Abstract
Multimodale, ermöglicht die molekulare Bildgebung die Visualisierung biologischer Prozesse auf zellulärer, subzellulärer und molekularer Ebene mit mehreren Auflösungen, ergänzende bildgebende Verfahren. Diese bildgebenden Mittel erleichtern die Echtzeit-Beurteilung von Wegen und Mechanismen in vivo, die sowohl diagnostische als auch therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen. Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese von biofunktionalisierte Berliner Blau-Nanopartikel (NPs PB) - eine neue Klasse von Mitteln zur Verwendung in multimodale, molekulare Bildgebung Anwendungen. Die bildgebenden Verfahren in der Nanopartikel, Fluoreszenzbildgebung und Magnetresonanztomographie (MRI) eingebaut ist, komplementäre Funktionen. Die PB-Nanopartikel besitzen eine Kern-Schale-Design, bei dem Gadolinium und Manganionen in den Zwischenräumen des PB Gitter eingebaut erzeugen MRI Kontrast sowohl in T 1 und T 2 -gewichteten Sequenzen. Die PB-Nanopartikel mit fluoreszierenden Avidin beschichtete mit elektrostatische Selbst alsMontage, die Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht. Die Avidin-beschichteten Nanopartikel mit biotinyliertem Liganden, die molekulare Targeting-Fähigkeiten an die Nanopartikel zu verleihen modifiziert. Die Stabilität und Toxizität der Nanopartikel werden gemessen, sowie deren MRI Relaxivitäten. Die multimodale, molekulare Bildgebung Fähigkeiten dieser biofunktionalisierte PB-Nanopartikel werden dann durch sie für Fluoreszenz-Bildgebung und molekularer MRT in vitro nachgewiesen.
Introduction
Molekulare Bildgebung ist die nicht-invasive und gezielte Visualisierung biologischer Prozesse auf zellulärer, subzellulären und molekularer Ebene 1. Die molekulare Bildgebung ermöglicht eine Probe in seiner nativen Mikroumgebung zu bleiben, während seine endogene Wege und Mechanismen werden in Echtzeit ausgewertet. Typischerweise beinhaltet die molekulare Bildgebung die Verabreichung eines exogenen Kontrastmittel in der Form eines kleinen Moleküls, Makromolekül, oder Nanopartikel zu visualisieren, Ziel und Spuren relevanten physiologischen Prozesse untersucht 2. Die verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, die in der molekularen Bildgebung untersucht worden sind, umfassen MRI, CT, PET, SPECT, Ultraschall, Photoakustik, Raman-Spektroskopie, Biolumineszenz, Fluoreszenz und Intravitalmikroskopie 3. Multimodal-Bildgebung ist die Kombination von zwei oder mehr bildgebende Verfahren, wo die Kombination erhöht die Fähigkeit, zu visualisieren und zu charakterisieren verschiedenen biologischen Prozessen und Ereignissen 4. Multimodal Bildgebung nutzt die Stärken der einzelnen Abbildungstechniken, unter Kompensation der individuellen Grenzen 3.
Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese von biofunktionalisierte Berliner Blau-Nanopartikel (NPs PB) - eine neue Klasse von multimodalen, molekulare Bildgebung Agenten. Die PB-Nanopartikel sind für die Fluoreszenz-Bildgebung und molekularer MRT eingesetzt. PB ist ein Pigment, das aus alternierenden Eisen (II) und Eisen (III) -Atome in einer flächenzentrierten kubischen Netzes (Abbildung 1). CN - - Fe III Gestänge, die Kationen enthält, um Ladungen in ihrem dreidimensionalen Netzwerk 5 Ausgleichen der PB Gitter linearer Cyanidliganden in einer Fe II besteht. Die Fähigkeit von PB um Kationen in die Gitter einbauen wird separat Laden Gadolinium und Mangan-Ionen in die PB-Nanopartikel für MRT-Kontrast ausgebeutet.
Der Grund für die Verfolgung einer Nanopartikel-Design für MRT-Kontrast ist wegenDie Vorteile dieser Konstruktion bietet gegenüber aktuellen MRI-Kontrastmittel. Die große Mehrheit der US-FDA-zugelassenen MRI-Kontrastmittel sind Gadoliniumchelaten, die paramagnetischen in der Natur sind und eine positive Kontrast durch die Spin-Gitter-Relaxationszeit Mechanismus 6.7.8. Im Vergleich zu einem einzigen Gadolinium-Chelat, das niedrige Signalintensität bietet auf seine eigene, bietet der Einbau von mehreren Gadoliniumionen im PB Gitter der Nanopartikel verbesserte Signalintensität (positiver Kontrast) 3,9. Weiterhin kann die Anwesenheit von mehreren Gadoliniumionen im PB Gitter erhöht die Gesamtspindichte und das Ausmaß der Paramagnetismus der Nanopartikel, die das lokale Magnetfeld in ihrer Umgebung stört, wodurch Negativkontrast durch die Spin-Spin-Relaxationszeit Mechanismus erzeugt wird. Somit funktionieren die Gadolinium enthaltenden Nanopartikel sowohl als T 1 (positiv) und T 2 (negative) Kontrastmittel 10,11.
In einer Untergruppe von Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion ist die Verwaltung der Gadolinium-Kontrastmitteln für die Entwicklung von nephrogener systemischer Fibrose 8,12, 13 in Verbindung gebracht. Diese Beobachtung hat Untersuchungen zum Einsatz alternativer paramagnetische Ionen als Kontrastmittel für aufgefordert MRI. Daher wird die vielseitige Konstruktion der Nanopartikel ausgelegt ist, Manganionen in dem PB Gitter einbauen. Ähnlich wie Gadolinium-Chelaten sind Mangan-Chelate auch paramagnetisch und werden typischerweise verwendet, um positive Signalintensität bei MRI 7,14 bereitzustellen. Wie bei gadoliniumhaltigen PB NPs, die Mangan enthaltende PB NPs auch als T 1 (positiv) und T 2 (negative) Kontrastmitteln.
Um Fluoreszenz-Imaging-Funktionen zu integrieren, werden die Nanopartikel "Kerne" mit einem "biofunktionellen" Schale, bestehend aus dem fluoreszenzmarkierten Glykoprotein Avidin (Abbildung 1 beschichtet). Avidin ermöglicht nicht nur die Fluoreszenz-Bildgebung, sondern dient auch als eine Dockingplattform biotinylierten Liganden, die bestimmte Zellen und Gewebe zielen. Die Avidin-Biotin-Bindung ist eine der stärksten bekannten, nicht-kovalente Bindungen, gekennzeichnet durch extrem starke Affinität zwischen Avidin und Biotin 15. Die Befestigung des biotinylierten Liganden an das Avidin-beschichtete PB NPs verleiht molekulare Targeting-Fähigkeiten für die PB-Nanopartikeln.
