Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entstehung von Brusttumoren zu untersuchen. Mit dieser Technik werden Brusttumoren der Maus entfernt und Primärzellen aus Tumoren präpariert. Ein Lungenextraktionsprotokoll zur Untersuchung von Lungenmetastasen ist enthalten. Darüber hinaus ist ein weiteres Protokoll zur Analyse embryonaler Fibroblasten der Maus aus dem Mausembryo enthalten.

Zusammenfassung

Bei der Brusttumorgenese stellt das metastasierende Stadium der Erkrankung die größte Bedrohung für das betroffene Individuum dar. Normale Brustzellen mit veränderten Genotypen besitzen nun die Fähigkeit, in andere Gewebe einzudringen und dort zu überleben. Bei diesem Protokoll werden Brusttumoren der Maus entfernt und Primärzellen aus Tumoren präpariert. Die auf diesem Verfahren isolierten Zellen stehen dann für Gen-Profiling-Experimente zur Verfügung. Für eine erfolgreiche Metastasierung müssen diese Zellen in der Lage sein, intravasieren, im Blutkreislauf zu überleben, in entfernte Organe zu extravasieren und in diesem neuen Organsystem zu überleben. Die Lunge ist das typische Ziel von Brustkrebsmetastasen. Es wurde eine Reihe von Genen entdeckt, die die Selektivität der Metastasierung in die Lunge vermitteln. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung von Lungenmetastasen aus einem gentechnisch veränderten Mausmodell. Darüber hinaus ist ein weiteres Protokoll zur Analyse von embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus aus dem Mausembryo enthalten. MEF-Zellen desselben Tiertyps liefern einen Hinweis auf die Genexpression von Nicht-Krebszellen. Zusammen sind diese Techniken nützlich bei der Untersuchung der Brusttumorgenese von Mäusen, der damit verbundenen Signalmechanismen und der Wege der Anomalien in Embryonen.

Einleitung

Metastasierung ist der letzte Schritt im Fortschreiten von Brustkrebs ¹. Es handelt sich um eine Reihe von Schritten, in denen bösartige Zellen aus dem Primärtumor freigesetzt und in andere Organe disseminiert ^{werden 2}. Die Zellen müssen in der Lage sein, intravasieren, im Kreislauf zu überleben, in entfernte Organe zu extravasieren und in diesem neuen Organsystem zu überleben ³. Jeder Schritt der Tumorgenese wird von den Zellen durch verschiedene genetische und epigenetische Veränderungen streng kontrolliert ⁴. Um die Mechanismen der Tumorgenese von Brustkrebs zu untersuchen, wurden Mausmodellsysteme aufgrund ihrer kurzen L....

Protokoll

Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Protokollen von der Institutional Animal Care und Verwenden Committees (IACUC) von LSU School of Medicine genehmigt wurde. Alle Instrumente müssen vor der Dissektion autoklaviert werden.

1. Herstellung von primären Zellen aus Mausbrusttumoren

1. Eine Maus-Modell, das genetisch mit dem Maus-Brusttumorvirus Polyoma Middle-T-Antigen (MMTV-PyMT transgenen Maus), das spontan entwickeln Tumore wie zuvor beschrieben ⁶ konstruiert wurde.
2. Opfern Mäuse mit Isofluran (99,9%) und 75% Ethanol zu sprühen, um eine sterile Umgebung (1A) zu gewährleisten.
3. Öffnen die Hau....

Ergebnisse

Die Tumorprogression Stadium, in dem das Tier zu opfern, hängt von der jeweiligen Studie und IACUC Richtlinien. In 1A einer 100 Tage alte C57BL / 6-Maus mit der Maus-Mammatumorvirus Polyoma Middle-T-Antigen (MMTV-PyMT) wurde nach drei Monaten geopfert. Die Haut wurde von dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere geöffnet und die Haut wurde festgenagelt, um einfachen Zugang zu Organen, wie in 1B gezeigt, zu ermöglichen. Dies erlaubt einen einfachen Zugang zum Tumor,.......

Diskussion

Dieses Protokoll ist zur Isolierung von primären Zellen aus einer neuen Maus-Tumor. Lysate aus diesen Verfahren hergestellt werden, sind nützlich für die Protein-, DNA- und RNA-Analyse. Krebszellen aus dem primären Brusttumor metastasieren häufig zum Gehirn, Lunge und Knochen ^1. Eingeschlossen ist eine Technik, die zur Detektion von Lungenmetastasen zu extrahieren. Anfärben der Lunge mit einem Tintenfleck wird zur Visualisierung von Tumorknoten zu ermöglichen, wie in 2B zu sehen. Zur Festsetz.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	HyClone	SH30243.01	Lagern bei 4 > C
0,05 % Trypsin-EDTA	Lebensdauer  Technologien	25300-062	Lagern bei – 20 > C
Kollagenase Typ IV	Sigma-Aldrich	C5138	Lagern bei – 20 ° C
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Lagern bei – 20 ° C
Pen Strep	Life  technologies	15140-122	Lagern bei 4 > C
Fötales Rinderserum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106	Lagern bei – 80 ° C
Z-fix	ANATECH	#174	Store at RT
India Ink	Yasutomo		Store at RT
AERRANE (Isoflurane)	Baxter	NDC 10019-773-60	Store at RT
Ethanol	EMD	AX0441-3	Store at RT