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Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

Quantitative Nucleinsäureamplifikation ist eine wichtige Technik für den Nachweis von Umwelt, Lebensmittelvergiftungen und Wasser übertragenen Krankheitserregern sowie in der klinischen Diagnostik. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist der Goldstandard für empfindliche, spezifische und quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren, beispielsweise für HIV-1-Viruslasttest Nachweis bakterieller Erreger, und Screening auf vielen anderen Organismen ^{1 – 3.} Während der qPCR, Primer amplifizieren pathogene DNA in Zyklen, und ein Fluoreszenzsignal erzeugt, das proportional zu der Menge der amplifizierten DNA in der Probe bei jedem Zyklus ist. Eine Probe, die eine unbekannte Konzentration von Pathogen-DNA kann unter Verwendung einer Standardkurve, die die anfängliche DNA-Konzentration von Standardproben und den Zeitpunkt, an dem das Fluoreszenzsignal einen bestimmten Schwellenwert erreicht (dh der Schwellenwert-Zyklus oder C _T) bezieht quantifizieren.

<p class="Jove_content"> Aufgrund der qPCR erfordert teure Temperaturwechsel Geräte und mehrere Stunden, um Ergebnisse, alternative isothermen Amplifikationsverfahren wie Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) zu erhalten, sind entwickelt worden ^4. Diese Plattformen bieten in der Regel schneller Ergebnisse und verstärken Nukleinsäuren auf einem niedrigeren, einzigen Temperatur, die mit preiswerter, einfacher Ausrüstung durchgeführt werden kann. RPA, der für Point-of-Care-Anwendungen besonders attraktiv ist, verstärkt DNA in Minuten, benötigt eine geringe Verstärkung Temperatur (37 ° C) und bleibt in der Anwesenheit von Verunreinigungen ^5,6 aktiv. RPA-Assays sind für eine Vielzahl von Anwendungen entwickelt, darunter Lebensmittelanalyse, Nachweis von Krankheitserregern, Krebs Wirkstoff-Screening, und die Aufdeckung von biothreat Agenten ^7-12. Jedoch wird die Verwendung von RPA zur Quantifizierung von Nukleinsäuren wurde beschränkt ^13,14.

In früheren Arbeiten war es shown die quantitative Echtzeit-RPA (qRPA) möglich ist ^15. Hier wird eine detailliertere Protokoll für die Verwendung von Echtzeit quantitative RPA zu unbekannten Proben mittels einer Standardkurve, eine Methode, die analog zur Quantifizierung mit qPCR Quantifizierung zur Verfügung gestellt. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein RPA-Reaktion auf einem Thermocycler sowie wie eine interne positive Kontrolle (IPC), um das System sicher, ordnungsgemäß funktioniert Entwicklung durchzuführen, um HIV-1-DNA als Proof-of-concept erfassen. Datenerfassung unter Verwendung eines Thermocyclers oder Mikroskop und die Datenanalyse für die Konstruktion einer Standardkurve unter Verwendung von Trainingsdaten werden auch beschrieben. Schließlich wird das Verfahren zur Quantifizierung von unbekannten Proben anhand der Standardkurve mit einem benutzerdefinierten Skript demonstriert. Diese qRPA Technik ermöglicht die Quantifizierung von Proben mit unbekannter Konzentration und hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Echtzeit-qPCR.

Protocol

1. Programmieren Sie den Thermocycler für die Echtzeit-Reaktionen qRPA

1. Erstellen Sie ein neues Protokoll in den Thermocycler Software.
   1. Legen Sie eine Vorinkubationsschritt: 39 ° C für 1 min.
   2. Hinzufügen einer zweiten Stufe: 39 ° C für 20 sec, gefolgt von einer Platte zu lesen.
   3. Schließlich legen Sie ein, dass der zweite Schritt wiederholt sich 59 mal mehr "to go".
   4. Speichern Sie das Protokoll.
2. Erstellen Sie eine neue Platte in der "Platteneditor" Registerkarte der Software. Wählen Vertiefungen auf der Platte entsprechend den Stellen der RPA-Reaktionen (hier Verwendung Vertiefungen A1, A4-A8, B1 und B4-B8).
   HINWEIS: Es ist nicht wichtig, ob die Probe Art der Wells (zB "Standard", "NTC") festgelegt ist, wie die Datenanalyse wird mit einem benutzerdefinierten Skript getan.
   1. Für Experimente, die nur HIV-1-DNA, wählen Sie die "HEX" Fluorophor für alle Vertiefungen. Für Experimente, die HIV-1-DNA und eine interne positive Zusammenarbeitntrol, sowohl "HEX" und "FAM" Fluorophore für alle Vertiefungen. Speichern Sie die Platte.

