Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Quantitative Nucleinsäureamplifikation ist eine wichtige Technik für den Nachweis von Umwelt, Lebensmittelvergiftungen und Wasser übertragenen Krankheitserregern sowie in der klinischen Diagnostik. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist der Goldstandard für empfindliche, spezifische und quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren, beispielsweise für HIV-1-Viruslasttest Nachweis bakterieller Erreger, und Screening auf vielen anderen Organismen 1 – 3. Während der qPCR, Primer amplifizieren pathogene DNA in Zyklen, und ein Fluoreszenzsignal erzeugt, das proportional zu der Menge der amplifizierten DNA in der Probe bei jedem Zyklus ist. Eine Probe, die eine unbekannte Konzentration von Pathogen-DNA kann unter Verwendung einer Standardkurve, die die anfängliche DNA-Konzentration von Standardproben und den Zeitpunkt, an dem das Fluoreszenzsignal einen bestimmten Schwellenwert erreicht (dh der Schwellenwert-Zyklus oder C T) bezieht quantifizieren.
<p class="Jove_content"> Aufgrund der qPCR erfordert teure Temperaturwechsel Geräte und mehrere Stunden, um Ergebnisse, alternative isothermen Amplifikationsverfahren wie Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) zu erhalten, sind entwickelt worden 4. Diese Plattformen bieten in der Regel schneller Ergebnisse und verstärken Nukleinsäuren auf einem niedrigeren, einzigen Temperatur, die mit preiswerter, einfacher Ausrüstung durchgeführt werden kann. RPA, der für Point-of-Care-Anwendungen besonders attraktiv ist, verstärkt DNA in Minuten, benötigt eine geringe Verstärkung Temperatur (37 ° C) und bleibt in der Anwesenheit von Verunreinigungen 5,6 aktiv. RPA-Assays sind für eine Vielzahl von Anwendungen entwickelt, darunter Lebensmittelanalyse, Nachweis von Krankheitserregern, Krebs Wirkstoff-Screening, und die Aufdeckung von biothreat Agenten 7-12. Jedoch wird die Verwendung von RPA zur Quantifizierung von Nukleinsäuren wurde beschränkt 13,14.In früheren Arbeiten war es shown die quantitative Echtzeit-RPA (qRPA) möglich ist 15. Hier wird eine detailliertere Protokoll für die Verwendung von Echtzeit quantitative RPA zu unbekannten Proben mittels einer Standardkurve, eine Methode, die analog zur Quantifizierung mit qPCR Quantifizierung zur Verfügung gestellt. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein RPA-Reaktion auf einem Thermocycler sowie wie eine interne positive Kontrolle (IPC), um das System sicher, ordnungsgemäß funktioniert Entwicklung durchzuführen, um HIV-1-DNA als Proof-of-concept erfassen. Datenerfassung unter Verwendung eines Thermocyclers oder Mikroskop und die Datenanalyse für die Konstruktion einer Standardkurve unter Verwendung von Trainingsdaten werden auch beschrieben. Schließlich wird das Verfahren zur Quantifizierung von unbekannten Proben anhand der Standardkurve mit einem benutzerdefinierten Skript demonstriert. Diese qRPA Technik ermöglicht die Quantifizierung von Proben mit unbekannter Konzentration und hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Echtzeit-qPCR.
1. Programmieren Sie den Thermocycler für die Echtzeit-Reaktionen qRPA
2. Bereiten Sie sich auf HIV-1 qRPA Experimente
3. Setzen Sie eine HIV-1 qRPA Standardkurve
4. Entwickeln Sie eine interne Positivkontrolle
5. Aufbau einer Standardkurve aus mehreren Experimenten
6. Assay-Validierung und Quantifizierung unbekannter Proben imDie Standardkurve
7. Vorbereitung der Datenerfassung mit einem Fluoreszenzmikroskop und ein beheiztes Chip
8. Datenerhebung und Analysis mit einem Fluoreszenzmikroskop
Um aussagekräftige Quantifizierung Daten mit Hilfe des MATLAB-Algorithmus zu erhalten, muss der Benutzer bei der Aufforderung entsprechenden Eingabewerte auswählen. Nach Beginn jedes Skript in den Abschnitten 5 und 6 werden alle Eingangsgrößen automatisch im Befehlsfenster erbeten und Ausgänge werden automatisch generiert. In Abschnitt 5.7 wird der Benutzer aufgefordert, einen Schwellenwert für die Steigung zu wählen. Der Wert der Steigung Schwelle wirkt das Quadrat des Korrelationskoeffizient (r 2) des Passform. Bei der Verwendung von rohen Fluoreszenzdaten von einem Thermocycler exportiert, Werte zwischen 2,0 und 5,0 sind in der Regel einen hohen r 2 Koeffizienten ergeben. In Abschnitt 