Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle

Summary

Bereitgestellt wird ein Protokoll zur Entwicklung eines Echtzeit-Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsassays zur Quantifizierung der Anfangskonzentration von DNA-Proben unter Verwendung eines Thermocyclers oder eines Mikroskops und einer Tischheizung. Ebenfalls beschrieben wird die Entwicklung einer internen Positivkontrolle. Skripte werden für die Verarbeitung von Echtzeit-Fluoreszenzrohdaten bereitgestellt.

Abstract

Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA), eine isotherme Amplifikationsplattform für den Nachweis von Krankheitserregern, zur Quantifizierung der DNA-Probenkonzentration unter Verwendung einer Standardkurve verwendet werden kann. In diesem Manuskript wird ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung und Implementierung eines quantitativen Echtzeit-Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsassays (qRPA-Assay) bereitgestellt. Am Beispiel der HIV-1-DNA-Quantifizierung werden die Assemblierung von Echtzeit-RPA-Reaktionen, das Design einer internen Positivkontrollsequenz (IPC) und die Co-Amplifikation des IPC und des Ziels von Interesse beschrieben. Es werden Anweisungen und Datenverarbeitungsskripte für die Erstellung einer Standardkurve unter Verwendung von Daten aus mehreren Experimenten bereitgestellt, die zur Vorhersage der Konzentration unbekannter Proben oder zur Bewertung der Leistung des Assays verwendet werden können. Abschließend wird eine alternative Methode zur Erfassung von Echtzeit-Fluoreszenzdaten mit einem Mikroskop und einem Tischheizer als Schritt zur Entwicklung eines Point-of-Care qRPA-Assays beschrieben. Das Protokoll und die bereitgestellten Skripte können für die Entwicklung eines qRPA-Assays für jedes DNA-Ziel von Interesse verwendet werden.

Introduction

Quantitative Nucleinsäureamplifikation ist eine wichtige Technik für den Nachweis von Umwelt, Lebensmittelvergiftungen und Wasser übertragenen Krankheitserregern sowie in der klinischen Diagnostik. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist der Goldstandard für empfindliche, spezifische und quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren, beispielsweise für HIV-1-Viruslasttest Nachweis bakterieller Erreger, und Screening auf vielen anderen Organismen ^{1 - 3.} Während der qPCR, Primer amplifizieren pathogene DNA in Zyklen, und ein Fluoreszenzsignal erzeugt, das proportional zu der Menge der amplifizierten DNA in der Probe bei jedem Zyklus i....

Protocol

1. Programmieren Sie den Thermocycler für die Echtzeit-Reaktionen qRPA

1. Erstellen Sie ein neues Protokoll in den Thermocycler Software.
   1. Legen Sie eine Vorinkubationsschritt: 39 ° C für 1 min.
   2. Hinzufügen einer zweiten Stufe: 39 ° C für 20 sec, gefolgt von einer Platte zu lesen.
   3. Schließlich legen Sie ein, dass der zweite Schritt wiederholt sich 59 mal mehr "to go".
   4. Speichern Sie das Protokoll.
2. Erstellen Sie eine neue Platte in der "Platteneditor" Registerkarte der Software. Wählen Vertiefungen auf der Platte entsprechend den Stellen der RPA-Reaktionen (hier Verwendung Vertiefungen A1, A4-A8, B1 und B4....

Results

Vor der Auswahl einer Sequenz, die als IPC in qRPA Experimente mit Ziel dienen (HIV-1) DNA, interne positive Kontrolle (IPC) Kandidaten erzeugt werden und für ihre Fähigkeit, in qRPA Reaktionen verstärken, ohne HIV-1-DNA vorhanden abgeschirmt. IPC-Kandidaten sind länger als das Ziel (HIV-1) DNA nach IPC Bildung von heraus konkurrierenden HIV-1 Amplikon Bildung zu verhindern. Wie in 2A, die Erzeugung von zwei C. gezeigten parvum IPC Kandidaten wurde durch die Anwesenheit von 415 und 435.......

Discussion

Um aussagekräftige Quantifizierung Daten mit Hilfe des MATLAB-Algorithmus zu erhalten, muss der Benutzer bei der Aufforderung entsprechenden Eingabewerte auswählen. Nach Beginn jedes Skript in den Abschnitten 5 und 6 werden alle Eingangsgrößen automatisch im Befehlsfenster erbeten und Ausgänge werden automatisch generiert. In Abschnitt 5.7 wird der Benutzer aufgefordert, einen Schwellenwert für die Steigung zu wählen. Der Wert der Steigung Schwelle wirkt das Quadrat des Korrelationskoeffizient (r ²⁾ des Passf.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPA Assay
			5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA Oligos	5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3'
HIV-1-Sonde	BioSearch Technologies	benutzerdefinierte DNA-Oligos	5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C C -3'
IPC-Sonde	BioSearch Technologies	benutzerdefinierte DNA-Oligos	5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
RPA exo Reagenzien (Pellets, Rehydrationspuffer,	Magnesiumacetat TwistDx	TwistAmp exo
PCR Tube Strips	BioRad	TLS0801
PCR Flat Cap Tube Strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal Kleber	BioRad	558/MJ
HIV-1-Ziel (pHIV-IRES- eYFPΔ EnvΔ VifΔ Vpr)			kundenspezifisches Plasmid, siehe: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Charakterisierung und Nachweis von künstlich replikationskompetenten Lentiviren mit verändertem Wirtsbereich. Molekulare Therapie 8, 118– 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Humane männliche genomische DNA	Applied Biosystems	360486
96 Well Cold-Block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermocycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris-Puffer 1,0 M, pH 8,0	EMD Millipore	648314
EDTA 0,5 M, pH 8,0	Promega	V4321
Nukleasefreies Wasser	Ambion	AM9937
IPC Entwicklung
Cryptosporidium parvum IPC-Vorlage	Waterborne Inc	P102C	Es ist auch möglich, ein doppelsträngiges synthetisches Ziel bei IDT zu bestellen, wenn der Benutzer nicht in der Lage ist, mit C. parvum (einem BSL-2-Infektionserreger) zu arbeiten. PCR- und RPA-Primer für C. parvum wurden unter Verwendung der GenBank-Zugangsnummer AF115377.1
PCR Long Forward Primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'
PCR langer reverser Primer	Integrated DNA Technologies	benutzerdefinierte DNA-Oligos	5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'
Phusion High-Fidelty DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel-Extraktionskit	Qiagen	28704
TAE 10X Puffer	EMD Millipore 574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Mikroskop Experimente
Aufrechte Fluoreszenzmikroskopie	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Tischheizung	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Kanal Präzision Hochstabiler Temperaturregler	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP Filterwürfel	Zeiss	Filtersatz 38 (000000-1031-346)	Anregung BP 470/40 nm, Emission BP 520/50 nm
HEX Filter Würfel	Chroma	49014	Anregung BP 530/30 nm, Emission BP 575/40 nm
Laser Cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" schwarzes Acryl	McMaster Carr	8505K113
1,5 mm klares Acryl	McMaster Carr	PD-72268940
Sekundenkleber	Office Depot	Duro Sekundenkleber
Mineralöl in PCR-Qualität	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Datenanalyse
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB MATLAB
Skript: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"	Im SI
MATLAB-Skript enthalten: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"	Im SI
MATLAB-Skript enthalten: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"	Enthalten in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Enthalten in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Enthalten in SI
AxioVision Software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Enthalten in SI