Getrocknete Blutflecken - Vorbereitung und Verarbeitung für den Einsatz in Immunoassays und Molekulare Techniken

Zusammenfassung

Die Vorbereitung und Verarbeitung von getrocknetem Blutflecken (DBS) für ihre letzten Endes sind immer noch schlecht für die meisten diagnostischen Anwendungen standardisiert. Um dieses Defizit zu überwinden, ist ein umfassende Schritt für Schritt Protokoll vorgeschlagen und anschließend bewertet im Hinblick auf ihre Wirksamkeit für die Erkennung von Markierungen von Virusinfektionen.

Zusammenfassung

Die Idee der Blutentnahme auf einer Papierkarte und anschließend mithilfe der getrocknete Blutflecken (DBS) zu diagnostischen Zwecken entstanden vor einem Jahrhundert. Seitdem DBS Tests für Jahrzehnte überwiegend geblieben konzentrierten sich auf die Diagnose von Infektionskrankheiten vor allem bei beschränkten Ressourcen oder der systematischen screening von Neugeborenen für ererbte Stoffwechselstörungen und nur vor kurzem haben eine Vielzahl von neue und innovative DBS Anwendungen aufgetaucht. Seit vielen Jahren bereits analytische Variablen galten nur unangemessen auf dem Gebiet des DBS zu testen und auch heute noch, mit Ausnahme von Neugeborenen screening, der gesamten Pre-analytischen Phase umfasst die Vorbereitung und Verarbeitung von DBS für ihre letzten Endes ist nicht standardisiert. Diesem Hintergrund wird ein umfassende Schritt für Schritt-Protokoll, das al die wesentlichen Phasen deckt, d.h. Ansammlung von Blut vorgeschlagen; Vorbereitung der Blutflecken; Trocknung von Blutflecken; Lagerung und Transport von DBS; Elution des DBS, und schließlich Analysen der DBS Eluate. Die Wirksamkeit dieses Protokolls wurde zuerst mit 1.762 gekoppelten Serum/DBS-Paare zur Erkennung von Markierungen des Hepatitis B-Virus, Hepatitis-C-Virus und humanen Immundefizienz-Virusinfektionen auf einer automatisierten analytischen Plattform bewertet. In einem zweiten Schritt wurde das Protokoll in einer Pilotstudie genutzt, die auf aktiven Drogenkonsumenten in den deutschen Städten Berlin und Essen durchgeführt wurde.

Einleitung

Die Idee der Verwendung von Blut gesammelt auf einer Papierkarte hergestellt aus Zellulose ist Ivar Christian Bang (1869 – 1918), der Vater der modernen klinischen Mikroanalyse^{1, 2}zugeschrieben. Im Jahre 1913 bestimmt Bang Glukose aus Eluate von getrocknetem Blut Flecken (DBS)³ und später auch Stickstoff Messungen mit der Kjeldahl-Methode mit diesem Filterpapier Technik². Anschließend berichteten mehrere Ermittler auf die Verwendung von DBS für serologische Tests für Syphilis²diagnose. Wie früh im Jahr 1924, Chapman die Vorteile des DBS zu testen zusammengefasst wenn er betonte besonders vier Gegenstände, die heute noch gültig sind: (1) im Vergleich zu herkömmlichen Venenpunktion, weniger Blutvolumen erforderlich ist und diese Tatsache war am wichtigsten pädiatrischen Diagnostik; (2) die Blutentnahme ist einfach, nicht-invasive und preiswerte; (3) das Risiko einer bakteriellen Kontamination oder Hämolyse ist minimal; und über einen längeren Zeitraum mit fast keine Verschlechterung des Analyten^{2, 4}(4) DBS erhalten werden können. Neben seiner Verwendung in Tests für Syphilis enthalten weiteren frühe Anwendungen der DBS-Technik, z. B.der Nachweis von Antikörpern gegen Masern, Mumps, Polioviren, parainfluenza-Virus und respiratory syncytial Virus (RSV) in 1953², die Identifizierung von Shigella im Kot auf Filterpapier getrocknet und versendet per Post aus Indonesien nach Leiden in den Niederlanden sowie den Nachweis von Antikörpern gegen Schistosoma in DBS in endemischen Gebieten entnommen und analysiert mehr als drei Monate später⁵ . Im Jahr 1963 veröffentlicht fünfzig Jahre nach Bang original Kommunikation^{2, 6}, Guthrie endlich seine berühmten Methode für die Diagnose von Phenylketonurie von DBS erhalten durch eine Ferse stechen von Neugeborenen^{7, 8}.

Ab diesem Zeitpunkt, als eine allgemein anwendbare Methode für das Sammeln von DBS angesehen wurden, blieb Speicherung, den Transport und Analyse einer Vielzahl von menschlichen Körperflüssigkeiten⁵, ihre Verwendung in der Diagnostik noch konzentrierte sich überwiegend auf die Diagnose von Infektionen vor allem bei beschränkten Ressourcen und systematisches Screening der Neugeborenen für ererbte Stoffwechselstörungen für Jahrzehnte^{9, 10}. Seit 2005 jedoch eine Vielzahl von neuen und innovativen DBS-Anwendungen haben damit begonnen, entstehen. Dies führte zu einer fast exponentiellen Zunahme der Anzahl der jeweiligen wissenschaftlichen Veröffentlichungen über DBS von ca. 50 auf fast 450 derzeit jährlich. Zu den aufstrebenden Anwendungen gehören so unterschiedlichen Bereichen wie Toxico und pharmakokinetischen Studien, metabolic profiling, therapeutisches Drug monitoring, forensische Toxikologie oder einer Kontamination der Umwelt Kontrolle^{10, 11}.

DBS zu testen, so hat einen Siegeszug durch klinische Labordiagnostik in den vergangenen 100 Jahren². Wie in der klinischen Chemie¹²jedoch im März dieses Jahres bereits analytische Variablen nicht ausreichend seit vielen Jahren galten. In der Tat auch heute noch, nach herausragenden Aktivitäten wie die CDC Filterpapier Auswertung Projekt¹³ oder die Formulierung einer nationalen Norm für die Blutentnahme auf Filterpapier im Rahmen des Neugeborenen-screening¹⁴, die Pre-analytische Phase ist in den meisten der anderen Felder, in denen DBS testen angewandte^{5, 10}ist noch weitgehend unterbewertet.

Diesem Hintergrund empfiehlt sich eine umfassende Schritt für Schritt Protokoll^14-16 für den Einsatz in Immunoassays und Molekulare Techniken umfasst alle wesentlichen Schritte für die Vorbereitung und Verarbeitung von DBS in der folgenden Mitteilung: (1) Ansammlung von Blut; (2) Vorbereitung der Blutflecken; (3) Trocknung von Blutflecken; (4) Lagerung und Transport; (5) Elution von DBS; und schließlich (6) Analysen von DBS Eluate. Die Wirksamkeit des Protokolls wurde zuerst ausgewertet mit 1.762 gekoppelten Serum/DBS-Paare zum Nachweis von Hepatitis B Virus (HBV) Oberflächenantigen (HBsAg), Antikörper gegen HBV Core Antigen (Anti-HBc), Antikörper gegen HBV-Oberflächenantigen (Anti-HBs), HBV-DNA-Antikörper Das Hepatitis C Virus (HCV) (Anti-HCV) HCV-RNA und menschlichen Immunodeficiencyvirus (HIV) 1-p24-Antigen/anti-HIV 1/2 entweder eine vollständig automatisierte Plattform oder empfindlichen qualitativen Nukleinsäure-tests. ¹⁷. in einem zweiten Schritt wurde das Protokoll in der Pilotstudie "Drogen und chronische Infektionskrankheiten" ("DRUCK Study") die durch das Robert Koch-Institut in enger Zusammenarbeit mit den nationalen Referenzzentrums für Hepatitis C auf aktiven durchgeführt wurde genutzt Drogenkonsumenten in den deutschen Städten Berlin und Essen¹⁸.

Protokoll

Da das Protokoll für den Einsatz in der medizinischen Diagnostik konzipiert ist, muss seine Anwendung der Grundsätze der Deklaration von Helsinki¹⁹folgen. Für den ersten Teil der in dieser Mitteilung vorgestellten Ergebnisse, sowohl von den Patienten eine gesonderte Vereinbarung und Genehmigung durch eine Ethik-Kommission schien entbehrlich aus zwei Gründen: (1) "bei der Aufnahme" Essener Universitätsklinik, "jeder Patient bietet schriftliche Zustimmung aller notwendigen biochemischen, bakteriologische und virologische Untersuchungen." ¹⁷ (2) "wurden alle Proben, die während der Bewertung der DBS testen verwendet das Institut für Virologie in den Prozess der klinischen Routinediagnostik geschickt. Somit keines der Exemplare wurden speziell für die Studie erhoben, keinen einzigen zusätzlichen Blutentnahme wurde durchgeführt und keines der Materialien wurde getestet für jeden Parameter als die von den Ärzten im Rahmen der normalen erforderlich diagnostische Aufarbeitung." ¹⁷ die Studie "Drogen und chronische Infektionskrankheiten" (DRUCK-Studie")¹⁸, in denen DBS Tests schließlich in den deutschen Städten Berlin und Essen verwendet wurde, um Menschen zu bewerten, die aktiv Drogen injizieren stimmte der Bundesbeauftragte für den Schutz und Informationsfreiheit (Berlin, Deutschland) und ebenso wie von der Ethikkommission der medizinischen Universität Charité, (Berlin, Deutschland).

1. Sammlung von Blut

1. Venenpunktion^{14, 15, 20, 21}
   1. Einweg Latex Gummihandschuhe ziehen Sie an, und reinigen Sie den Bereich der vorgesehenen Punktionsstelle (vorzugsweise die mittlere cubital Ader in der Antecubital Fossa) mit einem geeigneten Desinfektionsmittel, z.B., 70 % Isopropylalkohol.
   2. Anwenden einer Blutsperre 4 – 6 Zoll über die vermeintliche Punktionsstelle, die Venen ausdehnen. Führen Sie die Nadel in die Vene des Patienten, und sobald es vorhanden ist, füllen Sie vorsichtig die angeschlossenen Blut-Röhrchen, enthält EDTA als ein Antigerinnungsmittel.
   3. Sobald Venenpunktion abgeschlossen ist, lassen Sie die Blutsperre und ziehen Sie die Nadel heraus. Drücken Sie einem trockenen Tupfer auf die Einstichstelle, die anschließend durch einen Verband gehalten werden kann.
2. Haut-Punktion (Abbildung 1A)^{13-15, 20, 22, 23}
   1. Ein paar Einweg Latex Gummihandschuhe anziehen.
   2. Vor Punktion der Haut sollte der Patient seine/ihre Hände warm. Der Finger ist massiert Anterogradely das anreichern der Blutfluss in Richtung um zu Website zu durchstechen.
   3. Reinigen Sie die Haut der palmaren Seite der Spitze distalen Phalanx der dritten oder vierten Finger der Hand mit einem geeigneten Desinfektionsmittel, z.B., 70 % Isopropylalkohol nicht schreiben. Punktion der Haut durch eine Einweg-Sicherheitslanzette. Die Finger sollten in einer solchen Position festzustellen, dass die Schwerkraft die Ansammlung von Blut auf der Fingerspitze erleichtert.
   4. Bei der Sammlung von Kapillarblut durch Punktion der Haut abgeschlossen ist, legen Sie einen Verband auf der Fingerspitze.

2. Vorbereitung der Blutflecken

1. Vorbereitung von Blutproben durch Venenpunktion¹⁵
   1. Vor Ort die gesammelten Anti-koaguliert (EDTA) ganze venöse Blut auf den Filter-Karten so schnell wie möglich. Nicht getrocknete Blutflecken mehr als 24 Stunden nach der Blutentnahme vorbereiten.
   2. Stellen Sie alle Informationen für die Identifizierung des Patienten auf die Filterkarte. Eine Karte sollte nur mit dem Blut eines einzelnen gesichtet werden.
   3. Einweg Latex Gummihandschuhe anziehen.
   4. Sanft das Blutsammelröhrchen 2 – 4 mal drehen und anschließend den Stopfen vorsichtig öffnen.
   5. Aspirieren Sie 50 µl des gesamten venösen Blutes mit einer Pipette mit einer Einweg-Spitze. Übertragen Sie das Blut in die Mitte eines Kreises ohne Filterpapier direkt mit der Spitze der Pipette. Versuchen Sie, den Kreis vollständig zu sättigen.
   6. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle erforderlichen Kreise der Karte zu füllen.
2. Vorbereitung von Blut gesammelt durch die Haut durchstechen (Zahlen 1 b und 1 C)^{13-16, 23}
   1. Den ersten Blutstropfen mit einem Tupfer wischen Sie ab, da es überschüssige Gewebeflüssigkeit enthalten kann. Massieren Sie die Finger wieder um Blutfluss an der Punktionsstelle zu erhöhen. Übertragen Sie die folgende Drop auf einen der Kreise einer Filter-Karte ohne Berührung der Oberfläche direkt mit der Fingerspitze. Lassen Sie das Blut in die Textur des Filters durch Kapillarkräfte nur eingeweicht werden.
   2. Lassen Sie den nächsten großen Tropfen Kapillarblut Form auf der Fingerspitze und in den nächsten Kreis zu sammeln. Fahren Sie dieses Verfahren, bis alle notwendigen Kreise ausgefüllt werden oder Blutfluss stoppt.
   3. Nicht quetschen oder "Milch" des Fingers übermäßig wenn die Durchblutung nicht ausreicht, um alle erforderlichen Kreise der Filterkarte zu füllen ist. Wenn der Blutfluss stoppt legen Sie einen Verband auf der Fingerspitze. Führen Sie eine zweite Punktion der Haut auf einen anderen Finger, wenn mehr Blut für die Prüfung benötigt wird.

3. Trocknung von Blutflecken

1. Um die Blutflecken trocken, setzen Sie den Filter Karten auf ein sauberes Papier Handtuch in ein Biohazard Sicherheitsschrank und lassen Sie sie trocknen, vorzugsweise O/N (aber für mindestens 4 Stunden), bei RT in Ermangelung einer externen Wärmequelle. Wenn der Trocknungsvorgang abgeschlossen ist, die Blutflecken eine gleichmäßig dunkel bräunliche Farbe haben und keine rote Bereiche sichtbar sind mehr (Abbildung 1)^{13, 15, 16}.

4. Lagerung und Transport von getrocknetem Blutflecken (DBS)

Hinweis: Verarbeitung von den Blutflecken kann nach dem Trocknen unterbrochen werden. Die Filter-Karten können jetzt gespeicherten^{13-16, 23}.

1. Setzen Sie für die Lagerung die Filter-Papierkarte in einer einzigen, Gas-undurchlässigen Reißverschluss-Tasche, mit 1 bis 2 Trockenmittel Beutel um die Proben vor Feuchtigkeit (Abbildung 1E) zu schützen. Optional eine Luftfeuchtigkeit Anzeige Karte hinzufügen.
2. Übertragen Sie diese Tasche auf ein Gefrierfach mit einer Temperatur von-20 ° C oder so schnell wie möglich zu senken. Wenn Gefriergeräte unter Feldbedingungen nicht vorliegen, ist Lagerung bei-4 ° C oder sogar bei Raumtemperatur für bis zu 14 Tagen möglich.
3. Transportieren Sie gefrorene DBS Proben auf Trockeneis. Verwenden Sie für Filter-Karten zunächst bei Raumtemperatur aufbewahrt ein dreifach Verpackungssystem, bestehend aus den Reißverschluss Gepäckstücke als der innere Container sowie eine innere und eine äußere Hülle. Keine Inhalte Markierungen sind auf dem äußeren Umschlag für den Versand per Post erforderlich, aber das internationale Biohazard-Symbol muss auf die primäre Innenbehälter¹⁶angebracht werden.
4. Schließen Sie die Filter-Karten aus Weiterverarbeitung ändert sich die Trockenmittel Packs und/oder die zusätzliche Feuchtigkeit Indikator Karte in eine rosa Farbe.