5.8 muss der Benutzer die Anzahl der Standardabweichungen über dem Hintergrund zu benennen, um die positive Schwelle. Um eine Probe als positiv oder negativ punkten, das Skript die Differenz Δ Probe zwischen der maximalen und minimalen Fluoreszenz für jede Probe mit den rohen Fluoreszenzdaten vom therma exportiert bestimmt automatischl Cycler. Es berechnet die durchschnittliche Differenz Δ Hintergrund und Standardabweichung σ Hintergrund für alle nicht-Zielkontrollproben. Eine Probe gilt als positiv, wenn Δ Probe mehr als z × σ Hintergrund oben Δ Hintergrund. In Abschnitt 5.10 entscheidet der Benutzer, ob die Standardschwelle verwenden oder einen neuen Grenzwert. Wenn der Benutzer eine neue Schwelle wünscht, bestimmen die neuen Schwellenwert experimentell durch Ausführen 3 Versuche mit jeweils 12 RPA Reaktionen ohne HIV-1-DNA vorhanden. Stellen Sie die Schwelle, bei der durchschnittlichen Erhöhung der Fluoreszenzintensität aus diesen Experimenten plus 3 Standardabweichungen. Nach § 6, das Skript JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m automatisch wieder den geschätzten DNA-Konzentration für jeden qRPA Reaktion (in log10 Kopien). Wenn das Skript bestimmt, dass keine HIV-1-DNA in der Probe vorhanden war, wird die geschätzte Konzentration entweder als "Ne aufgeführtengative für HIV "oder" Invalid ", je nachdem, ob das Fluoreszenzsignal für das interne positive Kontrolle die Schwelle (z × σ Hintergrund + Δ Hintergrund). Wenn der Benutzer die Validierung der Standardkurve mit bekannten Probenkonzentrationen wird das Skript außerdem eine zusätzliche Tabelle ähnlich der Tabelle 1 zurückzukehren.
Um ein Echtzeit-RPA-Assay, der genaue Quantifizierung bietet entwickeln, ist experimentell Konsistenz von entscheidender Bedeutung. Verwenden Sie zum Beispiel die gleichen Primer und Sonde Aliquots sowohl für die Standardkurve und Validierungsexperimente. Auch vermeiden Gefrier-Auftau-Zyklen, indem die Primer und Sonde Aliquots bei 4 ° C zwischen den Experimenten eher als -20 ° C. Die Vorlagen Aliquots für die Standardkurve und Validierungsexperimente verwendet werden, in der gleichen Weise gelagert. RPA Enzymgranulat und Reagenzien aus der gleichen Charge werden nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Schließlich becabenutzen RPA fehlt true 'Zyklen' genau zu steuern die Rate der Verstärkung, ist die Standardisierung der Benutzerschritte zwingend erforderlich. Bei der Montage von Reaktionen, muss der Benutzer immer die gleichen Schritte in der gleichen Reihenfolge, die Ausgaben in etwa die gleiche Menge an Zeit auf jedem Schritt. Reaktionen stets leicht mit einer neuen Pipettenspitze vermischt werden, und Blasen immer beseitigt werden. Vor der Verstärkung muss Reaktionen bei konstanter Temperatur gehalten werden, und der Thermocycler oder Mikroskop-Software muss immer vor dem Laden Reaktionen auf jede Verstärkung bei suboptimalen Temperaturen Quantifizierung beeinflussen könnten, zu vermeiden, hergestellt werden. Jede Änderung in der Anfangsreaktionsbedingungen können zu Inkonsistenzen in der experimentellen Ergebnissen führen.
Bei der Verwendung eines Mikroskops, Daten zu sammeln, müssen zusätzliche Variablen gesteuert werden, um Schwankungen in der Fluoreszenzintensität zu minimieren. Alle Reaktionen sind in der gleichen Region auf der Bühne wärmeren platziert werden, und die microscope müssen auf dem gleichen Bereich der Wanne für jede Probe fokussiert werden. Auch wenn diese Praktiken berücksichtigt werden, kann Fluoreszenzdaten auf einem Mikroskop gesammelt Variabilität aufgrund der örtlichen Lichtblicke, die natürlich während der RPA Reaktionen, Blasenbildung in den Reaktionskammern oder Bleichen von wiederholter Exposition gegenüber Anregungslicht resultierende bilden aufweisen. Der Einfluß dieser Variablen ist offensichtlich in der Fluoreszenzdaten auf dem Mikroskop (4A und 4B) gesammelt, die Nullinienschwankung, Spitzen und Mulden zu demonstrieren. Diese Merkmale fehlen bei der Fluoreszenzdaten auf dem Thermocycler (3A und 3B) gesammelt. Letztlich ist die Datenerhebung unter dem Mikroskop auf Proof-of-Prinzip nur Zwecken und die endgültige Test wird auf einem Feld operablen Fluoreszenz-Reader mit präziser Geometrie und Software-Steuerung, die diese Variablen minimiert umgesetzt werden.
Ein weiterer wichtigerAspekt der qRPA Assay-Entwicklungsprozess ist die Konsistenz in der Datenverarbeitung. Das in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, Protokoll verwendet Skripte rohen Fluoreszenzdaten (in einer Tabelle gespeichert wird) aus einem Thermocycler oder Mikroskop gesammelt verarbeiten. Alle Experimente verwendet, um die Standardkurve zu erstellen müssen identisch formatiert. Bei Verwendung eines Thermocyclers, Daten zu sammeln, muss dieselbe Plattenlayout verwendet werden, und die Daten aus Brunnen, die RPA Reaktionen nicht enthalten darf nicht exportiert werden. Bei der Verwendung eines Mikroskops, um Daten zu sammeln, muss das Format der Daten, die das Format der Daten automatisch aus dem Thermocycler ausgeführt übereinstimmen. C61 und Daten zur Erhöhung Matrizenkonzentrationen müssen Zellen D2: D61, E2: Zum Beispiel müssen die nicht-target-Steuerdaten in den Zellen C2 sein E61 usw. Wenn es mehrere Wiederholungen jeder Konzentration in einem Experiment, der 2. replizieren Verdünnungsreihe muss von links nach rechts ab, ohne Zielsteuerung (NTC), um höchste Konzentration bestellt werden undin den Spalten unmittelbar rechts des 1. gespeichert replizieren Verdünnungsreihe. Zum Beispiel wird in dem Plattenlayout in Abschnitt 1.2 mit 2 verwendet Wiederholungen für jede Probe, Fluoreszenzdaten für die 1. Wiederholung jeder Probe in der Verdünnungsreihe ist in den Zellen C2 gespeichert werden: H61 und Fluoreszenzdaten für die 2. Wiederholung jeder Probe in Die Verdünnungsreihe muss in Zellen I2 gespeichert werden: N61. Für die Plattenbelegung in Abschnitt 1.2 verwendet, ist dies die Standardformatierung beim Exportieren von Daten aus dem Thermocycler-Software in eine Tabellenkalkulation.
Von HIV-1 qRPA Experimente lieferten repräsentativen Daten zeigen proof-of-concept-Unterstützung, die RPA kann zur Quantifizierung von Nukleinsäurekonzentration in unbekannten Proben verwendet werden. Klinisch nützlichen HIV-1-Virusbelastungstests haben eine klinische Bereich von mindestens 4 Grßenordnungen, eine Genauigkeit von 0,5 log10 Kopien und ein Limit-of-Nachweis von mindestens 200 Kopien 19,20. Die beschriebene HIV-1-DNA-Test erfüllt diese criteria und ist am genauesten in niedrigen Konzentrationen, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Daher ist bei der Aufnahme von einer reversen Transkriptase Schritt, legen diese Ergebnisse nahe, dass ein HIV-1-RT-RPA Assay kann das Potenzial für HIV-1-Viruslast in messen klinischen Proben. Bei der Entwicklung eines qRPA Assay Anpassung der Algorithmus-Parameter kann Abstimmung der Empfindlichkeit und linearen dynamischen Bereich, je nach klinischen Anforderungen. Abbildung 6 zeigt, dass die Anpassung z (ein Parameter, der die Schwelle für positive Proben bestimmt) kann die Empfindlichkeit und Genauigkeit bei niedrigen und hohen Einfluss Zielkonzentrationen. Ferner kann es möglich sein, die Auflösung und die Genauigkeit der Quantifizierung durch Inkubieren Reaktionen bei einer niedrigeren Temperatur oder unter Verwendung von weniger Magnesiumacetat, wodurch die Rate der Amplifikation abnimmt erhöhen.
Dieser Beweis des Konzeptes qRPA Test kann verwendet werden, um die Konzentration von Proben, die HIV-1-DNA zu quantifizieren. Die in dieser ma beschrieben qRPA Assaynuscript enthält detaillierte Anweisungen, wie Echtzeit-RPA Reaktionen montieren, zu entwickeln und zu screenen eine IPC und verarbeiten rohen Fluoreszenzdaten um eine Standardkurve, die verwendet werden können, um Quantifizierung unbekannter Proben zu bauen. Durch die enthaltenen detaillierten Anweisungen, kann dieses Protokoll angepasst ist, um DNA-Konzentration in einer Vielzahl von Proben zu quantifizieren.
The authors have nothing to disclose.
qRPA Assay | |||
HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | |
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
IPC Development | |||
Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Microscope Experiments | |||
Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
Data Analysis | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
MATLAB | MATLAB | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
Adobe Illustrator | Adobe | ||
JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
AxioVision software | Zeiss | ||
JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |