunterschied zwischen der Arterie und dem Draht).
- Bevor Sie ein Loch in der DFA, lösen Sie die CFA Fadenschleife und sanft klemmen / Drücken Sie die DFA mehrmals mit stumpfen bestückte Mikropinzetten. Dieses Manöver erweitert die arteriellen Durchmesser bemerkenswert, um die Drahteinführung zu erleichtern. Befeuchten Sie den Draht sorgfältig mit PBS ist auch wichtig für eine reibungslose Einsetzen.
- Wenn ein Loch in der DFA, nicht beschneiden die Arterienwand, aber einen kleinen V-förmigen Spalt und nehmen Sie die Klappe mit spitzen Mikropinzetten für Manipulation.
- Führen Sie den Draht durch die angemessen-dilatative Loch auf der DFA. Den Draht vorsichtig voran in Richtung der Darmbeinarterie, während das Lösen der Fadenschleife um das CFA. 5-8 mm reicht aus, um alle CFA Länge in den meisten Fällen zu decken (2C ). Haben Sie das Kabel mit Gewalt einlegen nicht als ein arterieller Perforation führt in der Regel zum Verlust der Maus. Die Verkürzung der Draht bis ca. 15 mm in der Länge hilft bei der Handhabung.
- Lassen Draht innen für 1 Min
- Nach dem Einlegen der Kabel an die optimale Länge, lassen Sie es für 1 Minute, um die Arterienwand überfordern. Befeuchten Sie den Draht und Arterien mit PBS, um ein Austrocknen zu verhindern. Eine weitere 9-0 Nylonnaht können rund um die DFA proximal der Drahteinführungspunkt während dieser Wartezeit platziert werden. Dieser Faden wird später verwendet werden, um das Loch auf der DFA nach Entfernen des Drahtes zu schließen.
- Abrufen Draht und Fortsetzen der Durchblutung
- Halten Sie den Draht mit Schiff Kanülierung Pinzetten, und ziehen Sie sie vorsichtig zurück; der Draht sollte problemlos abgerufen werden. Keinen Widerstand, in der Regel durch die Einhaltung des Drahtes an der Arterienwand, zu überwinden, das Zurückziehen des Drahtes mit leichter Rotation hilfreich. Auch hier könnte eine kraftvolle Manöver in der Tierverlust führen.
- Aach das Abrufen der Draht, ligieren die DFA am Verzweigungspunkt mit 9-0 Nylonnaht. Ligieren Sie nicht zu nahe an der Gabelung, die den Blutabfluss an die SFA in Frage stellen würde.
- Lösen Sie die SFA und CFA Nahtschleifen, um den normalen Blutfluss wieder aufzunehmen. Beachten Sie, dass die CFA wird durch Drahteinführung (2D) gut ausgebaut.
4. Hautverschluss und postoperative Pflege
- Steuer blutet. Minor Nässen durch einfache Kompression gestoppt werden; einige große arterielle Blutungen wird Stiche mit einem 11-0 Nylonfaden erfordern. Diese vernäht Arterien schließlich in Arterienverschluss führen.
- Schließen Sie die Haut mit Hautklammergeräte (in der Regel 3-4 Heftklammern) gewickelt. Halten Sie die Wundfläche durch Anwendung Chlorhexidin chirurgische Lösung sterilisiert.
- Bewerben postoperative Behandlungen. Steuern Sie den Schmerz der Maus mit subkutanen Injektionen von Buprenorphin. Halten Sie die Maus auf die Erwärmung pad bis sie suf wiederreichend Bewusstsein Brustlage zu halten. Haus in einem sauberen Käfig ohne Begleitung anderer Tiere, bis sie vollständig erholt.
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Ergebnisse
Vier Wochen nach der Operation, zu ernten die Draht verletzten Oberschenkelarterie und machen einen Paraffinblock Probe, um die Neointimabildung analysieren. Induzieren Narkose wie oben beschrieben. Sofort Öffnen Sie die Kiste und legen Sie eine 20-Gauge-Butterfly-Nadel in die linke Herzkammer. Schließen Sie die Leitung an einer Infusionsflasche. Führen Perfusionsfixierung über Tropfinfusion von PBS, gefolgt von 4% Paraformaldehyd (in der Regel 10 bis 20 ml, jeweils). Die Infusionsflasche wird ca. 140 cm höher ...
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Diskussion
Der Draht Verletzungsverfahren ist für alle Stämme von Mäusen, solange ihre anatomischen Strukturen sind ähnlich. 4 In diesem Dokument verwendet man männliche C57BL / 6-Mäuse mit einem Alter von 12-16 Wochen. Wie wir von unseren Vorstudien gelernt, sind die Oberschenkelarterien von Mäusen, die jünger als 10 Wochen oft so klein, dass Drahteinführung ist eine ziemliche Herausforderung. Andererseits ist Drahteinsetzlöcher in Mäusen, die älter als 16 Wochen technisch einfacher, aber neigt dazu, in variabler neoin...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Wisconsin Partnership Program New Investigator Award (ID 2832), einen National Heart, Lung, Blood Institute R01 Grant (HL-068673) und einen T32 Training Grant (HL-110853) unterstützt. Wir danken der Gruppe von Dr. Melina Kibbe an der Northwestern University für die hilfreichen Informationen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Durchmesser 0,015 Zoll, gerade |
| Dilatationszange | Roboz | RS-4927 | Gebogene, stumpfe Spitzen |
| Dumont Pinzette # | World Precision Instruments | 14095 | Gerade, scharfe Spitzen |
| Dumont Gefäßkanülenzange | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Schere | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mückenzange | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Naht 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Schwarz Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, steril 11-0, 70 Mikrometer, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Schwarz Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Einweghaut Hefter | 3M | DS-25 |
Referenzen
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- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
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Nachdrucke und Genehmigungen