2. Bereiten Sie sich auf HIV-1 qRPA Experimente

1. Montieren RPA Reaktionen in einem bestimmten Vorverstärkung Arbeitsbereich enthält bezeichnet Pipetten, Pipettenspitzen, Vortexer und Mini-Zentrifuge, wie qPCR. Wie RPA kann eine einzelne Kopie der DNA um mehr als zehn Größenordnungen zu verstärken (Daten nicht gezeigt), Handhabung und Entsorgung von Röhrchen, die post-amplifizierte DNA-Produkte in einem bestimmten Nachverstärkung Bereich.
   1. Verhindern Sie den Kontakt zwischen allen Vorverstärkung Reagenzien und Post-Amplifikationsprodukte. Spray Vorverstärkung Arbeitsbereiche und Ausrüstung mit 50% Bleichmittel vor und nach allen Experimenten. Verwenden Sie ein Papiertuch abwischen überschüssiges Bleichmittel.
2. Kauf Forward-Primer-Sequenz 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'und Reverse-Primer-Sequenz 5'-CCC GAA AAT TTT TTT GAA TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'aus kommerziellen DNA-Synthesizern. Kaufen Sie die Sondensequenz 5'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C-3 'aus kommerziellen Quellen. Speicherung aller Primer und Sonden bei 4 ° C in Aliquots mit einer Konzentration von 10 & mgr; M vor der Verwendung.
   HINWEIS: Die qRPA Assay verstärkt ein einzigartiges HIV-1-Sequenz. Aus diesem Proof-of-Concept-Test, mit dem von Sutton et al., Die die Zielsequenz ¹⁶ enthält beschriebene Plasmid pHIV-IRES eYFPΔEnvΔVifΔVpr. Für qRPA Experimenten wurde das Plasmid bei 4 ° C in Aliquots, die 1, 10, 10 ^2, 10 ³ und 10 ⁴ Kopien pro ul in einem Puffer, der 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA bei pH 8,0 gelagert und 1 ng / ul humanen genomischen DNA-Träger (360.486). Dieser Träger-DNA-Konzentration ist äquivalent zu der von kommerziellen Serum DNA Extraktionskits für HIV-1-Diagnose ¹⁷ verwendet erhaltenen DNA-Konzentration. Diese HIV-1Verdünnungen wurden verwendet als Template in qRPA Reaktionen, um eine Standardkurve zu erstellen.

3. Setzen Sie eine HIV-1 qRPA Standardkurve

1. Vor der Montage der qRPA Reaktionen, bereiten Sie die Vorverstärkung Arbeitsbereich, wie in Schritt 2.1.1 beschrieben. Legen Sie einen 96-Loch-Kühlblock in Lagerung bei 4 ° C.
2. Bereiten Reagenzien für 12 Reaktionen:
   1. Bewegen Sie den Magnesiumacetat, die Rehydrationspuffer und 12 RPA Reaktions Pellets zur Vorverstärkung Arbeitsbereich.
   2. Auftauen Magnesiumacetat und die Rehydratation Puffer bei Raumtemperatur.
   3. Aliquot 32,5 ul Magnesiumacetat (2,5 & mgr; l pro Reaktion), um ein Mikrozentrifugenröhrchen.
   4. Bereiten Sie eine 13x Mastermix. Fügen 383,5 ul der Rehydrationspuffer (29,5 ul pro Reaktion) auf einen separaten Mikrozentrifugenröhrchen für die Master-Mix. In 41,6 ul Nuklease-freies Wasser (3,2 & mgr; l pro Reaktion), um den Master-Mix. Mischen Sie den Master-Mix.
   5. Schicken Sie das Magnesium acetate und Rehydrationspuffer zur Lagerung bei -20 ° C.
   6. Verschieben Sie die Primer- und Sondenteilmengen aus dem Kühlschrank auf die Vorverstärkung Bereich, Vermeidung übermäßiger Lichtexposition Ausbleichen minimieren.
   7. In 27,3 ul jeder der 10 uM Vorwärts- und Rückwärtsprimer (2,1 ul pro Primer pro Reaktion), um den Master-Mix.
   8. In 7,8 ul der 10 uM HEX-markierten HIV-1-DNA-Sonde (0,6 & mgr; l pro Reaktion), um den Master-Mix.
   9. Zurück Primer und Sonde zur Lagerung.
3. Passend zu den in Abschnitt 1.2 Plattenlayout, lege 1 Enzym Pellet in jedem der äußersten linken Rohren und ein Enzym Pellet in jedem der 5 ganz rechts Rohre der 2 niedrigen 8-well PCR-Gefäßstreifen.
