Abstract
多峰的，分子成像允许在使用多个互补的成像技术的蜂窝，亚细胞和分子水平的分辨率的生物过程的可视化。这些显像剂促进途径和机制在体内 ，这对提高诊断和治疗功效的实时评估。本文介绍的协议biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的合成（PB NPS） - 一类新的药物用于在多峰分子成像应用。在纳米颗粒，荧光成像和磁共振成像（MRI）掺入所述成像模态，具有互补的特性。该PB纳米粒具有一个核-壳的设计，其中钆和锰离子在PB晶格的间隙空间内掺入产生MRI对比，二者T中1和T 2 -加权序列。该PB纳米粒涂覆有荧光抗生物素蛋白使用静电自如sembly，使荧光成像。该抗生物素蛋白涂覆的纳米颗粒修饰赋予分子的定位功能，以纳米颗粒的生物素化配体。纳米粒子的稳定性和毒性测定，以及它们的核磁共振驰豫。这些biofunctionalized PB纳米颗粒的多，分子成像能力，然后利用他们为荧光成像和体外分子MRI表现。
Introduction
分子成像是生物过程在细胞，亚细胞和分子水平1的非侵入性的和有针对性的可视化。分子成像允许样品保持其天然的微环境，而其内源性途径和机制实时进行评估。通常情况下，分子成像涉及小分子，大分子，或纳米粒子可视化，目标，和跟踪有关的生理过程的形式的外源成像剂被研究2的管理。已探索了在分子成像的各种成像方式包括MRI，CT，PET，SPECT，超声，光声学，拉曼光谱，生物发光，荧光和活体显微镜3。多峰成像是两种或多种成像模态，其中所述组合增强可视化和表征的各种生物过程和事件4的能力相结合。 Multimoda升成像利用的各个成像技术的优势，同时补偿其个人的局限性3。
本文介绍的协议biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的合成（PB NPS） - 一类新的多峰分子成像剂。该PB纳米颗粒被用于荧光成像和分子MRI。 PB是颜料由交替铁（II）和铁（III）中的原子面心立方网络（ 图1）。该PB晶格是由在铁二线性氰化物配体- CN -铁三连杆并入阳离子来平衡其三维网络5内的收费。 PB的掺入阳离子成其晶格的能力是由分别装入钆和锰离子进入该PB纳米粒为MRI造影利用。
对于追求纳米设计的MRI造影的基本原理是因为优点这种设计提供了相对于目前的MRI造影剂。美国FDA批准的MRI造影剂的绝大多数是钆螯合物是顺磁性的性质，并提供正的对比度的自旋-晶格松弛机构6,7,8。相比于单钆螯合物，具有低信号强度在其自己的，纳米颗粒的该PB晶格内的多个钆离子的掺入提供了增强的信号强度（阳性对照）3,9。此外，多个钆离子的PB晶格内的存在增加了整体的自旋密度和纳米颗粒的顺磁性的幅度，这扰乱在其附近的局部磁场，从而产生负反差的自旋 - 自旋松弛机理。因此，含钆纳米粒子两者的作用为T 1（正）和T 2（负）的造影剂10,11。
患者肾功能受损的一个子集，钆造影剂的管理已与肾系统纤维化8,12，13的发展。这一发现促使调查使用替代顺磁离子造影剂的MRI。因此，纳米颗粒的多功能设计适于该PB晶格内掺入锰离子。类似于钆螯合物，锰螯合物也顺磁性，并且通常用来提供正信号强度中的MRI 7,14。作为与含钆PB纳米粒，含锰PB纳米粒也起到为T 1（正）和T 2（负）的造影剂。
掺入 荧光成像能力，所述纳米颗粒“核”涂有“生物功能”外壳组成的荧光标记的糖蛋白抗生物素蛋白（ 图1）。抗生物素蛋白不仅使荧光成像，而且也作为一个对接平台，针对特定的细胞和组织的生物素化的配体。该抗生物素蛋白-生物素键是其特征在于抗生物素蛋白和生物素15之间非常强的结合亲和力最强已知的，非共价键中的一个。生物素化配体与抗生物素蛋白包被的纳米颗粒的PB附着赋予分子的定位功能，在PB纳米颗粒。
动机使用PB纳米粒追求荧光和磁共振成像是因为这些成像模式具有互补的特点。荧光成像是一种最广泛使用的光学分子成像技术之一，并且允许对多个对象中的高灵敏度1,16,17同时可视化。荧光成像是一种安全，无创方式，但与普及率低的深度和空间分辨率1,3,16有关。另一方面，MRI产生高时间的二维空间分辨率非侵入和而不需要电离辐射1,3,16。然而磁共振患有低灵敏度。因此荧光成像和MRI被选定作为分子成像技术由于穿透深度，灵敏度和空间分辨率它们的互补特征。
本文介绍了协议的PB纳米颗粒的合成和biofunctionalization，PB纳米颗粒（GdPB）和含钆PB纳米颗粒（MnPB）10,11含锰。以下方法描述：1）测量的大小，电荷，和纳米颗粒的经时稳定性，纳米颗粒，MRI弛豫3）测定的细胞毒性的2）的评价，和4）利用所述纳米粒子为荧光和分子MR成像的的靶细胞在体外的群体。这些结果表明了纳米颗粒的电势用作体内多峰的，分子成像剂。
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Protocol
1.合成PB纳米粒子，GdPB和MnPB的
的纳米颗粒（纳米颗粒的PB，GdPB或MnPB）的合成是使用一釜合成方案通过执行下面详述的步骤来实现的：
- 制备溶液“A”含有在去离子（DI）水加入5ml的5mM亚铁氰化钾（II）中。取决于纳米颗粒的类型被合成 - PB纳米粒，GdPB或MnPB，制备溶液“B”，如下所示：
- 为 PB纳米粒：制备10ml含有2.5mM的铁（III），氯化在去离子水中的溶液。
- 对于GdPB纳米粒：制备10ml含有2.5mM的每种钆（Ⅲ）硝酸盐，铁（III），氯化在DI水中的溶液
- 对于MnPB纳米粒：制备10ml含有2.5mM的每种锰（II），氯化铁（III），氯化在DI水中的溶液。
- 溶液“B”添加到一个圆底烧瓶中，并在室温下搅拌该烧瓶内容物（RT）和1000转。添加解决方案'A'逐滴成圆底含液瓶'B'。控制流速通过蠕动泵设置为分配约10毫升/ hr的加入溶液“A”至“B”。
- 继续以1,000rpm在室温加入溶液“A”到“B”之后搅拌另外的30分钟，就完成了。停止搅拌，收集混合物。
- 转移混合物的等分试样到微量离心管中以冲洗游离的未反应成分的纳米颗粒。添加5M的氯化钠（0.2毫升氯化钠/毫升反应混合物）至每个等分试样离心，以协助粒子集合。
- 离心机纳米颗粒的每等份为至少10分钟，在20000×g下。离心后，小心地取出上清。
- 通过使用微尖（超声脉冲超声处理悬浮在1ml去离子水各纳米粒子沉淀的开/关= 1/1秒，振幅= 50％，持续时间=5秒，超声仪额定功率= 125 W），打破了球。
- 重复步骤1.4-1.6至少3×，以确保纳米颗粒是自由的初始反应和反应副产物的组分。最后一次离心后，悬浮在1ml去离子水中的颗粒。
2. Biofunctionalization PB纳米粒子，GdPB和MnPB的
纳米颗粒的Biofunctionalization涉及纳米粒子“芯”与抗生物素蛋白和生物素化的加入配位体的涂层，如下所述：
- 纳米粒子与荧光抗生物素蛋白涂层
用荧光抗生物素蛋白的纳米颗粒的涂层是使用静电自组装来实现，其中带正电荷的抗生物素蛋白（PI〜10.5）上涂覆到带负电荷的纳米颗粒如下18：- 制备该PB的NP，GdPB或MnPB在1ml去离子水中的悬浮液。过滤的Alexa Fluor 488标记的抗生物素蛋白（A488;重新溶解在DI水中）通过在14000×g的10分钟，用0.2μm尼龙微量过滤。添加≤0.2毫克亲/毫克纳米粒子。单独添加A488的每一个过滤分装到PB纳米粒子，GdPB，或MnPB的等分。
- 联系与A488的纳米粒子2-4小时用在4℃轻轻摇动或转动。防止光使用铝箔的样品。
注：此步骤产量A488涂PB纳米粒子（PB-A488），GdPB（GdPB-A488），并MnPB（MnPB-A488）。
- 生物素标记的抗体附着
生物素化的靶向抗体上的抗生物素蛋白包覆的纳米微粒的附着用实现抗生物素蛋白 - 生物素的相互作用，如下所示：- 制备的抗生物素蛋白包覆的纳米微粒的悬浮液 - PB-A488，GdPB-A488，和MnPB-A488在1ml去离子水中。通过0.2μm尼龙微量过滤器过滤生物素化的抗体（由生产商提供），在14000×g的10分钟。
注：在此，本研究采用比奥inylated抗 - 神经元 - 神经胶质抗原2（ANG2）靶向细胞和中枢神经系统的组织和内NG2过表达生物素化的抗 - 人趋化因子-3（Eot3）靶向受体过表达对嗜酸性粒细胞或嗜酸性细胞系。 - 单独添加生物素化的抗体的每个滤波分量，以抗生物素蛋白包覆的纳米微粒的等分试样。添加≤0.05毫克生物素化抗体/毫克抗生物素蛋白包覆的纳米微粒。接触抗生物素蛋白包覆的纳米微粒与生物素化的抗体（ANG2或Eot3）2-4小时与在4℃下轻轻摇动或旋转。防止光使用铝箔的样品。
注：此步骤的产量抗体涂覆的纳米颗粒（ 如 GdPB-A488-Eot3和MnPB-A488-ANG2）。
- 制备的抗生物素蛋白包覆的纳米微粒的悬浮液 - PB-A488，GdPB-A488，和MnPB-A488在1ml去离子水中。通过0.2μm尼龙微量过滤器过滤生物素化的抗体（由生产商提供），在14000×g的10分钟。
纳米粒子的3上浆，Zeta电位和时间稳定性
的粒度分布的纳米粒子，电荷和稳定性是使用动态测光散射（DLS）的方法如下所述：
- 纳米粒子的大小
上浆纳米颗粒是使用动态光散射如下来实现的：- 加10微升的纳米颗粒样品（1毫克/毫升），以990微升去离子水在一个一次性塑料杯中。
注：这是一个很好的信号DLS典型值。 - 帽试管，涡旋拌匀。放置反应杯在用于分析的粒径，以便测量所述纳米颗粒的尺寸的系统。进行粒度分析，在173°的测量角度。
- 加10微升的纳米颗粒样品（1毫克/毫升），以990微升去离子水在一个一次性塑料杯中。
- 纳米粒子的Zeta电位
纳米粒子的ζ电位是使用相位分析光散射测量如下：- 添加100微升的纳米颗粒样品（1毫克/毫升），以900微升去离子水在一个一次性塑料毛细管单元。此值是代表一个好的zeta电位的测量。
- 将毛细ý细胞中用于分析，以测量使用默认参数的纳米粒子的ζ电位在25℃下的ζ电位的系统。
- 纳米粒子的时空稳定性
纳米颗粒的经时稳定性，使用动态光散射如下测定：- 通过测量所述纳米颗粒的尺寸在DI水中以及Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM），为3.1节中所述评估纳米颗粒的稳定性。
- 重复在DI水和DMEM一次/天的规模测量历时5天。
4.细胞毒性的纳米粒子的
纳米颗粒的细胞毒性是使用XTT细胞增殖试验测定如下：
- 种子10,000-15,000细胞/孔的每种细胞类型，在96孔板的研究（的Neuro2A，BSG D10，EOL-1，和OE21）。确保种子细胞的总数量不éxceed0.2毫升/孔。孵育接种的细胞过夜，在37℃和5％的CO 2。
- 接触的纳米粒子与细胞：
- 孵育细胞与不同浓度的纳米颗粒（0.01 - 0.5毫克/毫升）。参照表1作为代表性表描述了纳米颗粒的量（50微升）加入细胞中去除50微升培养基/孔后。
- 考虑到在测定中的纳米粒子的任何干扰吸光度，添加空白组成的纳米颗粒的适当浓度的（0-0.5毫克/毫升;在等价于添加到细胞中的量），而不细胞培养基。
- 孵育细胞过夜纳米颗粒，在37℃和5％的CO 2。抽吸培养基从每个孔和冲洗用在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中含有5％胎牛血清（FBS）的染色缓冲液中。加入100微升培养基不含酚红和孵育在37℃和5％CO 2的16-18小时。
- 孵育细胞与不同浓度的纳米颗粒（0.01 - 0.5毫克/毫升）。参照表1作为代表性表描述了纳米颗粒的量（50微升）加入细胞中去除50微升培养基/孔后。
- 通过混合该试剂盒组分（XTT试剂和XTT活化剂）按照制造商的说明书制备XTT细胞增殖试验工作溶液。从孔中吸出培养基，并添加100微升的RPMI（RPMI W / O型酚红+ 10％FBS + 1×青霉素 - 链霉素），或用于研究的细胞类型合适的培养基。添加50微升XTT工作液到每个孔中，并孵育在37℃和5％CO 2的2-2.5小时。
- 测量490nm处的吸光度，用630nm的参照波长以校正指纹或污迹。计算每口井的校正吸光度（A 490 -A 630）和重复平均读数。
- 减去来自每个井值空白读数来计算最终校正吸光度值。由纳米颗粒未经标准化的最后校正吸光度到未处理的细胞计算存活百分比对每个样品。苏积rvival百分比作为纳米粒子的浓度的函数。
5. MRI弛豫的PB纳米颗粒的，GdPB和MnPB
核磁共振弛豫是对采用T 1测量-和T 2 -加权序列由如下所述制备的MRI“幻影”使用96孔板含有纳米颗粒：
- 幻影准备
- 制备一个96孔板每孔含有100微升的纳米颗粒（纳米颗粒的PB，GdPB或MnPB）在适当的浓度。用0.4mM的每种类型的纳米颗粒的浓度开始，连续地稀释使用去离子水的纳米粒子2×直至2.4×10 -5 M的达到的浓度（这需要14稀释和15孔）。
- 加入100微升的去离子水熔融1％琼脂糖溶液到每口井拌匀。使凝胶凝固在4℃下12小时。
注意：这产生含有连续稀释的假想纳米粒子在凝固的琼脂糖。 - 放置幻象在水平3个T临床磁铁2％琼脂（150 毫升 ）的一个固体块下。安全的8声道HD大脑线圈中心内琼脂的幻象和块。测量，以0.5毫米厚的冠状切片，在96孔板11的中间高度的弛豫时间。
- 牛逼1 -和T2加权序列
使用下面的代表设置用于获取所述序列在临床磁体。
注意：这些值对于在本研究中使用的纳米颗粒的优化：- 获得Ť1 -加权使用下列液体衰减反转恢复（FLAIR）序列（T1W）MR图像：回声列车（ET）= 8，重复时间（TR）= 2300毫秒，回声时间（TE）= 24.4毫秒，矩阵大小= 512×224，视场（FOV）= 16×16 平方厘米。
- 使用下面的快速relaxa获得T2加权（T2W）MR图像化快速自旋回波（FRFSE）序列：ET = 21; TR = 3500毫秒; TE = 104毫秒;矩阵大小= 512×224; FOV = 16×16 平方厘米。
- 获得在127兆赫（3 T）T1W和T2W磁共振成像在以下反转时间：50，177，432，942，1961，4000毫秒。
- 测量MRI弛豫
- 获取使用5.2节中描述的序列T1W和T2W图像后，测量每个使用以及ImageJ的信号强度，从此指定为感兴趣区域（ROI）通过位于主工具栏上的椭圆形按钮作物选择每个ROI区域，然后选择分析>测量。
注：弹出应标有“平均值”栏下显示的每个投资回报率的平均信号强度。 - 对于每一个投资回报率，暗算其特定的反转时间测量信号强度。如果需要的话，反转点（读）产生一个初始的“泡沫”或离群，在剧情的开始（下反转倍）。
注：在低反转时间产生这些读数，因为MRI测量图像，而不是他们的实际（负）值，其中需要进行核算/ 19修正的幅度或绝对值。 - 准备一个指数适合的投资回报（SI）与反转时间（T I）的信号强度每个小区在5.2节所述。情节T I的x轴，SI在y轴; ɑ和Δ是通过回归确定的常数，和T 1或T 2是要解决的变量：
其中t = T 1，T 2。 - 解决对于T 1或T 2使用上述方程和绘制的计算值（1 / T 1和1 / T 2）针对每个ROI中使用的纳米颗粒的浓度的倒数。
- 计算出的线性图的斜率产生的弛豫R 1和R 2。
注：该协议的以下部分描述了纳米粒子的荧光标记和靶细胞产生MRI造影的应用。
- 获取使用5.2节中描述的序列T1W和T2W图像后，测量每个使用以及ImageJ的信号强度，从此指定为感兴趣区域（ROI）通过位于主工具栏上的椭圆形按钮作物选择每个ROI区域，然后选择分析>测量。
有针对性的细胞6.荧光标记使用纳米粒子 - 共聚焦显微镜
注：纳米颗粒（纳米颗粒的PB，GdPB和MnPB）可用于荧光标记的靶细胞（通过共聚焦显微镜监测）如下的群体：
- 荧光纳米颗粒的合成
- 通过以下在部分1和2详述的步骤合成GdPB-A488，GdPB-A488-Eot3，MnPB-A488，MnPB-A488-ANG2用于靶向细胞群的荧光标记。
- 细胞准备荧光瞄准
- 大衣没有。 1.5微盖玻片浸渍它们在0.002％的聚（L-赖氨酸）氢溴酸盐的90分钟的溶液中。从溶液中取出盖玻片，并使其干燥24小时。
- 种子的细胞（ 如报废-1，BSG D10，SUDIPG1）上涂布的盖玻片放置在6孔板，孵育在37℃和5％CO 2中的至少16小时。冲洗细胞与1×PBS液和（可选），在15分钟的中性缓冲液10％甲醛固定。染色的细胞用5μM的红橙色细胞穿透物染料的PBS，在37℃下进行30分钟。随后，冲洗细胞，用PBS。
- >目标细胞的荧光标记
- 添加1％牛血清白蛋白（BSA;在去离子水）至细胞中以减少非特异性的细胞结合，并在37℃进行1小时。
- 孵育细胞在1％BSA的纳米颗粒1小时。作为EOL-1：孵育0.2毫克/毫升GdPB-A488或GdPB-A488-Eot3;为BSG D10和SUDIPG1：孵育0.2毫克/毫升MnPB-A488或MnPB-A488-ANG2。冲洗细胞，PBS 3×删除unbouND纳米粒子。
- 小心倒置护罩玻璃（含有细胞和纳米颗粒）在显微镜载玻片，以确保没有气泡。通过仔细运用透明指甲油密封盖玻片和载玻片之间的边缘。图像使用共聚焦激光扫描显微镜的细胞。
靶细胞7.荧光标记使用纳米 - 流式细胞计数
的纳米颗粒（纳米颗粒的PB，GdPB和MnPB）可用于荧光标记的目标细胞群（通过流式细胞术监测）如下：
- 细胞的制备的悬浮液被靶向于PBS中。对于纯文化的研究中，悬浮液由单个细胞类型（ 如 BSG D10）的;悬浮BSG D10细胞在PBS中的细胞沉淀以100,000细胞/ ml（10毫升总）。为混合培养的研究中，悬浮液由至少两种细胞类型（ 如报废-1和OE的21）;类似于BSG D10，EOL-1和OE21在PBS中重悬细胞沉淀以100,000个细胞/ ml的每种（10毫升总）。
- 制备变报废-1的比率：OE21 1:0（2毫升报废-1），3：1（1.5毫升报废-1，0.5毫升OE21），1：1（1 ml的每种报废-1和OE21的）， 1：3（0.5毫升报废-1，将1.5ml OE21），0：1（2毫升OE21）。
- 阻断细胞（纯的和混合的悬浮液）被靶向的纳米颗粒与2ml的5％的BSA，以减少非特异性结合。
- 加入1毫升（1毫克/毫升）的纳米颗粒向细胞孵育1小时。对于BSG D10，培养细胞MnPB-A488，MnPB-A488-ABC（对照抗体），或MnPB-A488-ANG2）。作为EOL-1和OE21的混合物，孵育GdPB-A488-Eot3固定量的混合物。
- 漂洗未结合的纳米颗粒的细胞通过降低盘片样品在1000×g下5分钟，在至少3×以除去未结合的颗粒。重悬细胞于1ml PBS中并用在PBS中的10％的甲醛固定。染色的细胞用10微克/毫升孵育7- Aminoactinomytcin D的PBS在冰上30分钟。冲洗用PBS，然后使用流式细胞仪分析万门控的细胞从每个样品。
在目标单元格中的纳米粒子生成8 MRI对比
的纳米颗粒（纳米颗粒的PB，GdPB和MnPB）可以被用于产生MRI对比（在两者是叔1 -和T 2 -加权序列）在靶向细胞群如下：
- 幻影准备
- 生长细胞（ 如 BSG D10）在T75瓶中，直到〜80％ 汇合。使用适当的生长培养基和条件。为BSG D10，生长的细胞在DMEM + 10％FBS + 1×青霉素-链霉素，在37℃和5％的CO 2。
- 冲洗培养基的细胞用5ml PBS中并阻断细胞与在PBS5毫升的1％BSA进行1小时，以减少非特异性结合。加入5 ml（0.5毫克/毫升）的纳米颗粒的细胞。对于BSG D10，孵化细胞MnPB-A488，MnPB-A488-ABC（对照抗体）和锰过氧化物酶B-A488-ANG2 1小时。
- 冲洗细胞3×5毫升PBS以除去未结合的纳米颗粒。通过孵育细胞用2ml胰蛋白酶的EDTA的0.25％溶液1×5分钟，在37℃和5％的CO 2，以从烧瓶幻像制备分离它们Trypsinize细胞。添加8毫升DMEM中以淬灭细胞的胰蛋白酶消化。
- 通过在1000×g下5分钟离心它们收集细胞;吸出上清液。重悬细胞于1ml PBS中并加入1毫升10％甲醛的PBS固定细胞。添加100微升各样品至96孔板的单独的井。
- 加入100微升的在去离子水中的熔融的1％琼脂糖溶液导入各孔中，并通过上下吹打混匀。使凝胶凝固在4℃下12小时。
注意：这会产生含有细胞在凝固的琼脂糖连接纳米粒子的幻象。 - 放置幻象在水平3个T临床磁铁旁边的2％琼脂的固体块（150厘米
- 牛逼1 -和T2加权序列
使用以下设置获取临床MRI磁体的序列：- 使用下面的自旋回波序列T1W获得磁共振图像：回波序列（ET）= 1，重复时间（TR）= 650毫秒，回声时间（TE）= 11毫秒，矩阵大小= 320×256，视场（FOV） = 10×10 平方厘米。
- 使用以下FRFSE序列获得T2W磁共振图像：ET = 28; TR = 3000毫秒; TE = 101毫秒;矩阵大小= 384×288; FOV = 10×10 平方厘米。
- 收购后的处理
- 为了方便阅读，转换原有的灰度图像转换成使用ImageJ彩色图像规模：选择图片>类型> 8位，将图像转换为灰度。
- 减去从琼脂糖溶液中的信号的贡献后计算出归一化强度对每个样品。
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Representative Results
使用一锅合成方案中，纳米粒子的PB纳米粒（平均直径78.8纳米，多分散性指数（PDI）= 0.230;通过动态光散射仪器来计算），GdPB（平均直径164.2纳米，PDI = 0.102），或MnPB（平均直径122.4纳米，PDI = 0.124），它们是单分散（如通过DLS测得的）可以被一致地合成（ 图2A）。合成纳米颗粒的测得的ζ电位小于-30毫伏（ 图2B），这表明基于它们的表面电荷的粒子的适度稳定性。合成的纳米粒子表现出足够的时间稳定性历时5天通过一致的大小（流体动力学直径; 图2C）所指示的。
当共孵育的细胞中，纳米颗粒（PB纳米粒，GdPB和MnPB）表现出可以忽略不计的细胞毒性，以一定的阈值浓度以下的细胞（ 图3）。毒性STUPB纳米粒对的Neuro2A细胞模具指示可以忽略不计的细胞毒性时共同孵育的Neuro2A浓度大于0.67×10 -6毫克/细胞（ 图3A）低。通过共孵育GdPB与报废-1和OE21细胞进行细胞毒性研究表明GdPB对两种细胞类型的细胞毒性可忽略不计的浓度小于0.25×10 -6毫克/细胞（ 图3B）低。相似的，细胞毒性研究表明MnPB的可忽略不计的细胞毒性的浓度大于0.25×10 -6毫克/细胞（ 图3C）下时共孵育BSG D10。 MnPB和GdPB的附加 的细胞毒性可以归因于额外的离子纳米颗粒核内的存在（ 锰离子为MnPB和钆3+为GdPB）。
MRI弛豫研究用幻影由不同浓度的PB纳米粒子，GdPB和MnPB的进行。研究表明nanopar的效用ticles如既T1W和T2W序列（ 图4）的MRI造影剂。这表现在增加的高信号（阳性对照）T中1 -加权序列和在T2加权序列与两个GdPB（ 图4A）和MnPB（ 图4B）的增加浓度增加低信号（阴性对照）。基于该弛豫测量，MnPB是一个适中Ť1剂和强Ť2剂而GdPB是一种强Ť1剂和适度Ť2剂（ 图4C）。 GdPB和MnPB的测量弛豫媲美那些临床批准的造影剂10，11的。
所述biofunctionalized PB纳米粒能够在体外对荧光标记的目标细胞群（ 图5）。当这两种荧光生物素（A488）和生物素化抗人E- biofunctionalizedotaxin-3抗体（Eot3），GdPB可以荧光靶向报废-1细胞（ 图5B）的群体。控制GdPB纳米颗粒没有显示出Eot3可忽略的结合（ 图5A）类似地，当GdPB被biofunctionalized与两个荧光抗生物素蛋白（A488）和生物素化抗神经胶质抗原2（ANG2），纳米颗粒可以靶向荧光BSG D10和SUDIPG1神经球的种群（ 图5D和F）中 ，而无需所述靶向抗体对照纳米颗粒无法荧光标记的细胞（ 图5C和E）。因此，有效的定位和荧光标记需要两个荧光抗生物素蛋白和生物素化的靶向配体的存在。
所述biofunctionalized纳米颗粒的能力的荧光标记细胞的群体，如定量通过流式细胞术，证明，需要用两个荧光抗生物素蛋白和生物素聚乙二醇化复合靶向配体为有效的荧光标记（ 图6）。 BSG D10细胞与含有两个A488和Ang2 MnPB（MnPB-A488-ANG2）表现出增加的荧光（ 图6A）和荧光标记的细胞时相比，控制荧光纳米粒子与对照抗体（ 图6B）的百分比（MnPB-A488 -abc）和无抗体（MnPB-A488）。所述biofunctionalized纳米颗粒能够小区混合物（ 图6C）中，以荧光靶向特定亚群的细胞。这表现为固定量报废-1-定位的，荧光GdPB（GdPB-A488-Eot3）接触与靶细胞（EOL-1）和对照细胞（OE21）。混合物中;荧光随报废-1的比例增加（ 图6C增加的Alexa Fluor 488信号强度）。这表明纳米颗粒的特异性在CE中该亚群的细胞LL混合。
所述biofunctionalized PB纳米粒增加靶向细胞群MRI造影（ 图7）。当BSG D10细胞与等量浓度的实验（MnPB-A488-ANG2）和对照（MnPB-A488-ABC和MnPB-A488）的纳米颗粒，体模表现出增加的高信号对细胞接触MnPB-A488-ANG2相比于对照T1W序列，并增加了低信号对细胞接触MnPB-A488-ANG2相比在T2W序列（ 图7A）的控制。假想内的ROI的图像分析证实了这一趋势，其中接触的细胞与实验粒子时相比，在T1W序列控制和显著在T2W序列（ 图7B）的相对强度降低至对照表现出显著增加强度。
图1：核-壳设计PB纳米颗粒的。芯包括一个PB晶格，它由线性氰化物配位体中一个铁二 - CN -铁三键 ，这些键使PB纳米粒其三维网络内掺入阳离子作为平衡电荷5的手段。此阳离子结合普鲁士蓝的能力被利用来晶格，它提供了MRI造影内装入钆和锰离子。芯涂覆有生物功能的外壳组成的荧光抗生物素蛋白，以使荧光成像和生物素化的配位体，使分子定向。
图2：大小，电荷和PB纳米颗粒的稳定性（A）PB（蓝色）的尺寸分布，GdPB（红色）和MnPB（黑色）纳米粒子的DLS测量。 （B （C）的 PB（蓝色）时间稳定性，GdPB（红色）和MnPB（黑色）粒子在水中通过DLS（固体）和DMEM（虚线），用于其合成后五天，进行测定。
图3：该PB纳米粒的细胞毒性使用各种浓度的（A）中的PB纳米粒加入的Neuro2A细胞（B）的GdPB加入到报废-1和固定量的一个固定数目的OE-21细胞，分别和细胞毒性研究（ C）的 MnPB加到BSG D10细胞的固定数目。细胞存活率计算为24和48小时。从文献11授权转载，版权2014年美国化学学会;参考10与鸠出版社有限公司许可;和Ref 21从化学的英国皇家学会的许可。
图4：MR图像和GdPB和MnPB的弛豫在3吨高信号T中1 -加权序列和低信号在T2加权序列（A）的 GdPB和（B）MnPB作为纳米颗粒的浓度的函数。 （C）PB纳米粒子，GdPB和MnPB在3 T.转载自编号11，版权2014年美国化学学会测量许可relaxitivies的制表。
图5：使用biofunctionalized PB纳米粒靶向细胞的荧光标记，如由激光扫描共聚焦显微镜测量报废-1细胞（A） 的控制（GdPB-A488）和（B）的实验（GdPB-A488-Eot3处理图像。 ）纳米粒子。用（C）的控制（MnPB-A488）和（D）的实验（MnPB-A488-ANG2）纳米粒子治疗BSG神经球的图像。与（E）的控制（MnPB-A488）和（F）的实验（MnPB-A488-ANG2）纳米粒子治疗SUDIPG1神经球的图像。转载自编号11的许可，版权2014年美国化学学会。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：使用biofunctionalized PB纳米粒子靶细胞，通过流式细胞仪检测的荧光标记（A），流式细胞仪实验（MnPB-A488-ANG2）和控制（MnPB-A488-ABC和MnPB处理BSG D10细胞的直方图。 -A488）纳米粒子。 （B）PE从面板（A）是荧光（％Alexa的-氟阳性）在与实验（MnPB-A488-ANG2）的治疗和控制rcentage BSG D10细胞（MnPB-A488-ABC和MnPB-A488）的纳米颗粒，** P <0.05。 （C）流式细胞仪散点图包含由纳米粒子（GdPB-A488-Eot3）针对报废-1（靶细胞）和OE21（控制单元）的不同比例的细胞混合物。从参考文献11，版权2014年美国化学学会和参考10与鸠出版社有限公司许可授权转载请点击这里查看此图的放大版本。
图7：在使用biofunctionalized PB纳米颗粒靶向细胞增加MRI造影（A）T 1 -加权和T <子> 2 -加权对比度幻影包括与实验（MnPB-A488-ANG2）和对照（MnPB-A488-ABC和MnPB-A488）的纳米颗粒处理过的BSG D10细胞固定数量的提高。 （B）与实验（MnPB-A488-ANG2）处理BSG D10电池和控制（MnPB-A488-ABC和MnPB-A488）的纳米颗粒归信号强度，** P <0.05。从参考10转载由鸠出版社有限公司
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Discussion
本文提出的方法为一类新的基于biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的多峰分子成像剂的合成。掺入纳米颗粒中的分子成像模式是荧光成像和分子MRI检查，由于它们的互补特征。该biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子具有核 - 壳设计。在这些纳米颗粒的合成中的关键步骤是：1）一釜合成这产生了被包括普鲁士蓝纳米颗粒的核心（PB NPS），含钆普鲁士蓝纳米颗粒（GdPB），或含锰普鲁士蓝纳米颗粒（MnPB），2）biofunctionalization使用荧光抗生物素蛋白通过静电自组装的纳米颗粒，和3）连接的生物素化的配位体（抗体）使用鲁棒抗生物素蛋白 - 生物素相互作用的纳米颗粒。两个荧光抗生物素蛋白和生物素化的配位体构成的biof纳米颗粒的unctional壳。
该一釜合成产生的PB的NP，GdPB或MnPB发挥功能都为T 1和T用于MRI 2造影剂。加载到纳米颗粒核的顺磁离子（钆或锰）的量可以改变（增加或减少），通过改变顺磁含离子的盐的量（钆（Ⅲ）硝酸盐和氯化锰）中的一锅合成（步骤1.2）。这导致改变的（增加或减少）的MRI信号强度。然而，这些修饰的合成方案，可能会导致不稳定，聚集的纳米颗粒。以减轻与聚合相关联的关注，一锅合成可以进行修改以结合尺寸控制性合成20中的封端剂，如柠檬酸盐。
所述纳米粒子核的Biofunctionalization通过静电自组装用荧光抗生物素蛋白，它ENAB实现莱荧光成像。静电自组装，需要相反电荷的纳米颗粒的表面和涂布聚合物（在本文中，荧光抗生物素蛋白）上。以改变纳米颗粒的表面功能性，抗生物素蛋白可通过带正电荷的聚合物（ 例如聚赖氨酸或含有聚乙二醇的胺-基）的合成期间被替换。然而，纳米颗粒和包衣聚合物的相对比例将必须进行优化，以保持纳米颗粒尺寸和稳定，防止聚集。
加入生物素化的抗体上的抗生物素蛋白包覆的纳米微粒的赋予分子的定位功能，在PB-基于纳米颗粒。这一步是基于抗生物素蛋白和生物素之间的相互作用健壮（平衡解离常数K D〜10 -15）。与前面的步骤中，抗生物素蛋白包覆的纳米粒子和生物素化的配位体的相对比例必须运timized以便防止生物素化配体从同时结合导致纳米粒子聚集2抗生物素蛋白包覆的纳米微粒。分子靶向，该抗体可以通过其他的靶向配体，例如抗体片段（FAB），单链可变片段（scFv），肽，或适体来代替。
该方法的合成biofunctionalized纳米粒子作为多峰的主要优势，分子成像剂是：1）浅显一锅（1-步骤）合成纳米粒子核的，和2）的顺序接触步骤（静电自组装和抗生物素蛋白生物素的相互作用），用于与生物功能壳涂覆纳米颗粒核。纳米颗粒的其他优点包括以下事实普鲁士蓝（作为Radiogardase出售）已经获得FDA批准用于人类使用，并且所导致的一锅合成方案的纳米颗粒可被用作MRI对比剂既T中1（阳性）和T 2 </子>（负） - 加权序列，这是不容易使用其他的造影剂或纳米颗粒平台无需复杂的合成方案或专门化学品合成的造影剂来实现的。该技术的一个限制是合成可导致多分散纳米颗粒的聚集体，如果在这两个纳米颗粒核的合成和生物功能的外壳涂层的步骤，反应物的相对比例是不严格在这些特定的步骤中使用的反应物优化。例如，对于涂布抗生物素蛋白的纳米颗粒芯的相对比例不能延伸到涂敷聚赖氨酸的纳米颗粒没有事先优化研究。
掌握技术合成这里所描述biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子后，这种多功能的设计可以被修改为在体内分子成像研究。这将需要该纳米颗粒的聚乙二醇化对于较低与免疫ogenicity和体内更长的循环时间。类似于这里所描述的设计中，该PB的NP可以biofunctionalized与之前在体内施用抗体。其他研究包括使用biofunctionalized PB纳米粒用于治疗诊断（同步疗法+诊断） 体内应用。研究调查使用普鲁士蓝纳米颗粒用于光热治疗（基于在近红外波长的吸光度特性）目前正在21。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
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