Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entstehung von Brusttumoren zu untersuchen. Mit dieser Technik werden Brusttumoren der Maus entfernt und Primärzellen aus Tumoren präpariert. Ein Lungenextraktionsprotokoll zur Untersuchung von Lungenmetastasen ist enthalten. Darüber hinaus ist ein weiteres Protokoll zur Analyse embryonaler Fibroblasten der Maus aus dem Mausembryo enthalten.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bei der Brusttumorgenese stellt das metastasierende Stadium der Erkrankung die größte Bedrohung für das betroffene Individuum dar. Normale Brustzellen mit veränderten Genotypen besitzen nun die Fähigkeit, in andere Gewebe einzudringen und dort zu überleben. Bei diesem Protokoll werden Brusttumoren der Maus entfernt und Primärzellen aus Tumoren präpariert. Die auf diesem Verfahren isolierten Zellen stehen dann für Gen-Profiling-Experimente zur Verfügung. Für eine erfolgreiche Metastasierung müssen diese Zellen in der Lage sein, intravasieren, im Blutkreislauf zu überleben, in entfernte Organe zu extravasieren und in diesem neuen Organsystem zu überleben. Die Lunge ist das typische Ziel von Brustkrebsmetastasen. Es wurde eine Reihe von Genen entdeckt, die die Selektivität der Metastasierung in die Lunge vermitteln. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung von Lungenmetastasen aus einem gentechnisch veränderten Mausmodell. Darüber hinaus ist ein weiteres Protokoll zur Analyse von embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus aus dem Mausembryo enthalten. MEF-Zellen desselben Tiertyps liefern einen Hinweis auf die Genexpression von Nicht-Krebszellen. Zusammen sind diese Techniken nützlich bei der Untersuchung der Brusttumorgenese von Mäusen, der damit verbundenen Signalmechanismen und der Wege der Anomalien in Embryonen.
Einleitung
Metastasierung ist der letzte Schritt im Fortschreiten von Brustkrebs 1. Es handelt sich um eine Reihe von Schritten, in denen bösartige Zellen aus dem Primärtumor freigesetzt und in andere Organe disseminiert werden 2. Die Zellen müssen in der Lage sein, intravasieren, im Kreislauf zu überleben, in entfernte Organe zu extravasieren und in diesem neuen Organsystem zu überleben 3. Jeder Schritt der Tumorgenese wird von den Zellen durch verschiedene genetische und epigenetische Veränderungen streng kontrolliert 4. Um die Mechanismen der Tumorgenese von Brustkrebs zu untersuchen, wurden Mausmodellsysteme aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer, geringen Größe und schnellen Brutzeit verwendet. Einige große Vorteile der Verwendung von Mausmodellen in der Krebsforschung sind die molekularen und physiologischen Ähnlichkeiten, die sie mit dem Menschen teilen 5.
Etablierte Maus- und menschliche Zelllinien wurden ausgiebig in der Brustkrebsforschung verwendet. Obwohl wir mit diesen Zellen einige Informationen über die Schritte der Metastasierung erhalten können, geben genetisch manipulierte Tiermodelle mit Tumorsuppressoren/Onkogenen weitaus mehr Informationen über die Tumorentwicklung und Metastasierung ab dem Embryonalstadium. Mit diesen Mausmodellen können wir also eine genetische und entwicklungsbedingte Regulation des Tumorwachstums erhalten. Darüber hinaus spielt die Tumormikroumgebung auch eine wichtige Rolle bei der Genexpression von Tumorzellen, und es kann schwierig sein, das gleiche Szenario mit Studien mit etablierten Zelllinien nachzuahmen. Primäre humane Mammatumoren können auch zur Untersuchung der Brusttumorgenese von Mäusen verwendet werden. Der Hauptnachteil der Verwendung isolierter Brusttumoren besteht darin, dass dieser neu implantierte Tumor nicht über das Gefäßsystem und das Lymphgewebe der Maus verfügt. Die genetischen Mausmodellsysteme zur Untersuchung der Tumorgenese von Mamma ermöglichen es uns, die Schritte der Metastasierung, die Analyse der Tumormikroumgebung und den Zugang zum gesamten Körper zu überwachen 5.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Brusttumorgenese bei Mäusen zu untersuchen. Es ist bekannt, dass Brustkrebs typischerweise Metastasen im Gehirn, in der Lunge und in den Knochen bildet. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von primären Brusttumorzellen sowie die Untersuchung von Brustkrebsmetastasen in der Lunge. Darüber hinaus ist ein weiteres Protokoll zur Analyse von embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus aus dem Mausembryo enthalten. Zusammen sind diese Techniken nützlich bei der Untersuchung der Brusttumorgenese von Mäusen.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Protokollen von der Institutional Animal Care und Verwenden Committees (IACUC) von LSU School of Medicine genehmigt wurde. Alle Instrumente müssen vor der Dissektion autoklaviert werden.
1. Herstellung von primären Zellen aus Mausbrusttumoren
- Eine Maus-Modell, das genetisch mit dem Maus-Brusttumorvirus Polyoma Middle-T-Antigen (MMTV-PyMT transgenen Maus), das spontan entwickeln Tumore wie zuvor beschrieben 6 konstruiert wurde.
- Opfern Mäuse mit Isofluran (99,9%) und 75% Ethanol zu sprühen, um eine sterile Umgebung (1A) zu gewährleisten.
- Öffnen die Haut vor dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere. Pin der Haut nach unten, um einfachen Zugang zu Organen (1B) zu ermöglichen.
- Isolieren Sie die Brustbrusttumor und mit kaltem sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) (Abbildung 1c).
- Übertragen Sie den Tumoreine sterile 10 cm Gewebekulturplatte und hacken sie mit einer sterilen Rasierklinge und Schere auf ca. 1 mm 3 Stück. Die nachfolgenden Schritte sollten in einer sterilen Sterilbank durchgeführt werden.
- Inkubiere die gehackte Tumorgewebe mit Collagenase in serumfreiem DMEM-Medium mit einer Endkonzentration von 1 mg / ml gelöst auf einer Wippe für 2 h bei 37 ° C. Zentrifugieren Sie das Tumorgewebe Suspension 3 min bei 200 x g.
HINWEIS: Die Collagenase-Inkubation ist für enzymatische Dissoziation des Gewebes. - Überstand verwerfen und wäscht den Niederschlag 3-mal mit PBS (pH 7,4) durch Zentrifugation für 3 min bei 200 x g. Nach dem letzten Waschen, Dekantieren des Überstandes.
- Resuspendieren des Gewebes mit 2 ml Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C, während Taumel. Zentrifugieren Sie die Suspension 3 min bei 200 xg und wiederholen Sie die Wäschen.
- Resuspendieren Gewebepellet in normalem Wachstumsmedium (DMEM, 10% FBS, 2X Pen / Strep) auf eine 10 cm Platte. Veränderungdie Medien jeden Tag für die nächsten 3 Tage. Kulturzellen, bis die gewünschte Anzahl von Zellen erhalten wird.
HINWEIS: Etwa 1x10 7 Zellen werden aus diesem Verfahren isoliert werden. Andere Maus-Mammatumorgenese Modellen wie MMTV-Neu ergeben niedrigere Ausbeute an Zellen im Vergleich mit MMTV-PyMT. Bei der Verwendung von Modellen, die einen niedrigeren Ertrag erzeugen, ist es vorteilhaft, mit einem größeren Tumor und Kulturzellen länger zu beginnen.
2. Maus Lung Extraction auf Lungenmetastasen visualisieren
- Vor der Lunge Extraktion, entfernen Sie die Leber und die Membran. Verdrängen die Rippen ohne die Lungen zu stören.
- Mit einer feinen Schere, öffnen Sie den oberen Teil der Luftröhre, die näher an der Halsschlagader ist.
- Verwendung eines Katheters, injiziert ein Mittel wie beispielsweise 1 ml Z-fix oder Tusche durch die Luftröhre in die Lunge (2A) zu füllen. Betten Sie die Z-fix Lungs in Paraffin.