4. 37,5 ul des Master-Mix Vorsichtig in jedes Röhrchen, die ein Enzym Pellets, mit einer neuen Pipettenspitze für jedes Röhrchen und leichtem Rühren die Master-Mix und Pellet mit der Spitze, bis das Pellet vollständig aufgelöst ist. Rühren Sie vorsichtig um Blase formati verhindernauf, und entfernen Sie die Spitze vorsichtig, um den Verlust des Reaktionsvolumens zu verhindern.
5. Nachdem alle Enzympellets wurden mit dem Master-Mix rehydriert wurde, rufen Sie die 96-Loch-Kühlblock von 4 ° C Lagerung. Legen Sie die Strips PCR-Gefäße im Kaltblock, um den Master-Mix zu kühlen.
6. Während der Master-Mix ist die Kühlung, laden Sie den Thermocycler-Software mit dem Protokoll und Platte in Abschnitt 1 beschrieben.
7. Schneiden Sie 2 Streifen aus durchsichtigem Kunststoff Mikrosiegelkleber etwas breiter als die PCR-Röhrchen zu sein, und Abrufen 2 Flach PCR-Röhrchen Streifen Deckel.
8. Abrufen 6 Vorlage Aliquots aus dem Speicher (enthaltend 0, 1, 10 ^1, 10 ^2, 10 ³ oder 10 ⁴ Kopien des HIV-1 Plasmid pro Mikroliter).
9. In 10 ul jeder Vorlage, um die für diese Vorlage Konzentration bezeichnet Rohre. Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze für jedes Röhrchen vorsichtig Rühren der Lösung mit der Spitze, um den Master-Mix und Vorlage mischen. Achten Sie darauf, die Vorlage an die richtige Stelle, um m hinzufügenATCH die in Abschnitt 1.2 Plattenlayout.
10. Stellen Sie sicher, dass ein PCR-Röhrchen Streifen Adapter für die Mikro vorhanden ist.
11. Verzichtet werden 2,5 ul Magnesiumacetat in jedes Röhrchen Deckel, der auf einem Rohr, das eine qRPA Reaktion gebracht wird.
12. Sanft legen Sie die Deckel auf der Oberseite der PCR-Röhrchen, so dass sie nicht vollständig versiegelt und können entfernt werden. Das Magnesiumacetat wird den Deckel zu halten und klar sein, von oben sichtbar.
13. Legen Sie jedes PCR-Röhrchen-Streifen mit Deckel in jeder Seite des PCR-Röhrchenhalter. Schließen Sie den Deckel des Minifuge die Magnesiumacetat aus den Deckel und in die RPA-Reaktion zu spinnen, die Einleitung des RPA-Reaktion. Zentrifugieren, bis alle Luftblasen beseitigt werden und die gesamte Flüssigkeit wird in den Boden eines jeden Rohres (ca. 10 sec) gesammelt.
14. Schnelles Entfernen Sie die Strips PCR-Gefäße und bringt sie zum kalten Block, um die qRPA Reaktionen zu stoppen.
15. Entfernen Sie vorsichtig den Deckel, um die Bildung von Aerosolen zu verhindern und zu versiegeln jedes PCR-Röhrchen-Streifen mit dem SchnittStücke von klaren Mikrosiegelfolie.
16. Schnell zu Fuß zum Cycler entnommen und die beiden Strips PCR-Gefäße in den Thermocycler an den Standorten passend zur Plattenlayout (Wells A1-B8). Schließen Sie den Deckel des Thermocyclers, klicken Sie auf "Start Ausführen" wählen und einen Dateinamen für das Experiment.
    HINWEIS: Der Hersteller empfiehlt Schütteln der Probe nach 5 Minuten Inkubation, ist dieser Schritt nicht für diesen bestimmten Test notwendig und kann weggelassen werden.
17. Nachdem der Lauf beendet ist, wählen Sie "Einstellungen", "Basiseinstellung", "No Baseline Subtraktion", um die rohen Fluoreszenzdaten anzuzeigen. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm, indem Sie "Export", "Exportieren Sie alle Datenblätter in Excel." Eine Datei mit dem Zusatz "Quantifizierung Amplification Ergebnisse" wird mit den unbeEchtZeit-Fluoreszenzdaten erstellt werden.

