Methodenartikel

Design, Oberflächenbehandlung, Cellular-Überzug und Kultivierung von Modular Neuronale Netze Bestehend aus Funktionell mit Inter-Schaltungen

DOI:

10.3791/52572

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15. April 2015

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1Department of Neurobiology, George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel-Aviv University, 2Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 3School of Electrical Engineering, Tel-Aviv University, 4School of Physics and Astronomy, Tel-Aviv University, 5Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering, University of Genova

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll, um in vitro modulare Netzwerke aus räumlich beschränkt, funktionell miteinander verbundenen neuronalen wachsen. Eine Polymermaske zum Strukturieren einer Proteinschicht verwendet, um die zelluläre Adhäsion über die Kultivierungssubstrat zu fördern. Vernickelt Neuronen wachsen auf beschichteten Bereiche Gründung spontane Verbindungen und elektrophysiologische Aktivität zeigen.

Zusammenfassung

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Das Gehirn funktioniert durch die koordinierte Aktivierung und der dynamischen Kommunikation von Neuronenverbände. Eine wichtige offene Frage ist, wie ein riesiges Repertoire an dynamische Motive, die die verschiedensten Funktionen des Gehirns zugrunde liegen, kann aus einem festen topologischen und modulare Organisation des Gehirns Schaltungen entstehen. Im Vergleich zu in-vivo-Studien der neuronalen Schaltkreise, die intrinsische experimentellen Schwierigkeiten bereitet, bieten in vitro Präparate eine viel größere Möglichkeit zur Manipulation und Sonde die strukturelle, dynamische und chemische Eigenschaften von experimentellen neuronalen Systemen. In dieser Arbeit wird ein in vitro experimentellen Methodik, die den Anbau von modularen Netzwerke von räumlich getrennten, funktionell miteinander verbundenen Neuronenverbände zusammensetzt ermöglicht. Das Protokoll ermöglicht die Steuerung der zweidimensionalen (2D) Architektur des neuronalen Netzwerks auf verschiedenen Ebenen der topologische Komplexität.

Eine gewünschte Netzwerk Strukturieren kannsowohl auf den regulären Deckgläser und Substrat eingebettet Mikroelektrodenarrays erreicht. Mikrobearbeiteten Strukturen werden auf einem Siliziumwafer geprägt und verwendet, um biokompatiblen polymeren Matrizen, die die negativen Eigenschaften der gewünschten Netzarchitektur einzubeziehen erstellen. Die Schablonen werden an die Kultivierungssubstraten während des Oberflächenbeschichtungsverfahren mit einer Molekülschicht zur Förderung der Zelladhäsion platziert. Nach dem Entfernen der Schablonen werden Neuronen plattiert und sie spontan auf den beschichteten Bereichen umgeleitet. Durch Verringern des Zwischenraums entfernt, ist es möglich, entweder isoliert oder miteinander verbundenen neuronalen erhalten. Überleben der Zelle zu fördern, sind Zellen co-kultiviert mit einem Stütz neuronalen Netzwerk, das an der Peripherie der Kulturschale angeordnet ist. Elektrophysiologischen und optischen Aufnahmen der Aktivität von modularen Netze jeweils unter Verwendung Substrat eingebettet Mikroelektrodenarrays und Calcium-Bildgebung erhalten werden vorgestellt. Während jedes Modul zeigt spontaneous globalen Synchronisierung, wird das Auftreten von Zwischenmodul-Synchronisation durch die Dichte der Verbindung zwischen den Schaltungen geregelt.

Einleitung

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Experimentelle und theoretische Beweise unterstützen die Möglichkeit, dass das Gehirn arbeitet durch koordinierte Aktivierung von Zellenanordnungen 1-5, die als dynamische Funktionseinheiten, die vorübergehend miteinander, Formgebung und darunterliegende verschiedene Gehirnzustände in Wechselwirkung angesehen werden kann. Funktionale Modularität ist auch abhängig von und mit der strukturellen modulare Organisation des Gehirns Schaltungen 6,7 verbunden. Wie Funktion und Struktur des Gehirns Schaltungen gegenseitig prägen immer noch eine der wichtigsten offenen Fragen in den Neurowissenschaften. Um ein tieferes Verständnis für diese Frage, ist es wichtig, um eine optimale Versuchs Rahmenbedingungen zu identifizieren, wo es möglich ist, anzugehen, zumindest teilweise, diese Probleme. Da gesteuerte Manipulation der raumzeitlichen Dynamik neuronaler Netzwerke in in vivo Experimenten ist eine Herausforderung, die Entwicklung von in vitro Modellen neuronaler Netzwerke von großem Interesse wegen ihrer einfachen accessibility, Überwachung, Manipulation und Modellierung 8,9. In den letzten Jahren, in von fortgeschrittenen Substratstrukturierungsmethoden unterstützt vitro Technologien erlaubt neuronaler Netze zu veranlassen, eine Reihe von vordefinierten modularen Strukturen 3 zu entwickeln und die funktionellen Eigenschaften von Netzen mit auferlegt Topologien 10 zu studieren. Insbesondere wurden Verfahren vor kurzem verwendet, um Netzwerke von imposanten physischen Beschränkungen 4,11 organisieren. In der Tat, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion der neuronalen Netze zu untersuchen und eine vereinfachte, aber plausible Darstellung der Interaktion Neuronenverbände bieten, sollten in vitro-Systeme miteinander verbundenen neuronalen Subpopulationen werden. Weitgehend untersucht 2D homogene neuronalen Kulturen keine räumliche Zwänge auferlegen selbstorganisierten emergent Verdrahtung der Schaltkreise. Daher wird ein möglicher Ansatz, um künstlich miteinander verbundenen Zellverbände zu gestalten ist, um verschiedene neuronale Populationen in spuckte positionierenmathematisch verschiedene Bereiche. Der Abstand zwischen diesen Bereichen verhindert nicht, dass die inter-Baugruppen-Verbindungen. Dieser Ansatz, der gleichzeitig ein beträchtliche Kontrolle über die Netzwerkkomplexität, wurde gezeigt, dass eine reichere Repertoire Synchronisationsmodellen 6,7,12 bereitzustellen.

Um eine reproduzierbare Kultivierungs modularer Neuronenverbände zu erleichtern, ein Protokoll, die Selbstorganisation von Netzwerken in neuronale Cluster von Axonen und Dendriten verbunden zu montieren vorgestellt und beschrieben. Die Polymerstruktur zur physikalischen Begrenzung des neuronalen Kulturen aus polydimtheylsiloxane (PDMS) erstellt. PDMS ist ein Elastomer häufig für biomedizinische Anwendungen aufgrund ihrer Biokompatibilität, Transparenz und Durchlässigkeit für Gase 13 verwendet. Das PDMS wird durch Schleuderbeschichtung eine Flüssigkeit PDMS auf einen "Master", wie vorher in Jackman et al. 16 T vorbereitet und von der mikro SU8 ausgeschlossen 2075 14,15 StrukturenEr erreichte gemusterten neuronalen Netzwerke von miteinander verbundenen Modulen unterschiedlicher Größe zusammengesetzt ist, und diese erfolgreich auf beiden Deckgläser und Mikroelektrodenanordnungen (MEAs) 17-20 erhalten wurden. Die Dichte der Verbindungen zwischen den Modulen kann die Eigenschaften der Netzwerksynchronisation zwischen den Modulen zu ändern, von einem vollständig synchronisierten Netzwerks typischen einheitlichen Kulturen, um Übergangszustände von Synchronisation.

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Protokoll

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Das Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den NIH-Standards für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Universität Tel-Aviv Animal Care und Verwenden Committee (Zulassungsnummer - L-14-019) zugelassen.

1. Vorbereitung der Instrumente und PDMS

  1. Bereiten Sie die Wafer (Tabelle der Materialien, oder bestellen Sie die Wafer aus einem Mikrolabor), ein Skalpell und einer Pinzette - Sterilisation ist nicht erforderlich.
  2. Make Poly-D-Lysin (PDL) Lösung gemäß den folgenden Bedingungen: 4 mg / ml in 0,1 M Boratpuffer, pH 8, und bei -20 ° C.
  3. Bereiten PDMS Schablonen nach dem folgenden Verfahren:
    1. Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS, Silikonelastomer) durch Mischen der Basis und das Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10: 1, dann rühren die 2 Substanzen für ungefähr 5 min.
    2. Platzieren Sie in der Vakuumkammer zweimal für 15 Minuten jedes Mal, und überprüfen Sie Luftblasen verschwunden sind.
    3. Wanndie PDMS ist bereit, bereiten Spincoater: open Stickstoff Regler auf Gasverbrauch zu ermöglichen, legen Sie die Siliziumscheibe (1A) am Spinner, und verwenden Sie das Vakuum, um es mehr bewegen lässt.
    4. Gießen PDMS über Wafer und aktivieren Sie die spinner 1 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute (erzeugt etwa 100 & mgr; m Höhe).
    5. Platzieren Wafer auf einer heißen Platte bei 100 ° C für 30 min.
    6. Wenn der PDMS ausgehärtet ist, einen Überblick über die Schablone Grenzen mit PDMS, mit Pasteurpipette. Platzieren Wafer auf einer heißen Platte bei 100 ° C für 30 min.
    7. Wenn die PDMS-Grenzen ausgehärtet, mit einem Skalpell, um Schablonen nach den Grenzen geschnitten und ziehen Sie die Silizium-Schablone aus dem Wafer (ein Quadrat PDMS mit einem einzelnen Muster).

2. Petrischale und Deckglas Vorbereitung

  1. Bereiten Sie 23 mm Quadratglasplättchen und reinigen Sie diese nach der folgenden Reihenfolge:
    1. Mit destilliertem Wasser, 70% Ethanol und Aceton zu waschen.
    2. Mit Isopropanol und schnell mit Stickstoff trocken waschen.
  2. Zeigen gemusterten PDMS Schablonen auf Deckglas, und drücken Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass sie fest an der Glasoberfläche angebracht. Platzieren Sie in der Vakuumkammer für 15 Minuten.
  3. 1 ml der PDL auf Schablone. Legen Sie das Deckglas in die Vakuumkammer zweimal für jeweils 20 min, und lassen Sie PDL O / N, um zu trocknen.
  4. Bereiten Petrischale auf eine unterstützende Zellennetz zu erstellen:
    1. Decken Sie die Oberfläche der Schale (3,5 cm) mit 1 ml PDL für 2 Stunden in RT. Nehmen Sie die PDL-Tropfen mit einer Pipette.
    2. Waschen mit destilliertem Wasser und trocknen lassen. Legen Sie einen sehr kleinen Tropfen Silikonfett an jeder Ecke des Deckglases.
  5. Legen Sie das Deckglas auf die Mitte der Petrischale (dh die PDMS sollte nach oben) und drücken Sie vorsichtig, um die Befestigung zu überprüfen.
  6. Entfernen Sie vorsichtig PDMS von Deckglas mit einer Pinzette. Zur Sterilisation aussetzen UV-Beleuchtung für 7 min.
le "> 3. Multi-Elektroden-Array (MEA) Vorbereitung

  1. Saubere MEA in dieser Reihenfolge (Tabelle der Materialien):
    1. 3 Mal Waschen mit Wasser unter Wasserhahn und beschallen in konzentrierter, enzymatische Reinigungsmittel.
    2. Mit Ultraschall in destilliertem Wasser 3-mal.
    3. Waschen mit destilliertem Wasser (in der Kapuze, 1000 ul Spitze) für 3-mal und Ort unter UV für 30 min.
  2. Unterstützung Netzvorbereitung:
    1. Bereiten Sie die Support-Netzwerk entwickelt, Schimmel.
      1. Gießen PDMS in eine Platte mit 12 Vertiefungen (22 mm Durchmesser).
      2. Wenn der PDMS gehärtet nehmen Sie die Form und mit einem Skalpell, schneiden Sie ein Loch in der Mitte, um eine Ringform zu schaffen.
      3. Legen Sie ein Support-Netzwerk entwickelt Schimmel auf der Mitte der MEA (2A) und decken den Rest der Oberfläche mit PDL für 2 h bei RT.
    2. Entfernen PDL mit Pipette und wäscht mit destilliertem Wasser.
    3. Entfernen Sie die Form und trocknen lassen (Abbildung 2A).
  3. Richten Schablone MEA auf die folgende Weise:
    1. Setzen Sie Schablone auf bezeichneten Mikromanipulator. Verwenden eines invertierten Mikroskops genau auszurichten gemusterten Struktur, um die Elektroden, und senken die Schablone bis sie auf der MEA Oberfläche (2B) angeordnet ist.
      Hinweis: Kontakt mit einer gut gereinigt MEA bietet wettbewerbsfähige Haftung zwischen den PDMS und der MEA selbst.
    2. Heben Sie den Mikromanipulator und, wenn nötig, mit Hilfe einer Pinzette, um eine kleine Menge von Druck über die PDMS anwenden Ablösen von der MEA zu verhindern.
    3. Drücken Sie vorsichtig Schablone MEA Oberfläche, und verwenden Sie Mikroskop zu überprüfen, es richtig angebracht ist und gut ausgerichtet sind. (2C-D).
  4. Zeigen MEA in der Vakuumkammer für 15 Minuten; legte eine 1 ml Tropfen PDL auf Schablone.
  5. Legen Sie in die Vakuumkammer 2 mal 20 min je. Lassen PDL zu O / N im Brutschrank trocknen.
  6. Vor der Beschichtung, entfernen Sie die PDMS-Schablonen von MEAs und waschen mit sterilen water. Platzieren Sie unter UV-Beleuchtung für 7 min.

4. Dissection und Kultur

  1. Bereiten Kulturen wie in Herzog et al. 2011 21 beschrieben.

5. Überzug

  1. Berechnung der Anzahl von Zellen zum Plattieren erforderlich ist, unter Verwendung eines Hämocytometers (optimale Dichte entsprechend der Größe des Schaltkreises, wie in der Folge beschrieben).
    1. Sicherstellen, dass die Zählkammer (Hämozytometer) ist sauber und setzen Sie ein Deckglas darauf (verwenden Sie Alkohol zu reinigen).
    2. Verdünne 10 & mgr; l der Zellsuspension in 190 ul Plattierungsmedium (Verdünnung 1:20).
    3. Last 10 ul der verdünnten Zellen auf den Rand der Zählkammer und langsam pipettiert die Zellen aus der Kammer ermöglicht, sich zu füllen.
    4. Mit einem inversen Mikroskop, visualisieren die Hämocytometer Netz. Bestimmen der Anzahl von Zellen in der Kammer, die durch direkte Zählung (gesunde Zellen sollen rund sein). Zählen Sie die Zellen im großen Platz without die Überquerung der Kanten.
    5. Berechnen der Konzentration der Zellen:
      Gesamtzellzahl / 1000 & mgr; l = Gesamtzellen × Verdünnungsfaktor gezählt × 10 4 (Bereich der Zählkammer).
      Hinweis: Zum Beispiel, wenn der Verdünnungsfaktor betrug 20, und die gesamten Zellen gezählt wurden 100:
      100 × 20 × 10 4 = 0,1 × 10 7 Zellen / 1.000 & mgr; l oder 1 x 10 6/100 ul. Um die Platte 0,75 x 10 6 Zellen, nehmen 75 ul aus den Zellen.
  2. Mit der Anzahl der Zellen für die Plattierung pro Einzel MEA oder eine Petrischale erforderlich ist, die Zellen werden um eine Aggregation zu verhindern, und die Platte zu der Mitte, auf der Oberseite des patternate Bereich (falls nötig, ist es möglich, die Zellen in dem Medium verdünnt) . Für die MEA, legen eine 100 & mgr; l Tropfen in der Mitte. Für Deckglas, legen Sie ein 1.000 ul Tropfen in der Mitte.
  3. Der ausplattierten Zellen bei 37 ° C für 40 min. Hinzufügen Plattierungsmedium den plattierten Zellen, bis 1ml pro MEA und 2 ml pro Deckglas.
  4. Halten bei 37 ° C, und alle 4 Tage mit frischem Wachstumsmedium mit 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 und 0,75% Glutamax angereichert verdünnen.
  5. Von 07.06 DIV, nachdem er Verbindungen zwischen den Inseln, verdünnte Medium mit 10 & mgr; l / ml FUDR (25 mg desoxyuridin + 62,5 mg Uridin in 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) oder eine andere antimitotische Mittel, um zu verhindern, Gliazellen Wucherung.

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Ergebnisse

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A SU8-2075 Form auf einem Siliziumwafer mit einem Merkmal Dicke von etwa 100 um wurde verwendet, um die PDMS formen. Das Muster wurde der Quadrate der mehreren Dimensionen zusammengesetzt, mit einer Seitenlänge und der Abstand zwischen 200 und 700 um (1B). Die Größe des Platzes wurde gewählt, um das Sichtfeld eines 10X (für Inseln mit einer Seitenlänge <800 um) und einem 20x-Objektiv (für Inseln mit einer Seitenlänge <400 um) passen. Drei Parameter, nämlich Zell Beschichtungs-Dichte, zwischen den ...

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Diskussion

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Ein Protokoll, um 2D modulare neuronale Netzwerke in vitro funktionell miteinander verbundenen Schaltungen zusammen wachsen beschrieben. Das Verfahren basiert auf Strukturieren einer zellulären Klebeschicht. Strukturierung mit PDMS Schablonen Wiedergabe der negativen Merkmal der gewünschten Netzwerkarchitektur erreicht. PDMS Schablonen definieren die Bereiche, in denen das zellulare Haftschicht abgeschieden wird. Sobald Zellen überzogen, sie spontan versammeln, um den überzogenen Inseln und Selbstorganisation a...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der Europäischen Projekt BRIANBOW (RP7 Young Explorers unterstützt, möchten die Autoren um Dr. Jacopo Tessadori für nützliche Kommentare zum Manuskript danken und Silvia Chiappalone für ihre Hilfe bei der Erstellung der im Video verwendeten Grafiken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PDMS, Sylgard 184Dow Corning
Nalgene VakuumkammerThermo5305-0609
Poly-D-Lysin PDLSigmaP7886
Silikonfett - SILICAID 1010aidchim LtdH3375
Spin CoaterLaurell - Technologies CorporationWS-650-23
12-Well-KulturplatteSigmaCLS3336
5-Fluor-2'-DesoxyuridinSigmaF0503
UridinSigmaU3003
MEA1060-Inv-BCMehrkanalsysteme
TC02Mehrkanalsysteme
Pen StrepBiological Industries Beit Haemek03-033-1C
B-27Gibco17504044
glutaMAXGibco35050-038
MEM Minimum Essential Medium-EagleBiological Industries Beit Haemek01-025-1B
Micro Electrode Arrays 4QMulti Channel Systems60-4QMEA1000iR-Ti-prReinigungshandbuch: http:// www.multichannelsystems.com
SiliziumwafermicrochemSU8-2075Vorbereitungsprotokoll: http://www.microchem.com

Referenzen

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Schlagwörter

PDMS SchablonenMultielektroden ArraysCalcium Imagingneuronale SchaltkreiseIn vitro Kulturfunktionelle VernetzungSubstratstrukturierung

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