- De-Fleck die Lungen mit Tusche in Fekete-Lösung eingespritzt(100 ml 70% -igem Alkohol, 10 ml 10% igem gepuffertem Formalin und 5 ml Eisessig) für 5 min. Definieren Tumorknoten an sekundären Standorten mit ≥ 0,5 mm im Durchmesser, bestimmen die Knötchen als Metastasierung.
HINWEIS: Aufgrund der Bronchien und Bronchiolen Blockade durch den Tumor, können Tumorknoten nicht absorbieren 15% Tusche und damit normalem Lungengewebe wird in schwarz, und die Tumorknoten wird in weißer Farbe 7 sein. Dies wird die Visualisierung individueller Tumorknoten (2B) zu ermöglichen.
3. Vorbereitung embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) aus Maus Embryonen
- Opfern trächtige Mäuse mit Isofluran (99,9%) und 75% Ethanol zu sprühen, um eine sterile Umgebung sichergestellt.
- Öffnen die Haut vor dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere und Isolierung der Embryonen aus dem Uterus.
- Achten Sie darauf, um die Embryonen stören beim Öffnen der Haut.
- Entfernen Sie die Gebärmutterhörner und spülen Sie sie in kaltem sterile PBS (pH 7,4).
- Trennen Sie den Embryo von seiner Plazenta sehr sorgfältig und Ort Embryonen in einer 10 cm Platte mit eiskaltem PBS (pH 7,4).
- Entfernen Sie den Kopf, Leber und Darm aus dem Embryo und legen Sie den restlichen Teil in einer 12-Well-Gewebekulturplatte enthält PBS (pH 7,4).
- Übertragen Sie die Embryo Körper in einen anderen 12 Well-Platte mit Trypsin EDTA und in kleine Stücke (ca. 1 mm 3) mit einer sterilen Rasierklinge und Schere. Inkubieren Häckselgut mit 5 ml Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C.
- Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 1 ml fötales Rinderserum (FBS), um die geschnittenen Embryonen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 xg Geschwindigkeit für 10 Minuten, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, das Pellet mit 1 ml warmem DMEM-Medium, und all der Inhalt in einer 10 cm Schale mit 10 ml DMEM (mit 20% FBS und 2X Penicillin / Streptomycin ).
- Ändern Sie das Medium jeden Tag für zwei Tage. Kultur die Zellen, bis die gewünschte ZelleZahl erreicht ist.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die Tumorprogression Stadium, in dem das Tier zu opfern, hängt von der jeweiligen Studie und IACUC Richtlinien. In 1A einer 100 Tage alte C57BL / 6-Maus mit der Maus-Mammatumorvirus Polyoma Middle-T-Antigen (MMTV-PyMT) wurde nach drei Monaten geopfert. Die Haut wurde von dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere geöffnet und die Haut wurde festgenagelt, um einfachen Zugang zu Organen, wie in 1B gezeigt, zu ermöglichen. Dies erlaubt einen einfachen Zugang zum Tumor,...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieses Protokoll ist zur Isolierung von primären Zellen aus einer neuen Maus-Tumor. Lysate aus diesen Verfahren hergestellt werden, sind nützlich für die Protein-, DNA- und RNA-Analyse. Krebszellen aus dem primären Brusttumor metastasieren häufig zum Gehirn, Lunge und Knochen 1. Eingeschlossen ist eine Technik, die zur Detektion von Lungenmetastasen zu extrahieren. Anfärben der Lunge mit einem Tintenfleck wird zur Visualisierung von Tumorknoten zu ermöglichen, wie in 2B zu sehen. Zur Festsetz...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Angaben.
Danksagungen
Wir danken NIH, LACaTS und der Ochsner Klinikstiftung für die finanzielle Unterstützung.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Lagern bei 4 > C |
| 0,05 % Trypsin-EDTA | Lebensdauer Technologien | 25300-062 | Lagern bei – 20 > C |
| Kollagenase Typ IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Lagern bei – 20 ° C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Lagern bei – 20 ° C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Lagern bei 4 > C |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Lagern bei – 80 ° C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
Referenzen
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