4. Entwickeln Sie eine interne Positivkontrolle

1. Wählen einer DNA-Sequenz aus einer Spezies, die wahrscheinlich in der Zielprobe zu finden ist. Die Sequenz braucht länger zu sein als der Ziel Amplikon so dass die Erzeugung der Zielsequenz wird bevorzugt.
   HINWEIS: Für diesen Test Cryptosporidium parvum, einem Darm-Parasiten, wurde ausgewählt, um als Vorlage für die Erzeugung des IPC-Sequenz dienen, weil dieser Organismus ist unwahrscheinlich, dass im Blut gefunden werden und wurde im Labor aus einem anderen Projekt zur Verfügung. Um den IPC Sequenz zu erzeugen, extrahieren und zu reinigen DNA von C. parvum Oozysten wie anderswo ¹⁸ beschrieben.
2. Kaufen Sie den zukunfts (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') und rückwärts (5'CCC GAA AAT TTT TTT GAA TTG TAA TTT TTT GTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA-3 ') Primer, die aus kommerziellen Quellen. Die in diesem Test verwendeten IPC PCR-Primer sind in Figur 1 gezeigt und enthalten eine Region, die komplementär zu der IPC Vorlage D istNA (beispielsweise C. parvum, lila in Abbildung 1) und eine Region, die komplementär zu der Zielorganismus (zB HIV-1, blau in Abbildung 1).
3. Führen PCR unter Verwendung der Primer und IPC-Matrizen-DNA.
   1. Montieren Sie 50 ul PCR-Reaktionen mit den Kit-Reagenzien Phusion High-Fidelity DNA Polymerase nach den Anweisungen des Herstellers, ohne die Polymerase. Verwenden Sie 2 ul DNA-Template und Phusion Buffer HF.
   2. Hinzufügen des Phusion Polymerase jede Reaktion nach einem Warmstart bei 98 ° C, gefolgt von 60 sec bei 98 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 15 sec bei 98 ° C, 30 sec bei 62 ° C und 30 sec bei 72 ° C mit einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 5 min. Nach Temperaturwechselbeanspruchung, halten Proben bei 4 ° C.
   3. Analysieren Proben durch Gelelektrophorese auf einem 2% TAE Agarosegel und dann extrahieren und zu reinigen DNA unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit gemäß der Mikroprotokoll enthaltenendas Kit.
4. Bildschirm des IPC Kandidaten für ihre Fähigkeit zu verstärken mit qRPA.
   1. Bereiten qRPA Reaktionen wie in Abschnitt 3 beschrieben, mit HIV-1-Primer, ein FAM-markierten Sonde spezifisch für die IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ATA CAG ACA GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A-3 ') und insgesamt 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ⁴ oder 10 ⁵ Kopien jeder IPC Kandidaten pro Reaktion, die Prüfung aller Konzentrationen in zweifacher Ausfertigung.
   2. Wählen Sie das IPC Kandidaten, die die meisten konsequent verstärkt und hat die niedrigste Grenze-of-Erkennung.
5. Co-Amplifikation von HIV-1 und das IPC, um die optimale Konzentration von IPC-DNA zu bestimmen.
   1. Ähnlich wie bei Abschnitt 3, kombinieren die folgenden in jeder 50 ul Reaktion: 29,5 ul Rehydrationspuffer, 2,1 ul von RPA der Vorwärts-Primer [10 uM], 2,1 ul von RPA Reverse-Primer [10 uM], 0,6 ul von HIV-1 HEX -markierten Sonde [10 uM], 10 & mgr;von HIV-1-DNA in verschiedenen Konzentrationen, 2,5 & mgr; l Magnesiumacetat und 1 Enzympellets. Anstelle der Zugabe von 3,2 & mgr; l Nuklease freiem Wasser, wie es in Schritt 3.2.4 durchgeführt, fügen 0,6 ul IPC FAM-markierten Sonde [10 uM], und 2,6 ul der IPC-DNA. Verwenden Sie die IPC Konzentration, die Grenz-of-Detektion (LOD) ist, wenn qRPA mit IPC-DNA alleine (LOD definiert als die niedrigste Konzentration, wo die Menge der Fluoreszenz-Erzeugungs größer als die durch die von den Proben mit erzeugte Fluoreszenz erzeugte geführt keine Ziel-DNA).
   2. Die Proben unter Verwendung der in Kapitel 1.1 beschriebenen Protokoll.
   3. Wenn der IPC nicht in jeder Probe zu verstärken, sollten Wiederholung des Experiments mit einem IPC-Konzentration um eine Größenordnung höher. Die optimale Konzentration von IPC-DNA für das HIV-1-Test von 10.000 Kopien / & mgr; l. Während Proben werden als gültig angesehen, wenn es entweder IPC oder HIV-1-DNA-Amplifikation, zeigt idealerweise die IPC nachweisbaren Amplifikation fürjede Reaktion.

5. Aufbau einer Standardkurve aus mehreren Experimenten

1. Stellen Sie sicher, die Daten für jedes Experiment wurde in ein Tabellenkalkulationsprogramm exportiert worden, wie in Abschnitt 3.13 beschrieben.
2. Offene und führen Sie das Skript "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Alle Eingaben werden automatisch im Befehlsfenster aufgefordert werden. Nachdem das Skript gestartet wird, wird der Benutzer automatisch aufgefordert, die "Anzahl der Datendateien" bezeichnen, verwendet, um die Standardkurve zu erstellen.
3. Im Befehlsfenster, geben Sie die Anzahl der Dateien zu verwenden, um die Standardkurve und drücken Sie die Eingabetaste zu bauen.
4. Geben Sie im Befehlsfenster die Anzahl der Proben und die Anzahl der Wiederholungen in jeder Trainingsdatei (drücken Sie nach jedem Eintrag).
   HINWEIS: In der in Abschnitt 1.2 Plattenlayout, es gab 6 Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen und 2 Wiederholungen jeder Probe).
5. Geben Sie in das Befehlsfenster der niedrigste DNA verwendet, um die Standardkurve zu bauen (in log10 Kopien) und drücken Sie Enter Konzentration (für die in Abschnitt 1.2 Plattenlayout ist die niedrigste Konzentration Vorlage '1' log10 Kopien).
6. Geben Sie in das Befehlsfenster der Konzentrationsunterschied zwischen den einzelnen Standard (in log10 Kopien) drücken Sie die Eingabetaste (für die in Abschnitt 1.2 Plattenlayout ist die Konzentration Intervall "1" log10 Kopien).
7. Nach der Aufforderung das "Slope Schwelle" im Befehlsfenster, und drücken Sie die Eingabetaste.
8. Im Befehlsfenster, geben Sie die "Anzahl (z) Standardabweichungen über dem Hintergrund für die positive Schwelle", und drücken Sie die Eingabetaste. Typische Werte für die z-Bereich von 1 bis 5.
9. Bestimmen Sie, ob die Daten mit dem Thermocycler ("1") gesammelt, * .tiff Mikroskopbilder ("2") oder * .jpg Mikroskopbilder ("3"), indem Sie die Nummer "1", "2" oder "3", und pRessing eingeben.
10. Wählen Sie, um eine neue IPC Schwelle oder einen Standardwert für den Schwellenwert, indem Sie "y" oder "n", jeweils bei der entsprechenden Aufforderung zu verwenden.
11. Als nächstes wählen Sie jede der Tabellenkalkulationsdateien verwendet, um die Standardkurve zu erstellen.
    HINWEIS: Das Skript wird dann automatisch die HEX und FAM-Fluoreszenz-Daten importieren; bestimmen, ob jede Reaktion war gültig ist (das heißt, ob die Fluoreszenzsignale die Schwellen für den HEX oder FAM-Kanäle); Bestimmung der r ² Koeffizienten für den exponentiell, linear und zweiter Ordnung Polynomanpassung; Handlung "log10 Kopien gegenüber dem Zyklus Schwelle" für jede Probe verwendet, um die Standardkurve zu bauen; und erstellen Sie ein Tabellenkalkulationsdatei mit wesentlichen Variablen, um die Standardkurve für Validierungsexperimente ohne dass der Benutzer zur erneuten Eingabe alle Eingangsparameter wieder aufzubauen.

6. Assay-Validierung und Quantifizierung unbekannter Proben imDie Standardkurve

1. Verwenden Sie das Skript "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m", um die Präzision und Genauigkeit des Assays durch Stichproben mit bekannten Konzentrationen zu schätzen oder es verwenden, um Proben mit unbekannter Konzentration zu quantifizieren.
   Hinweis: Da bisher veröffentlichten Untersuchungen zeigten, dass eine exponentielle Anpassung ergab das beste r-Quadrat-Koeffizient ^18, dieses Skript verwendet eine exponentielle Anpassung für die Standardkurve. Wenn eine andere Art von Sitz gewünscht wird, kann das Skript entsprechend modifiziert werden.
   1. Offene und führen Sie das Skript "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Nachdem das Skript gestartet wird, wird der Benutzer automatisch aufgefordert, alle Eingänge in das Befehlsfenster eingeben.
   2. Geben Sie "1", einen Test zu validieren Verwendung einer Standardkurve mit bekannten Probenkonzentrationen oder geben Sie "2", um unbekannte Proben zu quantifizieren.
   3. Wenn Sie gefragt werden, wählen Sie entweder eine gespeicherte Standardkurve oder ein neues bauen, indem Sie thE Informationen, die automatisch im Befehlsfenster gebeten wird (die gleichen Informationen, die für die "JoVE_qRPA_standard_curve.m" Skript von § 5 erforderlich).
   4. Geben Sie die Anzahl von Versuchen (dh Tabellenkalkulationsdateien) für die Validierung / Quantifizierung analysieren.

7. Vorbereitung der Datenerfassung mit einem Fluoreszenzmikroskop und ein beheiztes Chip

1. Stellen Sie sicher, das Fluoreszenzmikroskop hat eine Bühne Heizung und 1-Kanal Precision hohe Stabilität Temperaturregler vorhanden.
2. Sicherstellen, dass die Fluoreszenzmikroskop hat einen Filterwürfel zu begeistern und zu sammeln Fluoreszenz von jedem Fluorophor. Excite und sammeln Sie den FAM-Fluoreszenz während IPC DNA-Amplifikation durch eine GFP-Filter (BP 470/40 Anregung nm, Emission BP 520/50 nm) erzeugt. Excite und sammeln Sie die HEX-Fluoreszenz bei HIV-1-DNA-Amplifikation durch einen HEX-Filter (BP 530/30 Anregung nm, Emission BP 575/40 nm) erzeugt.
3. Verwenden Sie das Mikroskop Skript-Editing-Software, um eine automatisierte Algorithmus zur Datensammlung auf dem Thermocycler repliziert erstellen.
   1. Zuerst legen Sie eine "Einstellungen" Schritt, um den Verschluss zu schließen. Als nächstes fügen Sie ein "Exposure" Schritt, um die Exposition gegenüber 60 s eingestellt. Setzen Sie einen "Snap", um die 60 Sekunden Verzögerung, die das 1 min Vorinkubationszeit implementiert auszuführen. Fügen Sie eine "Einstellung" Schritt, um die Arbeitsgruppe zu dem GFP-Filter zu ändern. Legen Sie eine andere "Belichtung" Schritt, um die Exposition gegenüber 200 msec einstellen. Alle Engagements mit dem GFP oder die HEX-Filterwürfel wird auf 200 ms eingestellt werden.
   2. Nach der "Belichtung" Schritt, fügen Sie ein "Snap" und geben Sie die Kamera mit dem das Bild aufgenommen werden. Verwenden Sie eine andere "Einstellung" Schritt, um den Verschluss und einen "Bild speichern" Schritt zu schließen, um das Bild zu einer benutzerdefinierten temporären Ordner zu speichern.
   3. Next-Schalter in die HEX-Filterwürfel mit einem anderen "Setting" Schritt und then fügen Sie ein "Exposure" auf 200 ms, eine "Snap" und "Bild speichern" Schritt.
   4. Wiederholen Sie diesen Vorgang 59 Mal mit einer anfänglichen Verzögerung von 20 Sekunden statt 60 (in der Nähe Auslöser, warten Sie 20 Sekunden, schalten Sie auf GFP-Filterwürfel, die Belichtung zu 200 msec, Snap, nahe Shutter, sparen, schalten Sie auf HEX Filterwürfel, die Belichtung einzustellen bis 200 msec, Snap).
4. Erstelle einen Chip, qRPA Reaktionen halten wird.
   1. Für Versuche mit dem Mikroskop, verwenden Sie die Datei JoVE_qRPA_base.ai, eine 40 x 15 mm rechteckiger Basis aus einem Blatt 1/8 "dicken schwarzen Acryl Ausschnitt mit einem Laserschneider auf 100% Leistung, 10% Drehzahl.
   2. Verwenden Sie die Datei, um die Reaktion JoVE_qRPA_well.ai schneiden gut, bestehend aus einem 10 x 10 mm Platz mit einem Durchmesser von 5 mm kreisrundes Loch geschnitten aus einer Folie aus 1,5 mm klarem Acryl.
   3. Schließen Sie bis zu drei Brunnen auf einem gemeinsamen Sockel mit Sekundenkleber-Gel.
   4. Über Nacht trocknen.