Die Motivation für die Verfolgung Fluoreszenz- und MR-Bildgebung mit PB-Nanopartikel ist, weil diese bildgebenden Verfahren besitzen komplementäre Funktionen. Fluoreszenzabbildung ist eine der am häufigsten verwendeten optischen molekularen Bildgebung, und ermöglicht die gleichzeitige Darstellung mehrerer Objekte mit hohen Empfindlichkeiten 1,16,17. Fluoreszenz-Imaging ist eine sichere, nicht-invasive Modalität ist jedoch mit geringen Eindringtiefen und räumlichen Auflösungen 1,3,16 verbunden. Andererseits erzeugt MRI hoher zeitlicher eind räumliche Auflösung nicht-invasiv und ohne eine Notwendigkeit für ionisierende Strahlung 1,3,16. Allerdings MRI leidet unter geringer Empfindlichkeit. Daher Fluoreszenz-Bildgebung und MRT wurden als die molekularen Bildgebung aufgrund ihrer komplementären Merkmale der Eindringtiefe, Empfindlichkeit und Ortsauflösung gewählt.
Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese und Biofunktionalisierung der PB-Nanopartikel, gadoliniumhaltigen PB-Nanopartikel (GdPB) und manganhaltigen Nanopartikeln PB (MnPB) 10,11. Die folgenden Methoden werden beschrieben: 1) Messung der Größe, Ladung und zeitliche Stabilität der Nanopartikel, 2) die Bewertung der Zytotoxizität der Nanopartikel, 3) Messung der MRI Relaxivitäten und 4) Nutzung der Nanopartikel für Fluoreszenz- und molekulare MR-Bildgebung einer Population von Zielzellen in vitro. Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial der nationalen Parlamente für die Verwendung als multimodale, molekulare Kontrastmittel in vivo.
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Protocol
1. Synthese von PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB
Synthese der Nanopartikel (PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB) unter Verwendung einer Eintopfsynthese Schema indem Sie die Schritte unten detailliert erreicht:
- Bereiten Lösung "A", das 5 ml 5 mM Kaliumhexacyanoferrat (II) in deionisiertem (DI) Wasser. Je nach Art des Nanopartikels, das synthetisiert wird - PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB, bereiten Lösung "B" wie folgt:
- Für PB-Nanopartikel: Vorbereitung 10 ml einer Lösung, die 2,5 mM Eisen (III) -chlorid in DI-Wasser.
- Für GdPB NPs: Herstellung von 10 ml einer Lösung, die 2,5 mM jedes der Gadolinium (III) nitrat und Eisen (III) -chlorid in DI-Wasser
- Für MnPB NPs: Herstellung von 10 ml einer Lösung, die 2,5 mM jedes der Mangan (II) -chlorid und Eisen (III) -chlorid in DI-Wasser.
- Hinzufügen Lösung "B" in einen Rundkolben gegeben, und der Inhalt des Kolbens bei Raumtemperatur (RT) rühren und1000 Upm. In Lösung "A" tropfenweise in den Rundkolben haltigen Lösung "B". Kontrollieren Sie die Durchflussmenge für die Zugabe von Lösung "A" bis "B" durch eine peristaltische Pumpe eingestellt auf etwa 10 ml / h zu verzichten.
- Weiterhin Rühren mit 1000 rpm bei Raumtemperatur für weitere 30 min nach der Zugabe der Lösung "A" bis "B" ist abgeschlossen. Stoppen Rühren und sammeln Sie die Mischung.
- Übertragen Aliquots der Mischung in Mikrozentrifugenröhrchen, die Nanopartikel frei von nicht umgesetzten Komponenten zu spülen. In 5 M NaCl (0,2 ml NaCl / ml Reaktionsmischung) zu jedem Aliquot in Partikelsammlung durch Zentrifugation zu unterstützen.
- Zentrifuge jedes Aliquot von Nanopartikeln für mindestens 10 min bei 20.000 × g. Nach dem Zentrifugieren vorsichtig den Überstand.
- Resuspendieren jedes Nanopartikel-Pellet in 1 ml DI-Wasser durch Ultraschallbehandlung mit einer Mikrospitze (Beschallung Impuls an / aus = 1/1 sec, Amplitude = 50%, Laufzeit =5 s, Beschallungsgerät Leistung = 125 W) zum Aufbrechen der Tablette.
- Die Schritte 1,4-1,6 mindestens 3 × um sicherzustellen, dass die Nanopartikel sind frei von Komponenten der anfänglichen Reaktion und Reaktionsnebenprodukte. Nach der letzten Zentrifugation, Resuspension Partikel in 1 ml DI-Wasser.
2. Biofunktionalisierung von PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB
Biofunktionalisierung der Nanopartikel umfasst Beschichtung der Nanopartikel "Kerne", die mit Avidin und Hinzufügen biotinylierten Liganden, wie unten beschrieben:
- Die Beschichtung der Nanopartikel mit fluoreszierenden Avidin
Beschichtung der Nanopartikel mit fluoreszierendem Avidin unter Verwendung elektrostatischer Selbstorganisation erreicht, wo positiv geladene Avidin (pI ~ 10,5) als Beschichtung auf den negativ geladenen Nanoteilchen wie folgt 18:- Bereiten Suspensionen der PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB in 1 ml DI-Wasser. Filter Alexa Fluor 488-markiertem Avidin (A488; in DI Wasser wiederhergestellt)durch ein 0,2 um Nylon-Mikrofilter bei 14.000 × g für 10 min. Fügen ≤0.2 mg Avidin / mg Nanopartikel. Fügen Sie jede gefilterte Aliquot A488 separat auf die Teilmengen von PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB.
- Kontaktieren der Nanopartikel mit A488 für 2-4 h unter leichtem Schütteln oder Rotation bei 4 ° C. Schützen Sie die Proben vor Licht mit Aluminiumfolie.
HINWEIS: Dieser Schritt Erträge A488 beschichtet PB-Nanopartikel (PB-A488), GdPB (GdPB-A488) und MnPB (MnPB-A488).
- Befestigung von biotinylierter Antikörper
Befestigung von biotinyliertem Targeting-Antikörper auf die Avidin-beschichteten Nanopartikel erfolgt mittels Avidin-Biotin-Wechselwirkungen, wie folgt:- Bereiten Suspensionen der Avidin beschichtete Nanopartikel - PB-A488, GdPB-A488 und MnPB-A488 in 1 ml DI-Wasser. Filtern biotinylierten Antikörper (vom Hersteller geliefert) durch ein 0,2 um Nylon-Mikrofilter bei 14.000 × g für 10 min.
HINWEIS: Hier verwendet die vorliegende Studie biotinylated anti-Neuron-Glia-Antigen 2 (ANG2) die NG2 in Zellen und Gewebe des zentralen Nervensystems und überexprimiert zielt biotinylierten Anti-Mensch-Eotaxin-3 (Eot3), die Rezeptoren an Eosinophilen oder eosinophilen Zellinien überexprimiert abzielt. - Fügen jedes gefilterte Aliquot von biotinylierten Antikörper getrennt mit den Aliquots der Avidin-beschichteten Nanopartikel. Fügen ≤0.05 mg biotinyliertem Antikörper / mg Avidin-beschichteten Nanopartikel. Kontaktieren der Avidin-beschichteten Nanopartikel mit den biotinylierten Antikörper (ANG2 oder Eot3) für 2-4 h unter leichtem Schütteln oder Rotation bei 4 ° C. Schützen Sie die Proben vor Licht mit Aluminiumfolie.
HINWEIS: Dieser Schritt Erträge Antikörper beschichteten Nanopartikel (zB GdPB-A488-Eot3 und MnPB-A488-ANG2).
- Bereiten Suspensionen der Avidin beschichtete Nanopartikel - PB-A488, GdPB-A488 und MnPB-A488 in 1 ml DI-Wasser. Filtern biotinylierten Antikörper (vom Hersteller geliefert) durch ein 0,2 um Nylon-Mikrofilter bei 14.000 × g für 10 min.
3. Sizing, Zeta-Potential, und die zeitliche Stabilität der Nanoteilchen
Die Größenverteilung, Ladung, und die Stabilität der Nanopartikel mit dynamischen MessLichtstreuung (DLS) Verfahren wie nachstehend beschrieben:
- Dimensionierung der Nanopartikel
Dimensionierung der Nanopartikel mit dynamischer Lichtstreuung wie folgt erreicht:- Zugabe von 10 ul des Nanopartikels Probe (1 mg / ml) zu 990 & mgr; l DI-Wasser in einem wegwerfbaren Kunststoff Küvette.
Hinweis: Dies ist repräsentativer Wert für eine gute DLS-Signal. - Verschließen Sie die Küvette und Vortex gut mischen. Setzen Sie die Küvette in einem System verwendet werden, um Partikelgröße, um die Größe der Nanopartikel messen analysieren. Führen Sie die Partikelgrößenanalyse bei einem Messwinkel von 173 °.
- Zugabe von 10 ul des Nanopartikels Probe (1 mg / ml) zu 990 & mgr; l DI-Wasser in einem wegwerfbaren Kunststoff Küvette.
- Zeta-Potential der Nanopartikel
Zeta-Potential der Nanopartikel wird wie folgt gemessen unter Verwendung einer Phasenanalyselichtstreuung:- 100 l des Nanopartikels Probe (1 mg / ml) zu 900 & mgr; l DI-Wasser in einem wegwerfbaren Kunststoff Kapillarzelle. Dieser Wert ist repräsentativ für einen guten Zetapotentialmessung.
- Legen Sie die Kapillary Zelle in einem System verwendet werden, um Zetapotential um die Zetapotential der Nanopartikel unter Verwendung der Standardparameter bei 25 ° C zu messen analysieren.
- Zeitliche Stabilität der Nanopartikel
Zeitliche Stabilität der Nanopartikel wird unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung bestimmt, wie folgt:- Bewertung der Stabilität von Nanopartikeln durch die Messung der Größe der Nanopartikel in DI-Wasser sowie Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), wie in Abschnitt 3.1 beschrieben.
- Wiederholen Sie die Größenmessungen in DI-Wasser und DMEM einmal / Tag über einen Zeitraum von 5 Tagen.
4. Die Zytotoxizität der Nanoteilchen
Zytotoxizität der Nanopartikel wird wie folgt gemessen unter Verwendung eines XTT-Zellproliferationstest:
- Seed 10.000-15.000 Zellen / Vertiefung von jedem Zelltyp untersucht (Neuro2a, BSG D10, EoL-1 und OE21) in einer 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen der ausgesäten Zellen nicht eXceed 0,2 ml / Vertiefung. Siedelten Zellen beimpft und über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Inkontaktbringen Nanopartikel mit Zellen:
- Inkubieren der Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Nanopartikel (0,01 bis 0,5 mg / ml). Siehe Tabelle 1 als Vertreter Tabelle, die die Mengen der Nanopartikel beschrieben (in 50 ul) zugesetzt, um die Zellen nach der Entfernung 50 ul Medium / Vertiefung.
- Um für jede störende Absorption der Nanopartikel in der Assay-Konto, fügen Sie eine leere, bestehend aus der entsprechenden Konzentration von Nanopartikeln (0-0,5 mg / ml; in Äquivalenz mit den Mengen zu den Zellen gegeben) auf Medium ohne Zellen.
- Inkubieren Zellen mit Nanopartikeln über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. Absaugen Medien aus jeder Vertiefung und spülen Sie mit Färbepuffer von 5% fötalem Rinderserum (FBS) in phosphatgepufferter Lösung (PBS) zusammen. Füge 100 ul Medium ohne Phenolrot und bei 37 ° C und 5% CO 216-18 Std.
- Inkubieren der Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Nanopartikel (0,01 bis 0,5 mg / ml). Siehe Tabelle 1 als Vertreter Tabelle, die die Mengen der Nanopartikel beschrieben (in 50 ul) zugesetzt, um die Zellen nach der Entfernung 50 ul Medium / Vertiefung.
- Bereiten Sie die XTT-Zellproliferationstest Arbeitslösung hergestellt, indem die Komponenten des Kits (XTT-Reagenz und XTT Activator) nach den Angaben des Herstellers. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie 100 ul RPMI (RPMI w / o Phenolrot + 10% FBS + 1 x Pen-Strep) oder geeigneten Medium für die Zelltyp untersucht. In 50 ul XTT Arbeitslösung in jede Vertiefung und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 bis 2,5 Stunden.
- Die Absorption bei 490 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm, um Fingerabdrücke oder Flecken zu korrigieren. Berechnen Sie die korrigierte Extinktion für jede Vertiefung (A 490 -A 630) und der Mittelwert der Messwerte für Wiederholungen.
- Subtrahieren Sie die Leerwerte aus jeder Vertiefung Wert, um die endgültigen korrigierten Absorptionswerte zu berechnen. Der prozentuale Überleben für jede Probe durch Normalisieren der endgültigen korrigierten Absorption der von unbehandelten Zellen ohne Nanoteilchen. Plot survival Prozentsatz als Funktion der Nanopartikelkonzentration.
5. MRT Relaxivitäten der PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB
MRI Relaxivität gemessen wird unter Verwendung von T 1 - und T 2 -gewichteten Sequenzen durch Herstellung eines MRI "Phantom" unter Verwendung eines 96-Well-Platte, die Nanopartikel enthalten, wie unten beschrieben:
- Phantom Vorbereitung
- Bereiten Sie eine Platte mit 96 Vertiefungen mit jeweils gut, das 100 & mgr; Nanopartikel (PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB) in der entsprechenden Konzentration. Beginnend mit einer Konzentration von 0,4 mM für jeden Typ von Nanopartikeln, seriell verdünnt den Nanopartikeln 2 x mit DI-Wasser bis zu einer Konzentration von 2,4 × 10 -5 M erreicht wird (dies erfordert 14 Verdünnungen und 15 Vertiefungen).
- 100 l Schmelze 1% igen Lösung in VE-Wasser in jedes Well geben und gut mischen. Sollte das Gel bei 4 ° C für 12 Stunden zu verfestigen.
HINWEIS: Dies ergibt eine Phantom enthalten Verdünnungsreihendie Nanopartikel in Agarose verfestigte. - Legen Sie die Phantom in horizontaler 3 T klinischen Magnet unter einem massiven Block aus 2% Agar (150 cm 3). Sichern Sie die Phantom und Block von Agar in der Mitte eines 8-Kanal HD Gehirn Spule. Messen Relaxationszeiten Verwendung von 0,5 mm dicken koronale Schnitte auf halber Höhe der Platte mit 96 Vertiefungen 11.
- T 1 - und T 2 -gewichteten Sequenzen
Verwenden Sie die folgenden repräsentativen Einstellungen für den Erwerb der Sequenzen, die in der klinischen Magnet.
ANMERKUNG: Diese Werte werden für die in der vorliegenden Studie verwendeten Nanopartikel optimiert:- Erwerben T 1 -gewichteten (T1W) MR-Bilder mit dem folgenden Flüssigkeit gedämpfte Inversion-Recovery (FLAIR) Reihenfolge: Echo Zug (ET) = 8, Wiederholzeit (TR) = 2.300 ms, Echozeit (TE) = 24,4 ms, Matrix Größe = 512 x 224, Sichtfeld (FOV) = 16 x 16 cm 2.
- Erwerben T 2 -gewichteten (T2W) MR-Bilder mit dem folgenden schnellen relaxation schnelle Spin-Echo (FRFSE) Reihenfolge: ET = 21; TR = 3500 ms; TE = 104 ms; Matrix size = 512 x 224; FOV = 16 × 16 cm 2.
- Erwerben T1W und T2W MR-Bilder bei 127 MHz (3 T) bei den folgenden Inversionszeiten: 50, 177, 432, 942, 1.961 und 4.000 ms.
- Die Messung der MRI Relaxivitäten
- Nach der Übernahme T1W und T2W Bilder mit den in Abschnitt 5.2 beschriebenen Sequenzen, messen Sie die Signalstärke für jede Vertiefung mit ImageJ, fortan als Region of Interest (ROI), indem Sie jede ROI mit dem ovalen Frucht Schaltfläche in der Werkzeugleiste befindet bezeichnet, dann Auswählen Analysieren> Messen.
HINWEIS: Ein Pop-up sollte die mittlere Signalintensität jedes ROI unter der Spalte mit der Bezeichnung "Mean" anzuzeigen. - Für jede ROI, zeichnen Sie die gemessenen Signalintensität gegen seine spezifische Umkehrzeit. Bei Bedarf invertieren Punkte (Messwerte), die eine anfängliche "Blase" oder Ausreißer zu Beginn der Handlung erzeugen (untere Umkehrmal).
ANMERKUNG: Diese Werte werden bei geringer Inversionszeiten erzeugt, weil MRT misst den Betrag oder Absolutwert der Bilder anstatt ihre tatsächliche (negative) Wert, der berücksichtigt werden muss / 19 korrigiert. - Bereiten Sie eine exponentielle Anpassung für jede Handlung des Signalintensität für die ROIs (SI) vs. Umkehrzeiten (T I), wie in Abschnitt 5.2 beschrieben. Plot T I auf der x-Achse, SI auf der y-Achse; ɑ und Δ Konstanten durch Regression bestimmt wird, und T 1 oder T 2 ist die Variable zu lösen:
wobei t = T 1, T 2. - Auflösen nach T 1 oder T 2 unter Verwendung der obigen Gleichung und Plotten der inversen der berechneten Werte (1 / T1 und 1 / T 2) gegen die Konzentration der in jedem ROI verwendeten Nanopartikel.
- Berechnen der Steigung des linearen Graph,ergibt die Relaxivitäten R 1 und R 2.
HINWEIS: Der folgende Abschnitt des Protokolls beschreibt die Anwendung der Nanopartikel zur Fluoreszenzmarkierung und die Erzeugung von MRI-Kontrast in Zielzellen.
- Nach der Übernahme T1W und T2W Bilder mit den in Abschnitt 5.2 beschriebenen Sequenzen, messen Sie die Signalstärke für jede Vertiefung mit ImageJ, fortan als Region of Interest (ROI), indem Sie jede ROI mit dem ovalen Frucht Schaltfläche in der Werkzeugleiste befindet bezeichnet, dann Auswählen Analysieren> Messen.
6. Fluoreszenzmarkierung von Zielzellen Mit der Nanopartikel - konfokale Mikroskopie
HINWEIS: Die Nanopartikel (PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB) können verwendet werden, um Fluoreszenz zu kennzeichnen eine Population von Zielzellen (durch konfokale Mikroskopie überwacht) wie folgt:
- Synthese des fluoreszierenden Nanopartikeln
- Synthetisieren GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 zur Fluoreszenzmarkierung von einer Population von Zielzellen indem Sie die Schritte in den Abschnitten 1 und 2 aufgeführt.
- Vorbereitung der Zellen für die Fluoreszenz-Targeting
- Coat-Nr. 1,5 Mikrodeckgläser durch Eintauchen in eine Lösung von 0,002% Poly (L-Lysin) Hydrobromid für 90 min. Entfernen Sie die Deckgläser aus der Lösung und lassen Sie sie für 24 Stunden trocknen lassen.
- Samen die Zellen (zB EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) auf den beschichteten Deckgläsern in einer 6-Well-Platte gelegt und bei 37 ° C und 5% CO 2 für mindestens 16 Std. Mit einer 1 × PBS-Lösung und spülen Sie die Zellen (optional) befestigen mit 10% Formaldehyd in neutraler Pufferlösung für 15 min. Stain Zellen mit 5 & mgr; M rot-orange zelldurchdringenden Farbstoff in PBS bei 37 ° C für 30 min. Anschließend spülen Zellen mit PBS.
- > Fluoreszenzmarkierung von Zielzellen
- 1% Rinderserumalbumin (BSA; in entionisiertem Wasser) auf die Zellen, um eine unspezifische Bindung zu minimieren, auf die Zellen, und bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Inkubieren Zellen mit den Nanopartikeln in 1% BSA für 1 Std. Für EoL-1: Inkubation mit 0,2 mg / ml GdPB-A488 oder GdPB-A488-Eot3; Für BSG D10 und SUDIPG1: Inkubation mit 0,2 mg / ml MnPB-A488 oder MnPB-A488-ANG2. Spülen Sie die Zellen mit PBS 3 x zu entfernen unbound Nanopartikel.
- Vorsichtiges Umdrehen des Deckglases (die Zellen und Nanopartikel) auf einem Objektträger, um sicherzustellen, dass es keine Luftbläschen. Verschließen Sie die Kante zwischen dem Deckglas und Objektträger durch eine sorgfältige Anwendung von klaren Nagellack. Bild die Zellen mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop.
7. Fluoreszenzmarkierung von Zielzellen Mit der Nanopartikel - Durchflusszytometrie
Die Nanopartikel (PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB) auf Fluoreszenz-Label verwendet werden, eine Population von Zielzellen (mittels Durchflusszytometrie überwacht) wie folgt:
- Bereiten Suspensionen der Zellen in PBS abgezielt. Für reine Kulturstudien, die Suspensionen bestehen aus einem Zelltyp (zB BSG D10); Resuspension eines Zellpellets von BSG D10-Zellen in PBS mit 100.000 Zellen / ml (10 ml insgesamt). Für Mischkultur-Studien, die Suspensionen bestehen aus mindestens zwei Zelltypen (zB EoL-1 und OE21); ähnlich wie BSG D10, resuspendieren Zellpellets der EoL-1 und OE21 in PBS bei 100.000 Zellen / ml je (10 ml insgesamt).
- Planen verschiedener Verhältnisse des EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: (jede EoL-1 und OE21 1 ml) 1, 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
- Blockieren die Zellen (reine und gemischte Suspensionen) durch Nanopartikel mit 2 ml 5% BSA, zu minimieren unspezifischen Bindung ausgerichtet.
- 1 ml (1 mg / ml) Nanopartikel zu den Zellen und inkubiere für 1 Stunde. Für BSG D10, Inkubation Zellen mit MnPB-A488, MnPB-A488-AbC (Kontrollantikörper), oder MnPB-A488-ANG2). Für Mischungen von EoL-1 und OE21, brüten die Mischungen mit einem Betrag von GdPB-A488-Eot3.
- Spüle die Zellen von ungebundenem Nanopartikel durch Abzentrifugieren der Proben bei 1000 × g für 5 min bei mindestens 3 × um ungebundene Partikel zu entfernen. Die Zellen in 1 ml PBS und fixieren mit 10% Formaldehyd in PBS. Fleckzellen durch Inkubation mit 10 & mgr; g / ml7-Aminoactinomytcin D in PBS auf Eis für 30 min. Spülen mit PBS, dann analysieren 10.000 Wohnzellen aus jeder Probe mit einem Durchflusszytometer.
8. Generieren von MRI-Kontrast auf Zielzellen Mit der Nanopartikel
Die Nanopartikel (PB NPs GdPB und MnPB) kann verwendet werden, um MRI-Kontrast (in beiden T 1 - und T 2 -gewichteten Sequenzen) zu erzeugen, wie folgt, in einer Population von Zielzellen:
- Phantom Vorbereitung
- Wachsen Zellen (zB BSG D10) in T75-Kolben, bis ~ 80% Konfluenz. Verwenden Sie geeignete Wachstumsmedium Bedingungen. BSG D10, wachsen die Zellen in DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Spülen Zellen frei von Medium, das mit 5 ml PBS und Blockieren der Zellen mit 5 ml 1% BSA in PBS für 1 h zur Minimierung unspezifischer Bindung. 5 ml (0,5 mg / ml) Nanopartikel an die Zellen. Für BSG D10, Inkubation der Zellen mit MnPB-A488, MnPB-A488-AbC (Kontrollantikörper) und MnPB-A488-ANG2 1 Stunde.
- Spülen Zellen 3x mit 5 ml PBS, um ungebundene Nanopartikel zu entfernen. Trypsinieren der Zellen durch Inkubation der Zellen mit 2 ml Trypsin-EDTA 0,25% ige Lösung 1 x für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2, um sie von dem Kolben für Phantom Herstellung lösen. 8 ml DMEM, das Trypsinisierung der Zellen zu löschen.
- Sammle die Zellen durch Zentrifugieren bei 1.000 × g für 5 min; saugen Sie den Überstand. Resuspendieren der Zellen in 1 ml PBS und 1 ml 10% Formaldehyd in PBS, um die Zellen zu fixieren. Füge 100 & mgr; l von jeder Probe in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- 100 l Schmelze 1% igen Lösung in VE-Wasser in jedes Well geben und gut mischen durch Auf-und Abpipettieren. Sollte das Gel bei 4 ° C für 12 Stunden zu verfestigen.
HINWEIS: Dies ergibt eine Phantom enthaltenden Zellen mit angeschlossenem Nanopartikeln in erstarrten Agarose. - Legen Sie die Phantom in horizontaler 3 T klinischen Magnet neben einem massiven Block aus 2% Agar (150 cm
- T 1 - und T 2 -gewichteten Sequenzen
Verwenden Sie folgende Einstellungen für den Erwerb der Sequenzen, die in der klinischen MRI-Magneten:- Erwerben T1W MR-Bilder mit dem folgenden Spinecho-Sequenz: Echo Zug (ET) = 1, Wiederholzeit (TR) = 650 ms, Echozeit (TE) = 11 ms, Matrix size = 320 x 256, Sichtfeld (FOV) = 10 x 10 cm 2.
- Erwerben T2W MR-Bilder mit dem folgenden FRFSE Reihenfolge: ET = 28; TR = 3000 ms; TE = 101 ms; Matrix size = 384 x 288; FOV = 10 × 10 cm 2.
- Post-Akquisitionsverarbeitung
- Zur besseren Ablesbarkeit, wandeln die ursprüngliche Graustufenbilder in einer Farbskala Bild mit ImageJ: Wählen Sie Bild> Typ> 8-Bit, um das Bild zu konvertieren in Graustufen.
- Berechnen Sie die normierte Intensität für jede Probe nach Abzug der Signalbeitrag aus dem Agarose-Lösung.
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Representative Results
Mit der Eintopfsynthese Schema, Nanopartikel aus PB-Nanopartikel (mittlerer Durchmesser 78,8 nm, Polydispersitätsindex (PDI) = 0,230; durch die dynamische Lichtstreuung Instrument berechnet), GdPB (mittlerer Durchmesser 164,2 nm, PDI = 0,102) oder MnPB ( mittlerer Durchmesser 122,4 nm, PDI = 0,124), die monodisperse (wie von DLS gemessen sind) konsequent synthetisiert werden (Abbildung 2A). Die gemessenen Zetapotentiale der synthetisierten Nanopartikel sind kleiner als -30 mV (2B), was auf eine mäßige Stabilität der Teilchen auf der Grundlage ihrer Oberflächenladungen. Die synthetisierten Nanopartikel weisen eine ausreichende zeitliche Stabilität über einen Zeitraum von 5 Tagen, wie durch ihre konsequente Größen (hydrodynamischen Durchmesser; 2C) angezeigt.
Wenn mit Zellen co-inkubiert wird, die Nanopartikel (PB NPs GdPB und MnPB) eine vernachlässigbare Cytotoxizität der Zellen unter bestimmten Schwellenkonzentrationen (Abbildung 3). Zytotoxizität stustirbt an PB Nanopartikeln auf Neuro2a Zellen zeigen vernachlässigbar Zytotoxizität, wenn sie mit Neuro2a co-inkubiert bei Konzentrationen von weniger als 0,67 × 10 -6 mg / Zelle (3A). Zytotoxizitätsstudien durch Co-Inkubation mit GdPB EoL-1 und OE21 Zellen geführt wurden, zeigen vernachlässigbare Cytotoxizität GdPB auf beiden Zelltypen in einer Konzentration niedriger als 0,25 x 10 -6 mg / Zelle (3B). Ähnliche, Zytotoxizität Studien zeigen vernachlässigbar Zytotoxizität MnPB wenn sie mit BSG D10 koinkubiert bei Konzentrationen von weniger als 0,25 × 10 -6 mg / Zelle (3C). Die zusätzliche Zytotoxizität MnPB und GdPB kann die Anwesenheit von zusätzlichen Ionen (Mn 2+ für MnPB und Gd 3+ für GdPB) innerhalb des Nanopartikelkern zurückzuführen.
MRI Relaxivität Studien wurden unter Verwendung von Phantomen variierender Konzentrationen an PB NPs GdPB und MnPB umfasst geführt. Die Studien zeigen die Nützlichkeit des nanoparkel als MRI-Kontrastmittel in beiden T1W und T2W Sequenzen (Abbildung 4). Dies wird durch die erhöhte Hyper (positiver Kontrast) in T 1 -gewichteten Sequenzen und erhöhte hypointensities (negativer Kontrast) in T 2 -gewichteten Sequenzen mit steigenden Konzentrationen von sowohl GdPB (4A) und MnPB (4B) gezeigt. Basierend auf den Messungen Relaxivität ist MnPB moderat T1 Mittel und eine starke T 2 Mittel während GdPB eine starke T 1 Mittel und eine moderate T 2 Mittel (4C). Die gemessenen Relaxivitäten von GdPB und MnPB Vergleich mit denen der klinisch zugelassenen Kontrastmittel 10, 11.
Die biofunktionalisierte PB-Nanopartikel können fluoreszenz beschriften eine Population von Zielzellen in vitro (Abbildung 5). Wenn sowohl fluoreszierende Avidin (A488) und biotinyliertes Anti-Mensch-e biofunktionalisiertotaxin-3-Antikörper (Eot3) kann GdPB fluoreszenz Ziel eine Bevölkerung von EoL-1-Zellen (5B). Steuer GdPB Nanopartikel ohne Eot3 vernachlässigbare Bindung (5A) Wenn in ähnlicher Weise GdPB wird sowohl mit fluoreszierenden Avidin (A488) und biotinyliertes anti-neuronalen gliale Antigen-2 (ANG2) biofunktionalisiert können die Nanopartikel fluoreszierend Zielpopulationen von BSG D10 und SUDIPG1 Neurospheres (Figuren 5D und F), während die Steuer Nanopartikel ohne Targeting-Antikörper sind nicht fluoreszierend zu markieren, die Zellen (5C und D). Somit effizienten Targeting und Fluoreszenzmarkierung erfordern die Gegenwart von sowohl fluoreszierende Avidin und dem biotinylierten Zielligand.
Die Fähigkeit der biofunktionalisierten Nanopartikel fluoreszenz beschriften eine Population von Zellen, wie mittels Durchflusszytometrie quantifiziert, bestätigt die Notwendigkeit sowohl fluoreszierende Avidin und Biotinylated-Targeting-Liganden für eine effektive Fluoreszenzmarkierung (Abbildung 6). BSG D10-Zellen mit MnPB enthaltend sowohl A488 und ANG2 kontaktiert (MnPB-A488-ANG2) eine erhöhte Fluoreszenz (6A) und den Prozentsatz der Fluoreszenz-markierte Zellen (6B) im Vergleich zu fluoreszierenden Nanopartikeln mit einem Kontrollantikörper zu steuern (MnPB-A488 -abc) und ohne einen Antikörper (MnPB-A488). Die biofunktionalisiert Nanopartikel können in einer Zellmischung (6C) fluoreszenz gelten für einen bestimmten Sub-Population von Zellen. Dies wird als Festbeträge der EoL-1-Targeting nachgewiesen werden Fluoreszenz GdPB (GdPB-A488-Eot3) mit Zielzellen (EoL-1) und Kontrollzellen (OE21) kontaktiert. In der Mischung; Fluoreszenz nimmt zu, wenn Anteile von EoL-1 erhöht (6C erhöht Alexa Fluor 488 Signalintensität). Dies zeigt die Spezifität der Nanopartikel für diese Subpopulation von Zellen innerhalb des cell Mischung.
Die biofunktionalisierte PB-Nanopartikel erhöhen MRT-Kontrast in einer Population von Zielzellen (Abbildung 7). Wenn BSG D10-Zellen werden mit äquivalenten Konzentrationen von experimentellen (MnPB-A488-ANG2) und Kontrolle (MnPB-A488-ABC und MnPB-A488) Nanopartikel kontaktiert, Phantome eine erhöhte Hyper für Zellen mit MnPB-A488-ANG2 kontaktiert Vergleich zur Kontrollgruppe in T1W Sequenzen und erhöht Hypo für Zellen mit MnPB-A488-ANG2 kontaktiert Vergleich zu Kontrollen in T2W Sequenzen (7A). Bildanalyse der ROIs im Phantom bestätigen diesen Trend, wo Zellen mit experimentellen Partikel kontaktiert eine deutlich erhöhte Intensität, wenn die Kontrollen in T1W Sequenzen verglichen und Intensität im Verhältnis deutlich zurückgegangen, die Kontrollen im T2W Sequenzen (7B).
Abbildung 1: Das Core-Shell-Design der PB-Nanopartikel. Der Kern besteht aus einem Gitter PB, die aus linearen Cyanidliganden in einer Fe II besteht - CN -. Fe III Gestänge Diese Beziehungen ermöglichen PB NPs Kationen innerhalb seiner dreidimensionalen Netzwerk als Mittel von Ausgleichsladungen 5 berücksichtigt. Diese Kationenbindungsfähigkeit des Berlinerblau wird verwendet, um Gadolinium und Mangan-Ionen innerhalb des Gitters, das MRT-Kontrast bietet zu laden. Der Kern ist mit einem biofunktionellen Schale fluoreszierender Avidin umfaßt, um die Fluoreszenz-Bildgebung und biotinylierten Liganden ermöglichen, molekularen Ausrichtung ermöglichen beschichtet.
Abb. 2: Größe, Ladung und Stabilität der PB-Nanopartikel (A) Größenverteilungen der PB (blau), GdPB (rot) und MnPB (schwarz) Nanopartikel von DLS gemessen. (B (C) die zeitliche Stabilität der PB (blau), GdPB (rot) und MnPB (schwarz) Nanopartikel in Wasser (Feststoff) und DMEM (gestrichelte) für fünf Tage nach ihrer Synthese durch DLS gemessen.
Fig. 3: Die Cytotoxizität der PB NPs Zytotoxizitätsstudien unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von (A) PB-Nanopartikel in eine feste Anzahl von Neuro2a Zellen (B) GdPB um einen festen Betrag von EoL-1 und zugegeben OE-21-Zellen, die jeweils und ( C) MnPB zugegeben, um eine feste Anzahl von BSG D10-Zellen. Zellüberlebensrate wurde nach 24 und 48 Stunden berechnet. Mit Genehmigung aus Lit. 11 wiedergegeben, Copyright 2014 American Chemical Society; Ref 10 mit Genehmigung von Dove Press Ltd; und Ref 21 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry.
Abbildung 4: MR-Bilder und Relaxivitäten GdPB und MnPB bei 3 T. Hyperintensität in T 1 -gewichteten Sequenzen und Hypo in T 2 -gewichteten Sequenzen von (A) GdPB und (B) MnPB als Funktion der Konzentration der Nanopartikel. (C) Tabulation der relaxitivies der PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB aus Lit. 11, Copyright 2014 American Chemical Society gemessen bei 3 T. Reproduziert mit Genehmigung.
Abbildung 5: Fluoreszenzmarkierung der Zielzellen mit den biofunktionalisierte PB-Nanopartikel, wie Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie gemessen Bilder EoL-1-Zellen mit (A) Kontrolle (GdPB-A488) und (B) Versuchs (GdPB-A488-Eot3 behandelt. ) Nanopartikel.Bilder BSG Neurosphären mit (C) Steuer (MnPB-A488) und (D) Experimentier (MnPB-A488-ANG2) Nanopartikeln behandelt. Bilder SUDIPG1 Neurosphären mit (E) Steuerung (MnPB-A488) und (F) experimentelle (MnPB-A488-ANG2) Nanopartikeln behandelt. Mit Genehmigung aus Lit. 11 wiedergegeben, Copyright 2014 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6: Fluoreszenzmarkierung der Zielzellen mit den biofunktionalisierte PB-Nanopartikel, wie mittels Durchflusszytometrie gemessen (A) Durchflusszytometrie Histogramme der BSG D10 Zellen mit experimentellen (MnPB-A488-ANG2) und Kontrolle (MnPB-A488-ABC und MnPB behandelt. -A488) Nanopartikel. (B) Percentage der BSG D10-Zellen von der Platte (A), die Leuchtstoff sind (in% des Alexa-Fluor-positiv) bei Behandlung mit experimentellen (MnPB-A488-ANG2) und Kontrolle (MnPB-A488-ABC und MnPB-A488) Nanopartikel, ** p <0,05. (C) Die Durchflusszytometrie Streudiagramme einer Zellmischung mit verschiedenen Anteilen EoL-1 (Zielzellen) und OE21 (Kontrollzellen) durch die Nanopartikel (GdPB-A488-Eot3) ausgerichtet. Mit Genehmigung aus Lit. 11, Copyright 2014 American Chemical Society und aus Lit. 10 mit Genehmigung von Dove Press Ltd. reproduziert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 7: Erhöhung MRT-Kontrast in Zielzellen mit den biofunktionalisierte PB-Nanopartikel (A) T 1 -gewichteten und T <sub> 2 -gewichteten Kontrastverstärkung in Phantomen aus einer festen Anzahl von BSG D10 Zellen mit experimentellen (MnPB-A488-ANG2) und Kontrolle (MnPB-A488-ABC und MnPB-A488) Nanopartikeln behandelt zusammen. (B) normalisierte Signalintensität für BSG D10 Zellen mit experimentellen (MnPB-A488-ANG2) Behandlungs- und Kontroll (MnPB-A488-ABC und MnPB-A488) Nanopartikel, ** p <0,05. Aus Lit. 10 mit Genehmigung von Dove Press Ltd. reproduziert
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Discussion
Dieser Artikel wurde die Methoden für die Synthese einer neuen Klasse von multimodalen, molekulare Bildgebung Mittel auf Basis von biofunktionalisierte Berliner Blau Nanopartikel vorgestellt. Die molekularen Bildgebungsmodalitäten in die Nanopartikel aufgenommen sind Fluoreszenzabbildung und molekularen MRI aufgrund ihrer komplementären Funktionen. Die biofunktionalisierte Berliner Blau Nanopartikel eine Kern-Schale-Design. Die wichtigsten Schritte bei der Synthese dieser Nanopartikel sind: 1) Eintopfsynthese, die die Kerne, die von Berliner Blau Nanopartikel enthalten sind (PB NPs), Gadolinium-haltigen Berliner Blau Nanopartikel (GdPB) oder manganhaltigen Berliner Blau ergibt Nanopartikel (MnPB), 2) Biofunktionalisierung der Nanopartikel unter Verwendung von fluoreszierenden Avidin durch elektrostatische Selbstorganisation, und 3) die Befestigung der biotinylierten Liganden (Antikörper), die an die Nanopartikel unter Verwendung von robusten Avidin-Biotin-Wechselwirkungen. Beide fluoreszierende Avidin und biotinylierten Liganden bilden die bioFunctional Schale der Nanopartikel.
Die Eintopfsynthese liefert PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB, die sowohl als T 1 und T 2 Kontrastmittel für MRI funktionieren. Die Mengen der paramagnetischen Ionen (Gadolinium oder Mangan) in der Nanopartikelkern geladen wird verändert (erhöht oder verringert), die durch Variation der Mengen der paramagnetischen Ionen enthaltende Salze (Gadolinium (III) nitrat und Mangan (II) -chlorid) in der Eintopfsynthese (Schritt 1.2). Dies führt zu veränderten (erhöht oder verringert) MRT-Signalintensitäten. Allerdings können diese Änderungen an der Syntheseschema in instabilen, aggregierten Nanopartikel führen. Um die Bedenken mit Aggregation zu mindern, kann der Eintopfsynthese modifiziert werden, dass Größe regulierenden integrieren Verkappungsmittel wie Citrat bei der Synthese 20.
Biofunktionalisierung der Nanopartikelkerne wird durch elektrostatische Selbstorganisation mit fluoreszierendem Avidin, welche enab erreichtles Fluoreszenz-Imaging. Elektrostatische Selbstorganisation erfordert entgegengesetzten Ladungen auf der Oberfläche der Nanopartikel und dem Beschichtungspolymer (in diesem Artikel, fluoreszierende Avidin). Um die Oberfläche Funktionalität der Nanopartikel zu verändern, kann Avidin durch positiv geladene Polymere (zB Polylysin oder einem Amin-Rest mit Polyethylenglycol) während der Synthese ersetzt. Jedoch sind die relativen Anteile der Nanoteilchen und Beschichtungspolymer müssen optimiert werden, um Nanopartikel-Größe und Stabilität zu erhalten, und, um die Aggregation zu verhindern.
Neben der biotinylierten Antikörpern auf die Avidin beschichtete Nanopartikel verleiht molekulare Targeting-Fähigkeiten auf die PB-basierten Nanopartikeln. Dieser Schritt wird auf dem robusten Wechselwirkung zwischen Avidin und Biotin bezogen (Dissoziationskonstante, Kd ~ 10 -15). Wie bei den vorherigen Schritten, die relativen Anteile der Avidin-beschichteten Nanopartikeln und biotinylierten Liganden müssen op seinmiert, um die biotinylierten Liganden von gleichzeitig zwei bindenden Avidin beschichtete Nanopartikel was Nanopartikelaggregation verhindern. Für molekulare Targeting, können die Antikörper durch andere Targeting-Liganden, wie Antikörperfragmente (Fab) scFv-Fragment (scFv), Peptide, Aptamere oder ersetzt werden.
Die wesentlichen Vorteile dieser Methode zur Synthese biofunktionalisierte Nanopartikel als multimodale, sind molekulare Kontrastmittel die: 1) einfache Eintopf (1-stufig) Synthese der Nanopartikel-Kerne und 2) sequentielle Kontaktierung Schritte (elektrostatische Selbstorganisation und Avidin Biotin-Wechselwirkungen) zur Beschichtung der Nanopartikel-Kern mit einer biofunktionellen Shell. Weitere Vorteile der Nanopartikel unter anderem, dass Berliner Blau (als Radiogardase erhältlich) ist für den menschlichen Gebrauch bereits von der FDA zugelassene und dass die Nanopartikel, die aus der Eintopfsynthese Schema resultiert kann als MRT-Kontrastmittel sowohl in T 1 (verwendet werden positiv) und T 2 </ Sub> (negative) -gewichtete Sequenzen, die mit anderen Kontrastmitteln oder Nanopartikel Plattformen ohne komplizierte Syntheseschemata oder spezielle Synthesechemikalien der Kontrastmittel nicht leicht zu erreichen ist. Eine Einschränkung der Technik ist, dass der Synthese können polydisperse Nanopartikel mit Aggregaten führen, wenn die relativen Anteile der Reaktionspartner sowohl in Nanopartikelkern Synthese und biofunktionelle Schalenbeschichtungsschritte sind nicht streng auf die in den einzelnen Schritten verwendeten Reaktanten optimiert. Zum Beispiel können die relativen Verhältnisse für die Beschichtung der Nanopartikel Kerne mit Avidin keine Beschichtung der Nanopartikel mit Polylysin ohne vorherige Optimierungsstudien verlängert.
Nach Beherrschung der Technik zur Synthese biofunktionalisierten hier beschriebenen Berliner Blau Nanopartikel kann dieses vielseitige Design für die molekulare Bildgebung Studien in vivo verändert werden. Dies wird PEGylierung der Nanopartikel für niedrigere immun erfordernogenicity und längere Zirkulationszeiten in vivo. Ähnlich wie bei der hier beschriebenen Ausgestaltung können die PB-Nanopartikel mit Antikörpern vor der Verabreichung in vivo biofunktionalisiert ist. Andere Studien umfassen die Verwendung der biofunktionalisierten PB-Nanopartikel für theranostischen (gleichzeitige Therapie + Diagnose) Anwendungen in vivo. Studien, die die Verwendung von Berliner Blau Nanopartikel für photothermische Therapie (basierend auf ihren Absorptionseigenschaften im nahen Infrarot-Wellenlängen) werden derzeit 21.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
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