5. Elution von getrocknetem Blut Flecken,^{13, 15, 16, 23}

1. Eins mit einem Einweg-6 mm-Gerät aus jeden blutgetränkten Kreis der Klasse 903 Filterkarte (Abb. 1F) ausstanzen. Übertragen Sie alle gestanzten getrocknete Blutflecken aus einem einzigen Patienten auf einen Brunnen der 12-Well-Platte.
2. Füllen Sie den Brunnen mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween 20 und 0,08 % Natriumazid (Abbildung 1). Passen Sie die Lautstärke des zusätzlichen Puffer, um die jeweiligen Mindestanforderungen des Assays für die spätere Analyse von getrocknetem Blut Flecken Eluate verwendet.
3. Wiederholen Sie diese Schritte aus, um eine zweite Reihe von getrocknetem Blut vor Ort Eluate zu erhalten, um molekulare Analysen durchzuführen.
4. Kultur Zellplatte auf einem Labor-Shaker und lassen Sie die gestanzten getrocknete Blutflecken sanft für ein Minimum von 4 hr eluieren oder, vorzugsweise, O/N (Abbildung 1 H).
5. Am nächsten Tag, die Flecken sind fast frei von Blut und hämolytische Überstände (Abbildung 1I) gebildet haben. Übertragen Sie diese Eluate auf Mikrozentrifugenröhrchen. Dann unterliegen sie Zentrifugation für 2 min bei 10.500 x g (Abbildung 1J) um die Überstände von jeglichen Schmutz zu befreien, die während der Elution (Abbildung 1 K) gebildet hatten.

6. Analyse von Eluaten

1. Zentrifugiert Eluate sind nun bereit für die vorgesehenen Analysen verwendet werden. Untersuchen der Eluate für Marker des Hepatitis B-Virus, Hepatitis-C-Virus und HIV-Infektion mit handelsüblichen Kits und befolgen Sie die Anweisungen des jeweiligen Herstellers sorgfältig (Abbildung 1 L).

Abbildung 1. Grafische Zusammenfassung des Protokolls vorgeschlagen in dieser Mitteilung für die Vorbereitung und Verarbeitung von getrocknetem Blutflecken in Immunoassays und Molekulare Techniken verwendet werden. Gesamten venösen Blut und Kapillarblut gewonnen durch Venenpunktion oder Punktion der Haut mit einer Lanzette (A) können als Muster für getrocknetes Blut vor Ort Analyse dienen. Nach dem Transfer des Blutes in den Kreisen der eine Klasse 903 Filterkarte (B, C) sollten die Proben vorzugsweise O/N bei Raumtemperatur in ein Biohazard Sicherheitsschrank Form stellen eine gleichmäßig bräunliche Farbe ohne jede einzuspielenden rot getrocknet werden Bereichen (D). Bei der Trocknung der Blutflecken ist abgeschlossen und Lagerung ist notwendig, die Filter-Karten können in Gas-undurchlässig Zip-Beutel mit 1 – 2 Trockenmittel Beutel (E) verpackt werden. Labor-Weiterverarbeitung des DBS umfassen die Generation der Schläge von einem 6 mm Einweg-Gerät aus der Mitte der Kreise (F, G), die Elution von Schlägen in einem PBS-Puffer für mindestens 4 Stunden oder, vorzugsweise, O/N auf einen Shaker (H ), die Wiederherstellung der Eluate (ich), und schließlich die Zentrifugation des Labor-Cups (J), die DBS-Eluate aus jeglichen Schmutz zu befreien, die während des Prozesses der Elution (K) entstanden sein könnte. Danach sind die DBS-Eluate bereit für Analysen, die durch eine vollautomatisierte Plattform (L) durchgeführt wurden, um serologische Marker für HBV, HCV und HIV-Infektionen, bzw. zu erkennen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergebnisse

Die Wirksamkeit des Protokolls vorgeschlagen für die Zubereitung und Verarbeitung von DBS wurde zuerst durch die Analyse von 1.762 gekoppelten Serum/DBS-Paare für Marker von HBV, HCV und HIV-Infektion ausgewertet. ¹⁷. für diesen Zweck DBS wurden von 100 µl ganze venöses Blut (vgl. Punkte 2.1.1 – 2.1.6 des vorhergehenden Protokolls) vorbereitet und waren mit 1.000 µl PBS-basierte eluiert Puffern, jeder, (vgl. Punkte 5.1-5.5 des genannten Protokolls) um den Vorgang abzuschließen für alle sieben Parameter in zwei separate Vorgänge. Ein solcher Ansatz ohne sorgfältige Optimierung der Elution Bedingungen für jede einzelne Analyten schien unvermeidlich sein, denn einen eher hohen Probendurchsatz in vergleichsweise kurzer Zeit, während der bevorstehenden Feldstudie "Drogen und chronische erwartet wurde Infectious Diseases"("DRUCK-Studie").

Alle Messungen des Herstellers im Zuge der DBS Analysen eingehalten aber musste geändert werden, in Bezug auf HBsAg und Anti-HBs-Bestimmungen, für die Wirkung der Hämolyse oder das Ergebnis der Verdünnung zu kompensieren. Mit einem Cut-off-Wert von 0,05 IU/ml HBsAg testen DBS Eluate führen zu einer Rate von "False-Positives" von 14,7 % (52 von 354) im Vergleich zum Serum Proben (Abbildung 2A). Empfänger Betrieb charakteristisch (ROC) Analyse^{25, 26} der Daten darauf hingewiesen, dass eine Erhöhung des Schwellenwertes bis 0,15 IU/ml eine ideale Trennung von HBsAg-positiven HBsAg-negative (0.986 [Empfindlichkeit], 0.000 [1-Spezifität], führen würde Abbildung 2 b). Auf der anderen Seite nahm mit einem Cut-off von 10 IU/l für die Quantifizierung von Anti-HBs Antikörper, die eine Rate der falsch-negativen Messungen von 14,2 % (47 von 331) war (Abbildung 2). Daher nach ROC Analyse wieder Grenzwertes wurde auf 1,5 IU/l gesenkt, um eine optimale Diskriminierung von Werten (0.917 [Empfindlichkeit], 0,007 [1-Spezifität] Abb. 2D) zu erreichen.