8. Datenerhebung und Analysis mit einem Fluoreszenzmikroskop

1. Bereiten Sie das Mikroskop für die Datenerhebung durch das Laden der automatischen Datenerfassung Skript JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
   1. Die Bühne Heizung auf 48 ° C vorgeheizt und die Reaktion Chip auf der Bühne Heizung für ca. 20 min. Einer Temperatureinstellung von 48 ° C behält eine Temperatur von 39 ° C in den Reaktionsbehälter (Daten nicht gezeigt).
   2. Verwendung eines 10X 0,45 NA-Objektiv, sich auf der Oberseite der Innenkante der Reaktionsbehälter mit dem GFP-Filter vorhanden. Die Kanten der Acryl werden nach dem Laserschneiden autofluoreszierenden und kann leicht visualisiert werden. Nach der Fokussierung, die Höhe des Mikroskoptisch nicht einstellen, bis alle Daten gesammelt werden.
2. Montieren Sie den qRPA Mastermix in einem bestimmten Vorverstärkung Arbeitsbereich, wie in Schritt 4.5.1 beschrieben. Für jede Probe, mischen Sie ein Enzym Pellet, Master-Mix, und HIV-1-DNA-Matrize in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Hinzufügen 2,5 ul Magnesiumacetat zur ersten reaction und kurz vortexen.
3. Transportieren Sie schnell das Reaktionsgefäß die qRPA Probe auf dem Fluoreszenzmikroskop enthält.
   1. 30 ul der RPA-Reaktion in die Reaktions vorsichtig pipettieren gut, ohne Blasen. Geben Sie einen Tropfen PCR-Grade-Mineralöl über das RPA-Reaktion um Verdunstung zu verhindern.
   2. Positionieren Sie das auch direkt unter dem Mikroskop-Objektiv, wobei darauf zu Bild nur das Zentrum der gut, keine der auto-fluoreszierende Acrylkanten. Nachdem das gut positioniert ist, führen Sie die automatische Skript 7. ein JPEG-Bild Das Skript generiert mit dem FAM Filterwürfel und ein JPEG-Bild mit dem HEX-Filterwürfel alle 20 sec.
4. Nachdem das Skript abgeschlossen ist, übertragen diese Bilder aus dem temporären Ordner, bevor Sie weitere Proben.
   1. Erstellen 2 Ordner: 1 für jedes Fluorophor (dh "HEX" und "FAM"). Bewahren Sie beide Ordner in der gleichen übergeordneten Ordner. In jedem FluorophorOrdner, erstellen Sie einen Ordner mit der Anzahl der DNA-Kopien in der Probe (beispielsweise 0, 10, etc.) vorhanden gekennzeichnet.
   2. Übertragen Sie alle Dateien mit der Vorsilbe "HEX" in den entsprechenden Unterordner im "HEX" Ordner. Übertragen Sie alle Dateien mit der Vorsilbe "GFP" in den entsprechenden Unterordner im 'FAM' Ordner.
5. Wiederholen Abschnitte 8.2-8.4 für qRPA Reaktionen mit 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ⁴ und 10 ⁵ HIV-1-DNA-Kopien.
6. Nach dem Sammeln der Daten für alle qRPA Proben in einem Experiment, laden Sie das Skript "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m". Wenn durch das Skript dazu aufgefordert werden, wählen Sie den übergeordneten Ordner der 2 Fluorophor Ordner, die wiederum die Bilder für jede Konzentration in Unterordner enthalten enthalten.
   HINWEIS: Das Skript wird eine Tabellenkalkulationsdatei in das übergeordnete Verzeichnis, in dem die HEX Fluoreszenzdaten werden in einem Blatt nam gerettet werden automatisched "HEX" und die FAM-Fluoreszenz Daten werden in einem Blatt mit dem Namen 'FAM' gespeichert werden. In jedem Blatt, wird die Zyklusnummer aufgeführt in Spalte B, und die Echtzeit-Fluoreszenz-Daten für steigende Konzentrationen an Templat in Spalten C, D, usw. angegeben. Jede Echtzeit-Fluoreszenz-Bezugspunkt ist der durchschnittliche Fluoreszenzintensität des zu diesem Zeitpunkt aufgenommene Bild.
7. Verwenden Sie den Standardstreudiagramm-Funktion in das Tabellenkalkulationsprogramm, um die Zellen B2 Grundstück: H61 des "HEX" und "FAM" Blätter, um Echtzeit-Fluoreszenz sichtbar zu machen und erzeugen ähnlich wie in den 2A, 2B, 3A und 3B Diagramme.
   HINWEIS: Die in Schritt 8.6 erzeugt Tabellenkalkulation kann auch in den Skripten "JoVE_qRPA_standard_curve.m" und "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" verwendet werden.

