Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.
Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.
Typ 2-Diabetes ist eine chronische Krankheit, die 382 Millionen Menschen im Jahr 2013 und wird voraussichtlich bis zu 592 Mio. im Jahr 2035 1 steigen. In den letzten 2 Jahrzehnten die Rolle der Beta-Zell-Dysfunktion bei Typ 2 Diabetes wurde klar festgelegt 2. Forschung Fortschritte Methoden zur Isolierung von Langerhans-Inseln erforderlich. Das Protokoll der Inselisolierung hier präsentierten viele gemeinsame Schritte mit Protokollen von anderen Gruppen, mit einigen Änderungen, um die Ausbeute und Qualität der isolierten Inseln sowohl aus dem Wildtyp und diabetischen Lepr db (db / db) Mäusen zu verbessern. Ein Live-Zelle der 2-Photonen-Abbildungsverfahren wird dann präsentiert, die verwendet werden können, um die Kontrolle der Insulinsekretion in Inseln zu untersuchen.
Die Rolle der Betazelldysfunktion bei Krankheiten ist allgemein anerkannt, 3,4. Zelllinien, wie der MIN6 und INS-1 sind nützliche Werkzeuge, um die Biologie von Beta-Zell-Verhalten zu verstehen. Allerdings ist die physiologische Kontrolle der Insulinsekretion findet innerhalb der Langerhans-Inseln. Diese Inseln enthalten Tausenden eng gepackten Beta-Zellen, sowie Blutgefäße und anderen endokrinen Zelltypen. Diese Umgebung innerhalb des Insel beeinflusst Insulinsekretion und dürfte bei Diabetes wichtig. Um daher die physiologischen Kontrolle der Insulinsekretion und die Pathophysiologie der Erkrankung zu verstehen, ist es wichtig, intakte Inseln studieren. ....
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HINWEIS: Alle vorliegenden Experimenten wurden nach den örtlichen Tierethik Verfahren der University of Queensland (von der University of Queensland, Anatomisches Biosciences Ethikkommission genehmigt) durchgeführt.
1. Islet Isolation
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Islet Ausbeute und Reinigung
Für eine normale Wildtyp-Maus, werden etwa 200 kleine Inseln erwartet. Gesunde Inseln aussehen hell, rund geformt und haben einen glatten Rand. Eine Über verdaut Isolierung Charge hat in der Regel klein und Fuzzy-Inseln, während ein Unter verdaut Charge hat weniger kleine Inseln und Inselchen Azinuszelltumoren angebracht (Abbildung 3). Für diabetischen db / db-Mäuse, die kleine Insel Ausbeute und Aussehen abhängig von der Krankheitsprogression mi.......
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Der wichtigste Faktor für die Inselisolierung ist die anfängliche Durchblutung des Pankreas; ein unter perfundierten Pankreas führt zu einem erheblich niedrigeren Inselausbeute. Andere Faktoren, die auch Auswirkungen auf die Isolierung Qualität wie die Aufschlusszeit und der Höhe der Erschütterung, die teilweise für die Höhe der Durchblutung zu kompensieren könnte. Zum Beispiel wird ein voll durchströmten Bauchspeicheldrüse müssen bei 37 ° C für ~ 18 min 30 sec inkubiert werden unter leichtem Schütteln im Gegensatz eine.......
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Australian Research Council Grant DP110100642 (an PT) und National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 und APP1059426 (an PT und HYG).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Liberase TL 5 mg | Roche-5401020001 | ||
| Kollagenase Typ IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | zur Herstellung von Isolationsmedien |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | zur Herstellung von kultivierten Medien |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | zur Herstellung von kultivierten Medien |
| Fötales Rinderserum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | zur Herstellung von kultivierten Medien |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | zur Verdünnung der Liberase |
| Metamorph Programm | Molecular Devices, USA | zur Analyse der 2-Photonen-Bilder |
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