Abbildung 2. HBsAg und Anti-HBs-Tests in DBS Eluate (geändert von¹⁷). Die ROC-geführte Erhöhung des Cut-off-Wertes für HBsAg Quantifizierung von 0,05 IU/ml (A) bis 0,15 IU/ml reduziert (B) die Rate der falsch-positiven Ergebnissen von 14,7 % auf 0 %. Ebenso schlug ROC Analyse der Anti-HBs-Konzentration eine Abnahme der jeweiligen Schwelle von 10 IU/l (C) auf 1,5 IU/l (D), False-negative, die zunächst 14,2 % aller Bestimmungen entfielen dadurch vollständig zu beseitigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Die Ergebnisse der gekoppelten Serum/DBS-Analysen sind in Tabelle 1¹⁷zusammengefasst. Keine nicht-Spezifität wurde im Laufe der Tests für jede der sieben Analyten DBS aufgenommen.

Wenn Eluate DBS für das Vorhandensein von HBsAg, d. h. die serologische Schlüsselparameter der akuten und chronischen Infektion mit HBV, untersucht wurden wurde eine analytische Sensitivität von 98,6 % ermittelt. HBsAg-Konzentrationen in die zwei falsch-negativen Seren wurden 749 IU/ml und 6 IU/ml. Anti-HBc-Antikörper wurden erfolgreich in 176 von 204 (i. e 86,3 %) festgestellt. DBS Eluate. Zweiundzwanzig aus den 28 Exemplare, die nicht durch die Messungen stammt aus Personen mit HIV-Koinfektion entdeckt wurden. So wenn HIV-positive aus der Berechnung ausgeschlossen wurden, wurde eine Sensitivität von 97,1 % erreicht, zum Abrufen von Anti-HBc Antikörper aus eluierten getrocknete ganze venöses Blut. Ähnliche Beobachtungen galt für die Bestimmung des Anti-HBs-Antikörper. Auch nach der Anpassung der der Grenzwert des Assays auf 1,5 IU/l ereignete sich neun diskrepanten Serum DBS Ergebnisse. Bei den Patienten nicht mit HIV Koinfektion wurden Anti-HBs-Serumkonzentrationen von 11 – 26 IU/l gefunden, die waren zu niedrig, um Erkennung nach der Elution von getrocknetem Blut ermöglichen.

Anti-HCV-Antikörper sind Anzeichen einer akuten oder chronischen oder gelöst-Infektion. Nur vier (i. e. 2,2 %) Anti-HCV-falsch-Negative Ergebnisse wurden ermittelt aus DBS Eluate und weitere serologische und molekulare Analysen eindeutig unter Beweis gestellt, dass die jeweiligen Seren von Patienten, sehr wahrscheinlich wurden deren Infektionen seit langem hatte gelöst.

Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern im DBS Eluate mit dem vollautomatischen System war völlig reibungslos die eine analytische Sensitivität von 100 % ergab.

"Mittlere HBV-DNA-Konzentration von Vollblut Eluate erfolgte auf 100 Exemplare (DNA-Konzentration bedeuten: 1.573.898 IU/ml, Reichweite: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) und ergab einen Wert von 93.0 %. So wurden sieben Proben mit niedrigen Serum HBV-DNA-Konzentrationen zwischen 409 und 3.643 IU/ml von der DBS Tests nicht erkannt. Von 100 Seren, die als HCV-RNA positiv erwiesen hatte (HCV-RNA-Konzentration bedeutet: 1.415.944 IU/ml, Reichweite: 2.479 - > 7.692.000 IU/ml), entsprechende Vollblut Aliquote standen zur Verfügung. Die vergleichende Untersuchung ergab eine analytische Sensitivität von 100 % für HCV-RNA Bestimmung von DBS Eluate." ¹⁷

Um die beschriebenen Protokoll für die Vorbereitung und Verarbeitung von DBS unter Feldbedingungen zu testen, diente es in enger Zusammenarbeit mit dem Robert Koch-Institut (Berlin, Deutschland) während der Pilotphase der Studie "Drogen und chronische Infektionskrankheiten", das war auf aktive Drogenkonsumenten in den deutschen Städten Berlin und Essen¹⁸durchgeführt. Alle 534 Teilnehmer eingeschrieben (433 Männer und 101 Frauen) unterzog sich kapillare Blutentnahme wie in Abschnitten 2.2.1 – 2.2.3 des vorhergehenden Protokolls ausführlich beschrieben und DBS wurden, wiederum durch Zugabe von 1.000 µl PBS-Puffer eluiert.

Zwei Personen wurden diagnostiziert, um chronisch mit HBV infiziert werden und 39 zeigten die serologische Muster aufgelöst HBV-Infektion. Außerdem fünfzehn Teilnehmer waren positiv für Anti-HBs (Stand nach der Impfung) und acht erwiesen sich als positiv für Anti-HBc allein sein. Die Anti-HCV-Prävalenz unter den Teilnehmern war 57,3 % (N = 193) in Berlin und 73,0 % (N = 144) in Essen. Von den Antikörper-positiven Proben 65 % (N = 125) und 62 % (N = 89) wurden auch virämische. 25 von 534 Personen für Anti-HIV positiv getestet. Neunzehn der Infektionen waren bereits bekannt und 24 dieser Personen wurden gemeinsam mit HCV infiziert.

Die Ergebnisse von DBS Tests wurden sorgfältig mit der Studienteilnehmer anamnestischen Daten bezüglich der selbstberichteten HBV und HCV Status verglichen. Dieser Vergleich in Verbindung mit den Ergebnissen der Prüfung gekoppelt führte zu geringfügigen Änderungen des Test-Algorithmus für die Hauptphase der "DRUCK-Studie", die aktive Drogenkonsumenten in sechs weiteren deutschen Großstädten Einschreiben wird Serum/DBS-Paare: "Personen infiziert mit HIV immer auf das Vorhandensein von HBV-DNA getestet werden. Teilnehmer deren DBS Eluate für Anti-HBc und Anti-HBs positiv sind sollte zu einer Venenpunktion während einer zweiten Konsultation klären Sie auf jeden Fall ihren Anti-HBc/Anti-HBs-Status unterworfen werden, und zu guter Letzt werden alle DBS-Eluate für HCV-RNA überprüft unabhängig von den Ergebnissen des Anti-HCV testen." ¹⁷

Parameter	Gekoppelte Sera/DBS Eluate (N)	Diskrepanten Ergebnissen (N)	Grund für die Unterschiede zwischen Serum und DBS Eluate testen
HBV
HBsAg	299	2	Zwei Patienten mit chronischer HBV-Infektion. Beide waren unter der antiviralen Behandlung und einer von ihnen war zusammen mit HIV infiziert. HBsAg-Konzentrationen im Serum: 749 IU/ml und 6 IU/ml, beziehungsweise.
Anti-HBc	305	28	Im Serum hatten die zweiundzwanzig Patienten gelöste HBV-Infektion. Sechs Personen zeigten die serologischen Befund "Anti-HBc allein". Zweiundzwanzig der Patienten wurden mit HIV co-infiziert. Aus der "HBV-Resolver", beurteilte zwanzig als "Anti-HBs positiv allein" von DBS zu testen und somit fälschlicherweise als "Zustand nach Impfung" eingestuft wurden.
Anti-HBs	310	9	Die vier Patienten nicht mit HIV Koinfektion hatte Serum Anti-HBs-Konzentrationen von 11 – 26 IU/l, die waren zu niedrig, um Antikörpernachweis nach Elution von getrocknetem Blutflecken zu ermöglichen.
HBV-DNA	150	7	Die jeweiligen Seren hatte von sieben Patienten mit niedrigen Serum HBV-DNA-Konzentrationen von 409 IU/ml bis hin zu 3.643 IU/ml erzielt.
HCV
Anti-HCV	339	4	Diese vier Seren hatten Patienten mit längst gelöst HCV-Infektionen entnommen.
HCV-RNA	150	0	–
HIV
HIV 1-p24/anti-HIV 1/2	209	0	–

Tabelle 1: Ergebnisse von 1.762 DBS, die vorbereitet und verarbeitet aus ganz venöses Blut nach das Protokoll in dieser Mitteilung vorgeschlagen wurden, im Vergleich zu den Erkenntnissen in gekoppelten Serumproben als Referenz.

Diskussion

DBS werden seit 100 Jahren² , aber überraschenderweise gibt es noch kein allgemeiner Konsens über die Vorbereitung und Verarbeitung. Bisher wurde eine ausreichende Standardisierung dieser wichtigen Pre-analytische Phase nur auf dem Gebiet der Neugeborenen-Screening¹⁴, erreicht eine Vielzahl von verschiedenen Protokollen besteht für alle anderen Anwendungen des DBS Tests^{5, 16, 23}. Um diese bemerkenswerte Heterogenität zu überwinden, ist eine umfassende Schritt für Schritt Anleitung für die Vorbereitung und Verarbeitung von DBS in Immunoassays und durch molekulare Techniken genutzt werden in dieser Mitteilung vorgestellt und bewertet im Hinblick auf ihre Wirksamkeit zur Erkennung von Markierungen von HBV, HCV und HIV-Infektionen. Der Fokus der folgenden Diskussion ist in erster Linie auf die verschiedenen Schritte des vorgeschlagenen Protokolls gelegt.

In der Geschichte des DBS testen viele verschiedene Filterpapier Karten wurden gebrauchte² aber heute nur zwei kommerzielle Quellen sind als Medizinprodukte der Klasse II für Blut Sammlung^{5, 16}von der FDA zugelassen. Diese Filter-Kartensysteme sind sehr einheitlich und haben sehr ähnliche Absorptionseigenschaften, so dass analytische Ergebnisse aus Kapillarblut vorbereitet auf eine von ihnen unterscheiden sich nicht von mehr als 4 – 5 %²⁸. Nicht überraschend, Masciotra und Mitarbeiter²⁹ daher erkannt HIV-1-RNA nach Elution von Blut Sammlung Karten aus verschiedenen Quellen mit ein qualitatives Assay gleichermaßen gut. Angesichts dieser Daten, kann es praktisch ausgeschlossen werden, dass jeder die Unterschiede beobachtet, beim Testen Serum/DBS-Paare für Markierungen von HBV, HCV gekoppelt und HIV Infektionen¹⁷ durch die Wahl der Filterkarte allein verursacht wurde. Wenn genaue Quantifizierung eines Analyten unabdingbar ist, Quelle-Source Variation kann nicht mehr vernachlässigbar sein und immer raffiniertere Techniken, z.B.perforiert DBS (PDBS) als eine Methode zur Microsampling³⁰ oder die Vorbereitung der getrocknete Serum Spots müssen (DSS)³¹ anstelle von herkömmlichen DBS¹⁰Tests angewendet werden.

Da nur kleine Mengen Blut für DBS Tests verwendet werden (ein Tropfen Kapillarblut besteht aus etwa 50 µl)^{5, 16}, Variationen in das Probenvolumen sind entscheidend und, zugegeben, um zumindest einige der Unterschiede zwischen serologischen Ergebnisse und des Teilnehmers selbst berichtet HBV und HCV Status während der Pilotphase der "DRUCK-Studie" entfallen auf diese Variable. Der wichtigste Faktor zur Minimierung der "Schwankungen" das Probenvolumen ist zweifellos eine korrekte Technik der kapillare Blutentnahme, die nur durch sorgfältige und Weiterbildung von Fachpersonal²²erreicht werden kann. Darüber hinaus als Maß für die Qualitätskontrolle, sollte alle Labore arbeiten mit DBS bereits eingeleiteten Verfahren zur Identifizierung und anschließend ohne DBS-Exemplare, die als unbefriedigend oder ungültige¹⁶berücksichtigt werden.

Studien in erster Linie im Zusammenhang mit HIV³² und Neugeborenen-Screening³³ haben gezeigt, dass hoher Luftfeuchtigkeit führen zu einem Abbau des Analyten, aber bisher kein Konsens erreicht wurde, hinsichtlich der Frage, wie lange DBS luftgetrocknet werden sollte . Ein Intervall von mindestens 4 Stunden oder vorzugsweise O/N wird in dieser Mitteilung, die daher Bedingungen angenommen, die in der überwiegenden Mehrheit aller relevanten Publikationen^{32, 34} Daten im Speicher des DBS verwendet wurden, um anschließend für HBV und HCV verwendet werden vorgeschlagen testen sind widersprüchlich. Im Jahr 1981, Villa und Mitarbeitern³⁵, die zeitgenössischen analytischen Techniken angewandt, berichtet, dass Lagerung bei RT nicht die Ergebnisse der HBV-Analysen während des gesamten Beobachtungszeitraums von 180 Tagen beeinflussen wären Antikörpertiter > 1/1.000, aber diese DBS nach 15 Tage als Titer im Serum nur 1/100 waren wurde grenzwertig positiv oder auch negativ. Lagerung bei-20 ° C oder 4 ° C hat keine wesentliche Verbesserung geführt. Im Gegensatz dazu eine Studie durchgeführt, dreißig Jahre später³⁶ getestet einer HBV-Positive Probe repliziert, und die Autoren, dass Anti-HBc sowie Anti-HBs-Antikörper bis zu 183 Tage bei RT, stabil blieben, während HBsAg unter den gleichen Bedingungen wurde gefunden falsch-Negative bereits nach 63 Tagen. Im Hinblick auf HBV-DNA-Erkennung von DBS Eluate, die Konzentration der viralen Nukleinsäure wurde für mindestens sieben Tage bei 37 ° C³⁷ stabil oder erwies sich als "resistent" gegen Lagerung bei RT für bis zu drei Wochen³⁸. Prüfung auf Anti-HCV-Antikörper mit zwei handelsüblichen dritten Generation zur Verfügung gestellten Immunoassays³⁹ genaue Ergebnisse für einen Zeitraum von 117 Tage mit DBS Proben bzw. bei-20 ° C, 2 – 8 ° C und 20 – 25 ° C gelagert. Lagerung bei-20 ° C, führten jedoch die niedrigste Variation der optischen Dichte. Anwenden einer vierten Generation Anti-HCV ELISA, d. h. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, im Rahmen des DBS testen, Larrat Et Al. ⁴⁰ beobachtet einen starken Rückgang der analytischen Spezifität nach Speicherung DBS Proben länger als drei Tage bei RT Auf der anderen Seite wurden präzise Testergebnisse mit dem gleichen Kit Nutzung hinterlegte für 60 Tage unter verschiedenen Bedingungen (-20 ° C, 2 – 8 ° C und 22 – 26 ° C) von Brandao und Mitarbeiter⁴¹Proben erhalten. Beobachtungen auf dem absteigenden Ast der HCV-RNA-Konzentrationen im DBS unter verschiedenen Bedingungen reichen von keine signifikante Änderung bei RT für bis zu einem Jahr⁴² zu einem zehnfachen nach vier Wochen bei Umgebungstemperatur⁴³. Unter diesem eher widersprüchlichen Daten zur Stabilität des HBV und HCV-Antigene, Nukleinsäuren und Antikörper zu berücksichtigen, schien es sinnvoll, in das vorgeschlagene Protokoll zu einem Konsens zurückziehen, die früher zur Lagerung von DBS Exemplare für zu verwendende definiert wurde HIV-Test^{15, 30}: für kurzfristige Ablagerung (bis zu zwei Wochen) Antigene, virale Nukleinsäure und Antikörper sind als stabil betrachtet bei RT, während gefrorene Bedingungen optimaler Lagerung für längere Zeit steht.

In der Regel drei Parameter betrachtet werden, bei der Gestaltung einer Elution Protokolls: (1) der Elution Puffer; (2) die Dauer und Temperatur der Elution; (3) der Elution Volume²³. In der überwiegenden Mehrheit aller relevanten Publikationen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) diente eluierenden DBS, und die meisten Autoren hinzugefügt, ein Protein, z.B., Rinderserumalbumin (BSA) oder Tween 20, ein Tensid, um das Assay-Signal durch die Stabilisierung zu verbessern Proteine, wie sie in Lösung und gleichzeitig blockierende unspezifischen Bindung Seiten²³gehen. Nur ein paar Berichte, die verschiedene Elution Puffer im Rahmen des DBS testen direkt vergleichen zu können, stehen zur Verfügung. Villar Et al. ³⁶, z. B.erfasst fast gleichwertige Elution Kapazitäten für alle Puffer verwendet, aber PBS/BSA 0,5 % resultierte in der untersten Ebene der unspezifische Reaktivität. Eine sehr ähnliche Beobachtung erfolgte durch Croom und Kollegen⁴⁴ bei der Anwendung der Probe Verdünnungsmittel von Genetik Systeme rLAV UVP für die Elution von Anti-HCV-Antikörper von DBS. Da das Risiko einer Verschlechterung der Probe in den ersten Stunden nach der Zubereitung des DBS (s.o.) äußerst gering ist, wurde es beschlossen, die Spots O/N bei Raumtemperatur inkubieren und zur Elution durch schonendes Mischen über durchgängige Unterstützung. Dieser Ansatz hat den Vorteil, die den vorherigen Proben ausgestanzt Tag ist direkt übertragbar Routinediagnostik früh am nächsten Morgen²³. Das Volumen des Puffers Elution sollten an die jeweiligen Mindestanforderungen der Assays für spätere Analysen verwendet, um den Verdünnungsfaktor so gering wie möglich zu halten angepasst werden. Eine sorgfältige Optimierung der Elution Bedingungen für jede einzelne Analyten war jedoch nicht in der vorhergehenden Bewertung möglich, weil ein hoher Probendurchsatz musste während der "DRUCK-Studie"¹⁷in vergleichsweise kurzer Zeit gewährleistet sein. Infolgedessen wurde der eher ungünstige Volumen von 1.000 µl PBS-Puffer verwendet, um die ganze Elution für alle Parameter in zwei separate Vorgänge abzuschließen.

Diesen Ansatz scheitert einerseits "komplett in das Anti-HBc/Anti-HBs-System für diejenigen Personen, die mit HIV infiziert, aufgrund der niedrigen Antikörper-Konzentrationen; ... und es benötigt molekularen biologischen Verfahren mit optimaler analytische Empfindlichkeit in Bezug auf HBV-DNA und HCV-RNA-tests. " ¹⁷ auf der anderen Seite erwies sich das hohe Elution Volumen in keiner Weise nachteilig für die Bestimmung von HBsAg, Anti-HCV und Anti-HIV durch die Kits in der Bewertung verwendet. "Der Nachweis von HBsAg-positiven Materialien aus Vollblut Eluaten ist es gelungen, mit einer Empfindlichkeit von 98,6 % ähnlich stark wie in früheren Studien, die teilweise ein viel kleineres Elution Volumen 100 µl, 250 µl oder 600 µl oder 500 µl verwendet hatte"^{17 ,36, 45, 46}. Die Empfindlichkeit von 97,8 % bestimmt bei der Untersuchung von 179 Serum/DBS-Paare für Anti-HCV-Antikörper zu den Ergebnissen der bereits bestehenden entsprach Berichte^{24, 44, 47, 48, 49}, die mit einem Elution Volumen gearbeitet hatten, die um den Faktor 5 bis 10 niedriger war. "Darüber hinaus hatte die Protokolle für Anti-HCV-Erkennung entsprechend optimiert, indem Sie ihre eigenen Cut-off-Punkte festlegen...",^{17, 24, 48, 49} "oder durch die Erhöhung der Probenvolumen von 20 µl bis 100 µl." " ^{17, 49} schließlich die analytische Spezifität und Sensitivität (100 %) für Anti-HIV-Erkennung festgelegt wurden, größer oder gleich zu den Leistungsmerkmalen von anderen Immunoassays speziell auf DBS testen,^{50, 51} "oder eine schrittweise Verfahren mit dem kombinierten Einsatz von mehreren Anti-HIV-Tests"^17,52. "sie, übertroffen in der Tat auch der Leistungsnachweis eine Probe, die hatte speziell entwickelt und optimiert für den Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern im DBS Eluate (Q-verhindern, dass HIV 1 + 2 DBS-Kit)." " ^{17, 53}  

Zusammen genommen, das umfassende Schritt für Schritt Protokoll dieser Mitteilung erwies sich als ein machbar und benutzerfreundliches Werkzeug für die Erstellung und Verarbeitung von DBS und kann somit zuverlässig in der diagnostischen Virologie verwendet werden. Es ermöglicht Ansätze mit Automatisierung ⁵⁴ und aufgrund ihrer ausgezeichneten Leistungsmerkmale hat das Potenzial, als eine Art der Grundstein für eine zukünftige allgemein anerkannten Konsens-Protokoll im globalen Bereich der DBS Tests im Labor dienen Medizin.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Latex-Gummihandschuhe	Hartmann	#4049500041515
70% Isopropylalkohol	Bode Chemie	#9768050
Mulifly Sicherheitskanüle	Sarstedt	#85.1638
EDTA-Blutentnahmeröhrchen	Sarstedt	#02.1066.001
Pflaster	Hartmann	#2994163
Trockenes Mullkissen	Hartmann	#143213
Singel-use Sicherheitslanzette	Owen Mumford	#3802421
Filterpapierkarte	Whatman/sigmaaldrich	#10534612	Filterpapierkarte Klasse 903
Einweg-Pipettenspitzen	Starlab	#S1126-7810, #S1120-8810
Reißverschlusstasche	Flexico	#20219
Mini-Trockenmittelbeutel	Tropack	#-
Einweg-Stanze	pfmmedical	#48601	6,0 mm Einweg-Biopsie-Stanze
Einweg-Pinzette	Servoprax	#H7301
12-Well-Zellkulturplatte	Greiner	#665180
PBS Buffer	Gibco	#14190-136
Tween 20	Applichem	#A1389.0500
Natriumazid	Merck	#66880250
Safe-Lock Tuben, 1,5 ml	Eppendorf	#30120086
ARCHITECT HBsAg (quantitativ)	Abbott	#6C3642
ARCHITECT anti-HBc II	Abbott	#8L4425
ARCHITECT anti-HCV	Abbott	#6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo	Abbott	#4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit	Roche	#6374891001
artus HBV LC PCR Kit	Qiagen	#4506063 (24 Tests), #4506065 (96 Tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD	Siemens Healthcare	#2554311