Representative Results

Discussion

Um aussagekräftige Quantifizierung Daten mit Hilfe des MATLAB-Algorithmus zu erhalten, muss der Benutzer bei der Aufforderung entsprechenden Eingabewerte auswählen. Nach Beginn jedes Skript in den Abschnitten 5 und 6 werden alle Eingangsgrößen automatisch im Befehlsfenster erbeten und Ausgänge werden automatisch generiert. In Abschnitt 5.7 wird der Benutzer aufgefordert, einen Schwellenwert für die Steigung zu wählen. Der Wert der Steigung Schwelle wirkt das Quadrat des Korrelationskoeffizient (r ²⁾ des Passform. Bei der Verwendung von rohen Fluoreszenzdaten von einem Thermocycler exportiert, Werte zwischen 2,0 und 5,0 sind in der Regel einen hohen r ² Koeffizienten ergeben. In Abschnitt 5.8 muss der Benutzer die Anzahl der Standardabweichungen über dem Hintergrund zu benennen, um die positive Schwelle. Um eine Probe als positiv oder negativ punkten, das Skript die Differenz Δ _Probe zwischen der maximalen und minimalen Fluoreszenz für jede Probe mit den rohen Fluoreszenzdaten vom therma exportiert bestimmt automatischl Cycler. Es berechnet die durchschnittliche Differenz Δ _Hintergrund und Standardabweichung σ _Hintergrund für alle nicht-Zielkontrollproben. Eine Probe gilt als positiv, wenn Δ _Probe mehr als z × σ _Hintergrund oben Δ _Hintergrund. In Abschnitt 5.10 entscheidet der Benutzer, ob die Standardschwelle verwenden oder einen neuen Grenzwert. Wenn der Benutzer eine neue Schwelle wünscht, bestimmen die neuen Schwellenwert experimentell durch Ausführen 3 Versuche mit jeweils 12 RPA Reaktionen ohne HIV-1-DNA vorhanden. Stellen Sie die Schwelle, bei der durchschnittlichen Erhöhung der Fluoreszenzintensität aus diesen Experimenten plus 3 Standardabweichungen. Nach § 6, das Skript JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m automatisch wieder den geschätzten DNA-Konzentration für jeden qRPA Reaktion (in log10 Kopien). Wenn das Skript bestimmt, dass keine HIV-1-DNA in der Probe vorhanden war, wird die geschätzte Konzentration entweder als "Ne aufgeführtengative für HIV "oder" Invalid ", je nachdem, ob das Fluoreszenzsignal für das interne positive Kontrolle die Schwelle (z × σ _Hintergrund + Δ _{Hintergrund).} Wenn der Benutzer die Validierung der Standardkurve mit bekannten Probenkonzentrationen wird das Skript außerdem eine zusätzliche Tabelle ähnlich der Tabelle 1 zurückzukehren.

Um ein Echtzeit-RPA-Assay, der genaue Quantifizierung bietet entwickeln, ist experimentell Konsistenz von entscheidender Bedeutung. Verwenden Sie zum Beispiel die gleichen Primer und Sonde Aliquots sowohl für die Standardkurve und Validierungsexperimente. Auch vermeiden Gefrier-Auftau-Zyklen, indem die Primer und Sonde Aliquots bei 4 ° C zwischen den Experimenten eher als -20 ° C. Die Vorlagen Aliquots für die Standardkurve und Validierungsexperimente verwendet werden, in der gleichen Weise gelagert. RPA Enzymgranulat und Reagenzien aus der gleichen Charge werden nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Schließlich becabenutzen RPA fehlt true 'Zyklen' genau zu steuern die Rate der Verstärkung, ist die Standardisierung der Benutzerschritte zwingend erforderlich. Bei der Montage von Reaktionen, muss der Benutzer immer die gleichen Schritte in der gleichen Reihenfolge, die Ausgaben in etwa die gleiche Menge an Zeit auf jedem Schritt. Reaktionen stets leicht mit einer neuen Pipettenspitze vermischt werden, und Blasen immer beseitigt werden. Vor der Verstärkung muss Reaktionen bei konstanter Temperatur gehalten werden, und der Thermocycler oder Mikroskop-Software muss immer vor dem Laden Reaktionen auf jede Verstärkung bei suboptimalen Temperaturen Quantifizierung beeinflussen könnten, zu vermeiden, hergestellt werden. Jede Änderung in der Anfangsreaktionsbedingungen können zu Inkonsistenzen in der experimentellen Ergebnissen führen.

