Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, über eine einfache Methode zur Erzeugung von Nanofasergerüsten mit Abstufungen in der Faserorganisation zu berichten und ihre möglichen Anwendungen bei der Kontrolle der Zellmorphologie/-orientierung zu testen. Die Organisation der Nanofasern wird mit einer neuen Fertigungsvorrichtung gesteuert, die eine allmähliche Abnahme der Faserorganisation in einem Gerüst ermöglicht. Die Änderung der Ausrichtung der Fasern wird durch die Verringerung der Abscheidungszeit von zufällig elektrogesponnenen Fasern auf einer einachsig ausgerichteten Fasermatte erreicht. Durch die Abdeckung des Kollektors mit einer beweglichen Barriere/Maske, die sich auf der gleichen Achse wie bei der Faserabscheidung befindet, kann die Organisationsstruktur leicht gesteuert werden. Für die Gewebezüchtung können aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen auf diese Gerüste ausgesät werden. Stammzellen unterliegen aufgrund ihrer Position in der vielfältigen Organisationsstruktur morphologischen Veränderungen und können sich je nach Standort möglicherweise in verschiedene Zelltypen differenzieren. Darüber hinaus verbessert die abgestufte Organisation der Fasern die Biomimikry von Nanofasergerüsten, so dass sie den natürlichen Orientierungen von Kollagen-Nanofasern an der Ansatzstelle von Sehne und Knochen im Vergleich zu herkömmlichen Gerüsten ähnlicher sind. Durch die Nanoverkapselung bieten die gradierten Fasern auch die Möglichkeit, chemische Gradienten in Fasergerüsten zu konstruieren und damit ihre Anwendungsmöglichkeiten beim schnellen Screening der Zell-Material-Interaktion und der Regeneration von Grenzflächengewebe weiter zu stärken. Diese Technik ermöglicht die Herstellung von kontinuierlichen Gradientengerüsten, kann aber auch potenziell Fasern in diskreten Schritten produzieren, indem die Bewegung der beweglichen Barriere/Maske auf diskrete Weise gesteuert wird.

Einleitung

Nanofasern sind eine beliebte Dienstprogramm für das Tissue Engineering die aufgrund ihrer Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix in der Struktur und der relativen Größe ¹ nachahmen. Jedoch können einige native Gewebe Schnittstellen wie die Sehne-Knochen-Insertionsstelle, enthält Kollagenfasern, das eine variable Organisationsstruktur, die in Ausrichtung hin zunimmt Sehne und nimmt an der Knochenstelle ^2-5 aufweisen. Also, für eine effektive Regeneration der Gewebe gibt es eine Notwendigkeit, ein Gerüst, das diesen strukturellen Gradienten effektiv nachahmen herzustellen.

Zuvor hat es Forschung zu langsamen Veränderungen in der Fasermasse durchgeführt, und zwar, Mineralgehalt ^6. Allerdings, wieder die Strukturkomponente des Bindegewebes bleibt weitgehend unerforscht. Eine frühere Studie geprüft morphologischen Gradienten durch die Untersuchung der Wirkung der Oberflächen Siliciumdioxid Teilchendichte auf die Proliferation von Ratten-Schädel Osteoblasten und fanden ein inverse Verhältnis zwischen Kieselsäure Teilchendichte und Zellproliferation ^7. Aber die morphologischen Veränderungen, die in früheren Arbeiten vermittelten Zellproliferation waren meist verwandten Oberflächenrauhigkeit fehlt die Fähigkeit, in Nachahmung Faser organisatorische Veränderungen ^7,8. Eine neuere Studie versucht, ein Gerüst, das die einzigartigen Kollagenfaserorientierungen durch die Verwendung eines neuartigen Kollektor zum Elektro ⁹ nachgeahmt herzustellen. Während dieser Studie gelungen, ein Gerüst mit beiden ausgerichtet und Wirrfasern, versäumt es, die schrittweise Veränderung der nativen Geweben ausgestellt imitieren. Auch bei der Herstellung von Einzelkomponenten, mit einem sofortigen Wechsel von der willkürlichen Orientierung ausgerichtet ist, die biomechanischen Eigenschaften dieses Gerüst deutlich zurückgegangen. Keine frühere Arbeit ist es gelungen, zutreffend Nanofasergerüste mit kontinuierlichen Abstufungen in der Faserorientierungen von fluchtenden und zufälligen erzeugen. Unsere aktuelle Studie hat erfolgreiche Erholung der Nanofasergerüste gezeigtmit Abstufungen in Faser-Organisation, die möglicherweise nachahmen kann das native Kollagen Organisation Sehne-Knochen-Insertion ^10. Diese Arbeit zielt darauf ab, die für die Herstellung von Nanofasergerüste mit einer Struktur, die sehr ähnlich ist, dass der Faser-Organisation in der Landes Sehnen-Knochen-Gewebe-Grenzfläche verwendeten Protokolle zu präsentieren.

Gradient Nanostrukturen möglicherweise weitreichenden Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen. Wir konzentrierten uns auf die Anwendungen auf Tissue Engineering der Sehne-Knochen-Insertionsstelle durch die Kombination unserer Gerüste mit Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die bereits für die Geweberegeneration auf verschiedenen Substraten ^11-14 eingesetzt werden. Darüber hinaus sind ADSCs sehr ähnlich in der Natur, um Stammzellen des Knochenmarks hinsichtlich der Multipotenz und ihre Ressourcen reichlich vorhanden ist, die mit einem einfachen Fettabsaugung ^15,16 geerntet werden können. Seeding diese Zellen auf Nanofasergerüste abgestuft weitere Verbesserung ihrer tisklagen Ingenieuranwendungen, indem es für die gesteuerte Verteilung der Zellen, die potentiell in verschiedenen Geweben differenzieren können. Zusätzlich zum Impfen Stammzellen können Nanofasern mit Signalmolekülen zur Regulierung der zellulären Antwort eingekapselt werden. Koppeln Nanoverkapselung mit der organisatorischen Gradienten dieser Gerüste ermöglicht die Untersuchung von Zellverhalten oder mögliche Implantatdesigns und Beschichtungen. Verkapselung von funktionellen Molekülen, wie morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2), von dem gezeigt wurde, um die Osteoblasten-Differenzierung ^15,16 induzieren könnten weitere Verbesserung der Gewebezüchtung dieser Gerüste ^10.

Protokoll

1. Herstellung der Lösung

1. Es wird eine Lösung von Poly (ε-caprolacton) (PCL) (M _w = 80.000 g / mol) bei einer ungefähren Konzentration von 100 mg / ml. Löse PCL in einem Gemisch von Dichlormethan (DCM) und N, N-dimethlyformamide (DMF) in einem Verhältnis von 4: 1 (v / v) mit einer Konzentration von 10% (w / v).
2. Legen Sie die Lösung in einem 20 ml Glasröhrchen zum Mischen. Platzieren Glasrohr in Ultraschallreiniger für 30 Minuten oder bis die Lösung durchlässig ist.

2. Geräte Vorbereitung

1. Fügen Sie den PCL-Lösung vorbereitet in eine 5-ml-Spritze mit einer 21-Gauge-stumpfe Nadel.
2. Platzieren Spritzenpumpe in vertikaler Elektrospinnposition gemäß Figur 1.
3. Verwenden Sie ein Stahl-Lücke Sammler Edelstahl mit einem offenen Raum von 2 cm x 5 cm für die ausgerichtete Fasersubstrat. Platzieren Sie den Sammler 12 cm von der Nadelspitze.
4. Verbinden Sie den Gleichstrom (DC) Hochspannungsnetzteil an dieNadel und erden Sie die Sammler. Stellen Sie sicher, dass der Kollektor ist einzeln ohne Kontakt zur anderen Laborgeräten geerdet.

3. Das Elektro

1. Set Spritzenpumpe auf 1,50 ml / h, bis die Tröpfchen bilden an der Nadelspitze sofort ersetzt werden, wenn entfernt. Dann stellen Sie die Durchflussrate auf 0,50 ml / h.
2. Schalten Sie die Spannung Betreiber bis 12 kV.
3. Elektrospinnen, bis die uniaxial ausgerichteten Fasern vollständig zu bedecken die Lücke auf dem Sammler.
4. Leim auf die Kanten einer Glasplatte und Übertragung der Fasern von dem Spalt Kollektor mit der Glasplatte. Legen der Glasplatte auf der Oberseite von einem Stück Aluminiumfolie, die die gleiche Größe wie die Glasplatte und ist geerdet.
5. Positionieren Sie die zweite Spritze Kollektor nach 3.
6. Bringen Sie die Kunststoffmaske zum zweiten Spritzenpumpe und positionieren 2 mm oberhalb des Kollektors.
7. Hinzufügen Coumarin 6 bei 1% (w / w) in der PCL-Lösung, wenn nanoencapsulation ist desired- und mische bis die Lösung durchlässig ist.
8. Laden Sie den PCL oder PCL / Cumarin 6 Lösung in eine 5 ml Nadel mit einem stumpfen 21-Gauge-Nadel. Stellen vertikale Pumpen bis 0,50 ml / h und horizontal auf 9 ml / h oder bei einer ungefähren Geschwindigkeit von 1 mm / min zu ziehen.
9. Elektrospinnen, bis die Maske fast vollständig aus dem Kollektor mit dem Randbereich nach wie vor unter der Maske bewegt, aber.

4. Fasercharakterisierung

1. Prüfmuster mit doppelseitige leitende Band an der metallischen Bolzen und Mantel mit Platin für 40 sec mit einem Sputter-Coater bei 40 mA.
   1. Untersuchen Fasern durch Rasterelektronenmikroskop (SEM) nach unseren früheren Studien ^17,18.
   2. Sammeln Bilder bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV.
2. Durchführen von schnellen Fourier-Transformation (FFT) auf einem getrennten Faserprobe die Faserausrichtung zu messen. Die detaillierten Angaben zum Messfaserausrichtung durch FFT kann beziehen to früheren Studien ^19,20.

5. Seeding Stammzellen.

1. Sterilisation der Faserproben durch Eintauchen in eine 70% Ethanollösung für 2 Std. Dann waschen die Fasern mit destilliertem Wasser, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen.
2. Erhalten menschlichen ADSCs und Kulturzellen in einem 25 cm ^{2 -Kolben} bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 95% Luft / 5% CO _2. Ändern Sie jeden zweiten Tag ¹⁰ das Zellkulturmedium.
3. Trypsinieren die Zellen und die Anzahl der Zellen. Genauer gesagt, nehmen Sie das Kulturmedium aus der Zellkulturflasche und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zweimal. Dann fügen Sie 1 m ^l einer 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung (pre-warm im Wasserbad auf 37 ° C), um die Zellschicht zu bedecken und die Flasche in der Zellkulturbrutschrank inkubieren für 2-3 Minuten. 4 ml Kulturmedium und waschen Sie alle Zellen von der Oberfläche durch Pipettieren des Mediums über die gesamte Oberfläche. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und redispergieren the Zellpellet in Kulturmedium. Count-Zellen über Hämazytometer. Seed etwa 1 × 10 ⁴ Zellen zur Nanofasergerüst in einem 35 mm -Kultur Schale gelegt und Inkubation für 3 und 7 Tagen.
4. Stain-Zellen unter Verwendung von Fluoresceindiacetat (5 mg / ml in Aceton) (FDA) dann bild die Proben unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops. Genauer gesagt, werden 100 ul des FDA-Lösung in die Kulturschale pipettieren und 30 min. Dreimal vor Fluoreszenzabbildung waschen Zellen mit PBS. Analysieren Zellorientierung durch eine kundenspezifische Matte-lab-Programm auf der Grundlage unserer bisherigen Studien ^10.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde eine Fasermatte mit einer organisatorischen Gradienten gebildet. 3 zeigt die REM-Bilder an verschiedenen Stellen auf der Nanofaser-Gerüst entnommen. Qualitativ kann bestimmt werden, dass es einen Übergang von der uniaxial ausgerichteter Fasern mit einem 0 mm (3A) zu einer zufälligen Fasersortiment auf 6 mm (Figur 3D). Die FFT liefert einen quantitativen Wert auf die Faserausrichtung, Einzelheiten über die quantitativen Prozesse s...

Diskussion

Der kritischste Teil des Protokolls ist die Generierung des Gradientengerüsts. Es ist zwingend erforderlich, dass sich die Maske, die den Kollektor abdeckt, mit einer konstanten Geschwindigkeit bewegt, damit sich das Fasergerüst allmählich verändert. Die richtige Zubereitung der PCL-Lösung ist ebenfalls wichtig, um den Erfolg des Elektrospinnens zu gewährleisten. Es ist empfehlenswert, die Fasermorphologie vor dem Elektrospinnen zu überprüfen, insbesondere nach der Verkapselung von Cumarin-6, die möglicherweise eine höhe...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polycaprolacton	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamid	Fisher Chemical	D-119-1
Dichlormethan	Fisher Chemical	AC61093-1000
Cumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Fett gewonnene Stammzellen	Zelltechnik Technologien	HMSC. AD-100
Fötales Rinderserum	Life Technologies	26140-111
Fluoresceindiacetat	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modifiziertes Eagle's Medium	Invitrogen	A10490-01
Aceton	Fisher Scientific	s25120a
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Invitrogen	10010023
Glasobjektträger	VWR International, LLC	101412-842
Spritzenpumpe	Fisher Scientific	14-831-200	Einzelspritze
Ultraschallreiniger	Branson	1510
Hochspannungs-Gleichstromnetzteil	Gamma-Hochspannungsforschung	ES30
Rasterelektronenmikroskop	FEI	Nova 2300
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	Axio Imager 2

aus