Bei der Verwendung eines Mikroskops, Daten zu sammeln, müssen zusätzliche Variablen gesteuert werden, um Schwankungen in der Fluoreszenzintensität zu minimieren. Alle Reaktionen sind in der gleichen Region auf der Bühne wärmeren platziert werden, und die microscope müssen auf dem gleichen Bereich der Wanne für jede Probe fokussiert werden. Auch wenn diese Praktiken berücksichtigt werden, kann Fluoreszenzdaten auf einem Mikroskop gesammelt Variabilität aufgrund der örtlichen Lichtblicke, die natürlich während der RPA Reaktionen, Blasenbildung in den Reaktionskammern oder Bleichen von wiederholter Exposition gegenüber Anregungslicht resultierende bilden aufweisen. Der Einfluß dieser Variablen ist offensichtlich in der Fluoreszenzdaten auf dem Mikroskop (4A und 4B) gesammelt, die Nullinienschwankung, Spitzen und Mulden zu demonstrieren. Diese Merkmale fehlen bei der Fluoreszenzdaten auf dem Thermocycler (3A und 3B) gesammelt. Letztlich ist die Datenerhebung unter dem Mikroskop auf Proof-of-Prinzip nur Zwecken und die endgültige Test wird auf einem Feld operablen Fluoreszenz-Reader mit präziser Geometrie und Software-Steuerung, die diese Variablen minimiert umgesetzt werden.

Ein weiterer wichtigerAspekt der qRPA Assay-Entwicklungsprozess ist die Konsistenz in der Datenverarbeitung. Das in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, Protokoll verwendet Skripte rohen Fluoreszenzdaten (in einer Tabelle gespeichert wird) aus einem Thermocycler oder Mikroskop gesammelt verarbeiten. Alle Experimente verwendet, um die Standardkurve zu erstellen müssen identisch formatiert. Bei Verwendung eines Thermocyclers, Daten zu sammeln, muss dieselbe Plattenlayout verwendet werden, und die Daten aus Brunnen, die RPA Reaktionen nicht enthalten darf nicht exportiert werden. Bei der Verwendung eines Mikroskops, um Daten zu sammeln, muss das Format der Daten, die das Format der Daten automatisch aus dem Thermocycler ausgeführt übereinstimmen. C61 und Daten zur Erhöhung Matrizenkonzentrationen müssen Zellen D2: D61, E2: Zum Beispiel müssen die nicht-target-Steuerdaten in den Zellen C2 sein E61 usw. Wenn es mehrere Wiederholungen jeder Konzentration in einem Experiment, der ^2. replizieren Verdünnungsreihe muss von links nach rechts ab, ohne Zielsteuerung (NTC), um höchste Konzentration bestellt werden undin den Spalten unmittelbar rechts des ^1. gespeichert replizieren Verdünnungsreihe. Zum Beispiel wird in dem Plattenlayout in Abschnitt 1.2 mit 2 verwendet Wiederholungen für jede Probe, Fluoreszenzdaten für die 1. Wiederholung jeder Probe in der Verdünnungsreihe ist in den Zellen C2 gespeichert werden: H61 und Fluoreszenzdaten für die 2. Wiederholung jeder Probe in Die Verdünnungsreihe muss in Zellen I2 gespeichert werden: N61. Für die Plattenbelegung in Abschnitt 1.2 verwendet, ist dies die Standardformatierung beim Exportieren von Daten aus dem Thermocycler-Software in eine Tabellenkalkulation.

Von HIV-1 qRPA Experimente lieferten repräsentativen Daten zeigen proof-of-concept-Unterstützung, die RPA kann zur Quantifizierung von Nukleinsäurekonzentration in unbekannten Proben verwendet werden. Klinisch nützlichen HIV-1-Virusbelastungstests haben eine klinische Bereich von mindestens 4 Grßenordnungen, eine Genauigkeit von 0,5 log10 Kopien und ein Limit-of-Nachweis von mindestens 200 Kopien ^19,20. Die beschriebene HIV-1-DNA-Test erfüllt diese criteria und ist am genauesten in niedrigen Konzentrationen, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Daher ist bei der Aufnahme von einer reversen Transkriptase Schritt, legen diese Ergebnisse nahe, dass ein HIV-1-RT-RPA Assay kann das Potenzial für HIV-1-Viruslast in messen klinischen Proben. Bei der Entwicklung eines qRPA Assay Anpassung der Algorithmus-Parameter kann Abstimmung der Empfindlichkeit und linearen dynamischen Bereich, je nach klinischen Anforderungen. Abbildung 6 zeigt, dass die Anpassung z (ein Parameter, der die Schwelle für positive Proben bestimmt) kann die Empfindlichkeit und Genauigkeit bei niedrigen und hohen Einfluss Zielkonzentrationen. Ferner kann es möglich sein, die Auflösung und die Genauigkeit der Quantifizierung durch Inkubieren Reaktionen bei einer niedrigeren Temperatur oder unter Verwendung von weniger Magnesiumacetat, wodurch die Rate der Amplifikation abnimmt erhöhen.

Dieser Beweis des Konzeptes qRPA Test kann verwendet werden, um die Konzentration von Proben, die HIV-1-DNA zu quantifizieren. Die in dieser ma beschrieben qRPA Assaynuscript enthält detaillierte Anweisungen, wie Echtzeit-RPA Reaktionen montieren, zu entwickeln und zu screenen eine IPC und verarbeiten rohen Fluoreszenzdaten um eine Standardkurve, die verwendet werden können, um Quantifizierung unbekannter Proben zu bauen. Durch die enthaltenen detaillierten Anweisungen, kann dieses Protokoll angepasst ist, um DNA-Konzentration in einer Vielzahl von Proben zu quantifizieren.

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI