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Methodenartikel

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3'LIFE Assay

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⸱

DOI:

10.3791/52647

⸱

25. Mai 2015

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Institute, Arizona State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Lumineszierende Identifizierung von funktionellen Elementen in 3' untranslatierten Regionen (3'UTRs) (3'LIFE) ist eine Technik zur Identifizierung der funktionellen Regulation in 3'UTRs durch miRNAs oder andere regulatorische Faktoren. Dieses Protokoll verwendet Hochdurchsatzmethoden wie 96-Well-Transfektion und Luciferase-Assays, um Hunderte von mutmaßlichen Wechselwirkungen auf funktionelle Repression zu untersuchen.

Zusammenfassung

Lumineszierende Bezeichnung von Funktionselementen in 3'UTRs (3'LIFE) erlaubt die schnelle Identifizierung von Zielen bestimmte miRNAs innerhalb einer Anordnung von hunderten abgefragt 3'UTRs. Zielidentifizierung basiert auf dem Dual-Luciferase-Assay, das die Bindung erkennt auf mRNA-Ebene durch Messung translationale Ausgang, so dass ein funktions Auslesen von miRNA gezielt beruht. 3'LIFE nutzt nicht-proprietäre Puffer und Reagenzien, und öffentlich zugängliche Bibliotheken Reporter, dass genomweite Screens durchführbar und kostengünstig. 3'LIFE kann in einem Standard-Testumgebung durchgeführt werden, entweder mit oder up Liquid-Handling-Roboter und andere Hochdurchsatz-Instrumentierung skaliert. Wir veranschaulichen die Vorgehensweise unter Verwendung eines Datensatzes der menschlichen 3'UTRs in 96-Well-Platten kloniert und zwei Test miRNAs, let-7c und miR-10b. Wir zeigen, wie man DNA-Präparation, Transfektion, Zellkultur und Luciferaseassays in 96-Well-Format durchführen, und bieten Werkzeuge zur DatenAnalyse. Abschließend 3'LIFE ist sehr gut reproduzierbar, schnell, systematisch und identifiziert hohes Vertrauen Ziele.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, zu erkennen und zu microRNA (miRNA) Ziele präzise Karte im Hochdurchsatz. MiRNAs endogenen nicht-kodierenden RNAs ~ 22 Nukleotide lang. Nach der Transkription und Verarbeitung, sind reife miRNAs in einem Proteinkomplex eingebaut namens RNA induced silencing complex (RISC). Jedes miRNA führt die RISC auf Zielelemente vor allem in den 3'-untranslatierte Regionen (3'UTRs) von Boten-RNAs (mRNAs) gelegen, was entweder Übersetzung Repression oder mRNA-Spaltung 1. MiRNA erkennen, Zielorte basierend auf Standard-Watson-Crick und G: U Wobble-Basenpaarung und entartet in der Natur, mit mehreren fehlgepaarten Basenpaaren und ausgebeult Regionen. Viele miRNAs sind im Großen und Ganzen aus Pflanzen auf den Menschen 2,3, wo sie eine breite Palette von biologischen Rollen spielen konserviert. In Metazoen können miRNAs mehrere biologischen Prozessen einschließlich Zellschicksal Entscheidungen 4, Entwicklungszeit 5 beeinflussen , Und weisen häufig gewebespezifische Expressionsmuster 6,7. MiRNA misexpression kann auch aberrante Genregulation, die wesentlichen Einfluss auf das Zellverhalten ausschließlich auf die Funktion der Zielgene Portals resultieren. Als solche sind miRNAs zu einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Neurodegeneration 8,9, Diabetes und Krebs 10 11. Bioinformatic und Nassbank Ansätze vorschlagen, dass jeder miRNA kann in der Lage gezielt Hunderte bis Tausende von verschiedenen mRNAs 12-14 sein, die anzeigt, dass Hochdurchsatz oder genomweite Ansätze sind erforderlich, um diese großen Pool von potentiellen Wechselwirkungen zu untersuchen.

Identifizierung von Zielgenen ist eine kritische Komponente des mechanistisch definieren miRNA-Funktion, und dazu müssen die Forscher in der Lage, Ziele in großem Maßstab zu offenbaren. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um miRNA Ziele, einschließlich bioinformatische Vorhersage-Algorithmen zu identifizieren, Hochdurchsatz-Sequenzierunggezielte mRNAs und Reporter basierte Assays. Jeder dieser Ansätze hat inhärente Stärken und Schwächen. Da miRNA Targeting durch Sequenzspezifität geführt, insbesondere von Nucleotiden 2-6 der miRNA (der so genannten Seed-Region), mehrere Algorithmen entwickelt, um miRNA gesamten Genom vieler Organismen vorherzusagen. Diese Algorithmen werden mit den beobachteten Basenpaarung Motive validierter miRNA Targets ausgebildet und häufig nutzen, Parameter wie stringent seed Paarung Website Erhaltung und / oder thermodynamische Stabilität 15. Obwohl diese Filter zu verfeinern, die große Anzahl von mutmaßlichen Ziele mit ausreichender Komplementarität zu nur hohen Vertrauens Ziele können sie artspezifisch nichtkanonische miRNA Zielstellen, die den letzten Beweis schlägt sind weit verbreitet 16-24 ausschließen. Darüber hinaus sind diese Prognosen nicht berücksichtigt Mechanismen der mRNA-Prozessierung, die miRNA-Zielstellen, wie zum Beispiel alternative Polyadenylierung ausschließen nehmen25, 26 RNA-Editing, RNA-Methylierung 27 und kooperative Bindung. Als solche haben hohen falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse für viele Algorithmen 22,24,28 gemeldet. Während diese Algorithmen sind nützlich, um Kandidaten miRNA Ziele für nachfolgende experimentelle Validierung zu identifizieren, diese hohen Fehlerquoten begrenzen die Wirksamkeit von Bioinformatik-Ansätze für die systematische miRNA Zielerfassung.

Systematisch nach Wechselwirkungen zwischen einem bestimmten miRNA und möglicherweise gezielt 3'UTRs Sonde haben wir ein Hochdurchsatz-Assay genannt Leucht Identifizierung von Funktionselementen in 3'UTRs (3'LIFE) 24 entwickelt. Dieser Assay misst direkte Interaktionen und translationale Repression des Test 3'UTR von einer Abfrage miRNA mit einem Dual-Luciferase-Reportersystems. In diesem System wird die 3'UTR eines Gens von Interesse stromab des Leuchtkäfer-Luciferase (fluc) Reporter-Leserahmen kloniert. Die Reporter construct ist mit einer Abfrage miRNA in HEK293T-Zellen cotransfiziert. MiRNA-Targeting wird durch Messung der relativen Änderung zwischen dem Test Fluc :: 3'UTR-Reporter und eine zweite nicht-spezifische Renilla Luciferase-Reporter bestimmt. Wichtig ist, dass die Luciferaseassays detektieren miRNA / mRNA-Wechselwirkungen, die die Translations Ausgang des Reporter beeinflussen. Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden, um miRNA Regulation, wie RT-qPCR und Western-Blots zu erkennen, daß diese umgeht Unterschiede in mRNA-Abbau und translationale Repression, sowie Änderungen in Proteinmenge unabhängig von 3'UTR basierte Regulierung.

Luciferase-Assays werden häufig genutzt, um direkten miRNA Ziele wegen ihrer relativen Einfachheit und Sensibilität, aber ihre Verwendung in Hochdurchsatz-Screens zu validieren ist von hohen Kosten, die mit verbrauchende Reagenzien Dritter, das Fehlen von 3'UTR Bibliotheken aus öffentlichen Quellen, und das Fehlen standardisierter Luciferase protocols, zu Schwierigkeiten führen beim Vergleich funktionelle Unterdrückung in mehreren Datensätzen. Um die Verwendung des 3'LIFE Assay zu erleichtern, haben wir Wert auf eine Vereinfachung der Versuchsplanung, Nutzung von nicht-kommerziellen Transfektion 24 und Luciferase Reagenzien 29 gestellt haben, die Schaffung einer 3'UTR-Bibliothek, die regelmäßig aktualisiert und erweitert wird, und ist durch die verfügbaren eine öffentliche Plasmid-Repository 30.

Die Skalierbarkeit der 3'LIFE Assay ermöglicht Screening einer großen 3'UTR Bibliothek für die Ausrichtung von einem bestimmten miRNA ohne Vorspannen des Bildschirms in Richtung bioinformatisch identifizierten Gene. Neben der Prüfung kanonischen und vorhergesagten Wechselwirkungen ermöglicht diese systematischen Ansatz die Identifizierung von neuen Targets über nicht-kanonischen und / oder Spezies-spezifische Wechselwirkungen angetrieben. Wichtig ist, dass die Wirkung von miRNA gezielt auf die Proteinproduktion versteht man im allgemeinen in bescheidenen translationale Repression 15,31 / Sup>, was darauf hindeutet, dass eine primäre Rolle der miRNA Regulation ist die Feinabstimmung Protein-Ausgang, Schutz vor abweichenden Genexpressionsniveaus und bieten Robustheit auf bestimmte Programme 32,33 Zelle. Die Empfindlichkeit des Luciferase-Assay in Kombination mit der Natur Vielzahl negativer miRNA / mRNA-Wechselwirkungen im 3'LIFE Bildschirm erlaubt den Nachweis von subtile Effekte der miRNA-Targeting auf einer großen Anzahl von Genen und die Identifizierung von mehreren Komponenten der Gen Netzwerken, werden durch eine miRNA 24 geregelt.

Hier beschreiben wir die 3'LIFE Protokoll, und zeigen es Machbarkeit durch Screening von zwei gut charakterisierten miRNAs, miR-10b und lassen-7c gegen eine Auswahl von 275 menschlichen 3'UTRs (Abbildung 1).

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Protokoll

1. Zellkultur (24-48 h vor der Transfektion)

  1. 24-48 h vor der Transfektion Samen eine ausreichende Menge HEK293T-Zellen basierend auf der Anzahl von Platten mit 96 Vertiefungen transfiziert.
    HINWEIS: Für die konsequente Transfektionen Platte Zellen mit einer ausreichenden Dichte schnelle Teilung zu begünstigen, noch nicht mehr als 70-90% Konfluenz werden zum Zeitpunkt der Transfektion.
  2. Jede Platte mit 96 Vertiefungen erfordert 9 x 10 6 Zellen (75.000 Zellen pro Vertiefung, und 120 Vertiefungen pro Platte für die Verwendung von Vorratsbehälter und Mehrkanalpipette Konto). Berechnung der Verdopplungszeit von HEK293-Zellen (~ typischerweise 20 h), und Samen die geeignete Anzahl von Zellen, um mindestens 9 x 10 6 Zellen zur Zeit der Transfektion erhalten. A 145 mm Kreiskulturplatte ist in der Regel ausreichend für 3 96-Loch-Transfektionen, wenn sich zu ~ 90% Konfluenz, mit ~ 10% der Zellen verbleibende, um eine neue Platte reseed.

2. Vorbereitung vor der Transfektion

_content "> HINWEIS: Die Herstellung der Puffer und die Plasmid-DNA in Schritt 2,0-2,2 sollte in den Tagen vor der Transfektion durchgeführt, da die Herstellung dieser Reagenzien können zeitaufwendig sein kann.

  1. Menschen 3'UTR Klone, die mit dem Assay 3'LIFE kompatibel sind, über ein öffentliches Plasmid-Repository 30 zur Verfügung. Reinigen DNA-Plasmid von Hand oder mit Liquid-Handling-Roboter. Verwenden Sie eine Transfektion Grade alkalische Lyse Mini-Prep 96-Loch-Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Resuspendieren der gereinigten Vektoren auf ~ 100 ng / ul pro Vertiefung.
    HINWEIS: Zu wenig Luciferase-Signal wird, wenn die Plasmid-Konzentration unter 40 ng / & mgr; l.
  2. Erhalten die pLIFE-miRNA-Vektoren 30 oder Klon mit der Rohrleitung in 1B 24. Resuspendieren der Vektoren in einer Konzentration von 500 ng / ul für jede miRNA und Blank Steuer Plasmide.
  3. Aufgrund der Empfindlichkeit der Nukleofektion Pufferbedingungen, sicherzustellen, dassdas Gesamtvolumen der transfizierten Materialien (einschließlich Zellen und Plasmide), 10% der gesamten Flüssigkeit in jede Vertiefung der 96-Loch-Transfektion Platte nicht überschreiten. Um dies zu erreichen, konzentrieren die pLIFE-miRNA Plasmid-Lager in einer Konzentration von mindestens 500 ng / ul.
  4. Vorbereitung 10x Glühwürmchenluciferase Pufferreagentien (Tabelle 1), und das 1X Renilla Luciferase Pufferreagentien (Tabelle 2), die für bis zu 6 Monate gelagert werden können.
    HINWEIS: Der DVB-T in der Glühwürmchen-Luciferase-Puffer muss in Lösung bei -20 ° C in den einmaligen Gebrauch Aliquots gelagert werden.

3. Bereiten Nach Artikel Unmittelbar vor der Transfektion

  1. Vorbereitung Transfektionspuffer enthaltenden PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Bereiten Sie diese frischen, auch wenn es für bis zu 1 Monat bei 4 ° C ohne merkliche Abnahme der Transfektionseffizienz gespeichert werden. Bei der Formulierung Puffer und Plasmid-DNA Bände, davon ausgehen, 120 Reaktionen für jede Platte mit 96 Vertiefungen zu sufficiently machen Fehler beim Pipettieren und Lautstärke mit Flüssigkeitsreservoirs und Mehrkanalpipetten verloren. Aliquot 18 ul pro Vertiefung Transfektionspuffer (120 Wells / 96-Well-Platte = 2,16 ml pro Platte), und beiseite stellen.
    HINWEIS: Die zell Elektroporationsvorrichtung ist extrem empfindlich auf die Pufferbedingungen verwendet, um Zellen zu transfizieren. Genauigkeit bei der Herstellung von Puffern wird eine konstante Leistung des Gerätes zu gewährleisten. Zusätzliche Vorsicht ist bei der Durchführung des Assays, um Verdunstung von Puffern zu verhindern, und zwar durch Minimieren der Zeit, daß der Puffer gelassen wird in Mikrozentrifugenröhrchen, Platten mit 96 Vertiefungen, Reservoirs und Elektrodenplatten aufgedeckt genommen werden.
  2. Reserve vier Brunnen für die folgenden Kontrollen, keine pLIFE-3'-UTR (zum Hintergrund der Luciferase-Assay zu messen), pLIFE-SV40 3'UTR (negative Zielkontrolle), Positivkontrolle für die miRNA # 1, positive Kontrolle für die miRNA # 2.
    HINWEIS: Diese Vektoren sind öffentlich zugänglich 30. Alternativ kann jede zuvor validierten Zielkann als eine Positivkontrolle verwendet werden.
  3. Warmen Medien, Trypsin (0,25%) auf 37 ° C.
  4. In jede Vertiefung der 96-Loch-Zellkulturplatte, 200 & mgr; l DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 1% Pen / Strep und in einem 37 ° C Inkubator für die Verwendung nach der Transfektion platziert.
  5. Schalten Sie alle Geräte Zelle Elektroporation, gefolgt von der unterstützenden Software. Verwenden Pulse Code FF120 für HEK293T-Zellen und PBS / HEPES-Puffer.

4. Herstellung von Plasmid-DNA und Zellgemisch

HINWEIS: Die folgende Protokoll geht davon Transfektion drei Platten mit 96 Vertiefungen in einem Experiment für einen Bildschirm mit zwei miRNAs (miRNA # 1 und # 2 miRNA). Jede Platte wird auf die gleiche Platte mit 96 Vertiefungen von pLIFE-3'UTR Plasmide entsprechen, und dreimal mit pLIFE-miRNA-blank, pLIFE-miRNA # 1, oder pLIFE-miRNA # 2 behandelt werden.

  1. Bereiten Sie 3 Bestände pLIFE-miRNA + Transfektionspuffer für jedes miRNA. Dieser Bestand sollte für 50% (10 ul) des Gesamtvolumens der jedes Kontogut, um 120 Brunnen multipliziert. Daher sollte jede Aktien 1,08 ml Puffer + 120 ul Plasmid-DNA (pLIFE-miRNA) enthalten.
  2. Zellen aus 145 mm-Kulturplatte zu entfernen durch Eluieren Medien, wäscht vorsichtig mit PBS, und Behandeln mit ~ 5 ml 0,25% Trypsin für 5 min bei 37 ° C. Trypsin zu neutralisieren mit einem gleichen Volumen an Medium und Pellet-Zellen bei 300 g für 5 min.
  3. Entfernen Trypsin / Medien und Pellet in ~ 5-10 ml Medium (je nach Zelldichte und genaue Bereich von Zellzähler).
  4. Zählen von Zellen mit einem Zellzähler. Stellen Sie sicher, dass Zellen> 95% lebensfähig und in exakte Reihe von Maschine.
    HINWEIS: Eine falsche Zellenzahl kann von extrem hohen Zellkonzentrationen (> 6.0x 10 6 / ml) zur Folge haben. Transfektion zu viele Zellen drastisch zu reduzieren Effizienz der miRNA-Targeting durch Reduzierung Plasmid: Zellverhältnis und / oder abnehm Transfektionseffizienz.
  5. Aliquot drei Röhren mit jeweils 9 x 10 6 Zellen, die den Zellen entsprechen rzur Transfektion von einer Platte mit 96 Vertiefungen equired. Spin-Zellen bei 300 × g für 3 min.
  6. Medien zu entfernen. Achten Sie darauf, so viel wie möglich zu Medien mit minimaler Störung des Pellets zu entfernen, da überschüssige Medien Transfektionseffizienz beeinflussen.
  7. Die Zellen in 1,2 ml Transfektionspuffer / miRNA Plasmid-Gemisch, und beiseite stellen.
  8. Die folgenden Schritte detailliert Resuspension pLIFE-3'UTR Plasmid in Transfektionspuffer. Da dies in 96-Well-Platten auf, achten Sie darauf, Verdampfung von Puffer durch Abdeckplatten zu allen Zeiten zu vermeiden.
    1. Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, bewegen 32,4 ul Transfektionspuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte (9 ul [pro Transfektion] * 3 [Platten] * 1.2 [für Pipettenfehler Konto]).
    2. In 3,6 & mgr; l (~ 100 ng / ul) von Mini-prepped pLIFE-3'UTR Plasmid in jede Vertiefung geben und gut mischen.
    3. Je 10 & mgr; l dieser Mischung in jede Vertiefung der 96-Loch-Transfektion Platte und Abdeckung.

5. Transfektion

  1. Bewegen 1.2 ml der ersten Zelle / Puffer / pLIFE-miRNA Plasmid-Gemisch in das Reservoir. Gut mischen.
  2. Zugabe von 10 ul dieser Mischung in der ersten 96-Well-Transfektion Platte 10 ul Transfektionspuffer / pLIFE-3'UTR bereits enthält. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren mehrmals.
    HINWEIS: Equal Suspension von Zellen in dem Puffer wird auch sichergestellt und gründliche Durchgang des elektrischen Stroms durch die Küvette und maximieren Transfektionseffizienz.
  3. Platzieren Sie 96-Loch-Transfektion Platte auf der Zell Elektroporationsvorrichtung und initiieren Transfektion.
  4. Nach Transfektion abgeschlossen ist, fügen Sie 100 ul der vorgewärmten Medien von 96-Well-Kulturplatte in jedes Well der 96-Well-Platte Transfektion und gut mischen. Bewegen Sie 100 ul von jeder Vertiefung in die 96-Loch-Kulturplatte.
  5. Mischen Zellen in Kulturplatten mit Pipette vertikal in der Mitte der Vertiefung angeordnet ist, die als Zellen dazu neigen, an den Seiten des w aggregierenell, wenn richtig gemischt.
  6. Wiederholen 5,1-5,5 für die verbleibenden zwei Platten.
  7. Reinigung 96-Well-Platte Transfektion
    1. Die 96-Well Platten Transfektion kann durch Waschen mit 70% EtOH geführt werden, um keinen Übertrag von Nukleinsäuren zwischen den Experimenten zu gewährleisten. Führen Sie zwei 70% EtOH wäscht mit einer Sprühflasche, um vollständig zu füllen jedes Loch, gefolgt von Abwischen überschüssigen EtOH auf den Elektrodenstreifen (Unterseite) und ermöglicht die Transfektion Platten vollständig trocknen in der Kultur Kapuze.
      Anmerkung: Wir haben für Carry-over DNA-Kontamination durch Transfizieren 12 Vertiefungen mit 2 & mgr; pmaxGFP jeweils in HEK293T-Zellen Plasmid getestet, gefolgt von einem einzelnen Waschschritt mit 70% EtOH und eine zweite Transfektion ohne Plasmid-DNA. Mit diesem extrem hohen Plasmidkonzentration, extrem helle Reporter und einem einzigen Wasch, gab es keine beobachtbaren Fluoreszenz in einem der 12 Transfektionen replizieren.
  8. Kulturzellen für 48-72 h bei 37 ° C, gefolgt von der doppelten luciflöschen Assay.

6. Zelllysat Vorbereitung für Luciferase Assay

  1. Verdünnen Sie Lysepuffer mit 4 Teilen Wasser, 1 Teil 5x passive Lysepuffer in einem Reservoir. Berechnen Sie 26 ul / Vertiefung, Hinzufügen ~ 20 zusätzliche Mengen, um den Verlust in dem Behälter zu berücksichtigen.
    HINWEIS: Der Puffer wird bei -20 ° C gelagert und können äußerst dickflüssig und damit vor so dass der 5-fach-Puffer auf Raumtemperatur zu nähern wird Pipettiergenauigkeit verbessern.
  2. Analysieren Sie jede Vertiefung für Transfektionseffizienz mittels Fluoreszenzmikroskopie. Beachten Sie, etwaige Unstimmigkeiten in Brunnen, die nicht effizient transfizieren haben (> 90% Transfektionseffizienz) oder äußern niedrigen RFP Hinweis auf Überfüllung oder Medien Erschöpfung. Entfernen Sie diese Brunnen aus der Analyse.
  3. Vollständig zu entfernen Sie das Medium aus den Zellen, man aufpassen, nicht zu schnell zu eluieren, welche dazu führen, Zellen zu lösen wird.
    HINWEIS: Verbleibende Medien werden das Lysat und verursachen Schwankungen der Werte über Experime verdünnennts.
  4. In 26 & mgr; l Lysepuffer in jede Vertiefung, und auf einem Plattenschüttler / Wippe bei niedriger / mittlerer Geschwindigkeit für ca. 20-30 min. Nutzen Sie diese Zeit, um die Luciferase-Puffer vorzubereiten, waschen und prime das Luminometer (n), und übertragen Lysat bis opak Messplatten.

7. Doppel Luciferase Assay

Hinweis: Wenn mehrere Platten werden der Reihe nach auf einem Luminometer gemessen, erstellen Puffermastermixen mit alles außer ATP und Substrate, das Hinzufügen dieser Reagenzien, gefolgt von pH-Einstellung unmittelbar vor der Anwendung mit jeder Platte. ATP und Substrate können im Laufe der Zeit verschlechtern; Kohärenz der Zeit sind diese Reagenzien im Puffer Konsistenz über mehrere Platten zu verbessern.

  1. Bereiten 1x Luciferase-Puffer (Tabelle 1):
    1. Wickeln Sie zwei Rohre (in der Regel 15/50 ml Zentrifugenröhrchen) mit der Firefly und Renilla-Puffer mit einer Aluminiumfolie, die als Substrate können lichtempfindlich sein.
    2. Bereiten 1x Firefly Luziferase-Puffer. 1 ml von jeder der fünf 10x Glühwürmchenluciferase Reagenzien Zugabe EGTA letzten, auf 5 ml H 2 0 zu einer endgültigen Konzentration 1x.
      1. Hinzuzufügen 0,025 g ATP auf 10 ml 1x firefly Puffer. Mischen Sie durch mehrmaliges Wenden. Halten ATP auf Eis zu allen Zeiten. ATP wird abgebaut, so dass, wenn mehr als eine Platte nacheinander messen, müssen Puffer neuen Anfang gemacht werden in diesem Schritt für jede weitere Platte.
      2. 100 l 100 Käfer-Luciferin (Substrat) (Tabelle 1) Buffer sollte gelbliche Farbe auf Basis von pH ändern.
    3. 1x Renilla-Luciferase-Puffer Rekonstitution: Per 96-Well-Platte, aliquote 10 ml 1 "Renilla Puffer".
      1. 100 l BSA (44 mg / ml Stamm).
      2. Wenn Screening mehr als eine Platte, separate Master-Mix in 10 ml-Teilmengen.
      3. Fügen Sie 100 ul Coelenterazin zu Puffer (bisher aufgeteilt und bei 100x konz gespeichert.)
    4. Einstellen des pH auf 8,0 firefly 1x Puffer, gefolgt von dem 1x Renilla-Puffer auf 5,0 unter Verwendung von NaOH und HCl.
      HINWEIS: Die Aktivität von jedem Puffer und die Fähigkeit des Renilla Puffer, um die Firefly-Luciferase-Aktivität zu quenchen ist stark abhängig vom pH-Wert. Für gleichbleibende Ergebnisse als äußerst präzise in diesem Schritt.
    5. Bringen Volumen jedes Puffers (entsprechend 1 96-well-Platte) auf 10,5 ml für Luminometer Priming unterzubringen.
  2. Übertragen Lysat bis opak weißen Platten: An dieser Stelle sollten die Zellen in Lysepuffer für ~ 20 min. 25 & mgr; l aus jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, lesen Sie auf- und abpipettieren gründlich zum Aufbrechen der Zellklumpen und homogenisieren Sie das Lysat.
  3. Bereiten Sie das Luminometer. Schalten Sie das Luminometer und wählen Sie das Protokoll in der DLR-Ordner namens "DLR mit zwei Injektionen". Andere Formate sind nicht mit der Datenanalyse-Pipeline (unten) kompatibel.
    1. Wählen Sie die Brunnen zu sein tinteressiert (alle Vertiefungen ist die Standardeinstellung).
    2. Verlängern Sie die 'Verzögerung vor der Messung "Einstellung auf 5 Sekunden, mit einer 10 sec Messzeit (siehe 29 für nähere Information).
    3. Kapillar-Waschschritte: 3x Wasser, EtOH 3x, Wasser 3x, trocken 3x. Prime Puffer einmal in den Abfall, und dann ein zweites Mal prime zurück in den Adern, um sicherzustellen, Mischen. Spritzen Sie die Glühwürmchen Puffer ersten und prime es in der linken Kapillare, gefolgt von Renilla in der rechten Kapillare.
  4. Initiieren Sie die Luciferase-Assay. Jede Platte sollte 48 min nehmen ~ zu lesen. Nach Beendigung speichern Sie die Datei zuerst, und dann wiederholen Sie die Waschschritte und schaltete den Luminometer.
    HINWEIS: Mehrere Platten können gelesen werden und Daten auf dem gleichen Excel-Datei gespeichert, aber Probleme können mit mehreren Platte auftreten, wo das Luminometer liest Programm abstürzen. Achten Sie darauf, alle Daten zwischen den Messungen speichern und Screenshots, wenn Programm stürzt vor Speichern möglich ist.
    1. Ersetzen Sie alte Puffermit neuen, wobei Sie auf prime mindestens zweimal mit neuen Puffer vor dem Start der neuen Platte.

8. Datenanalyse

  1. Nutzen Sie Excel-Tabellen "3'LIFE - Einzelplattenanalyse" und "3'LIFE - Mehr Analyse", erhältlich von www.mangonelab.com . Kopieren Sie Rohdaten für Firefly und Renilla-Luciferase-Messungen von Luminometer Ausgabedatei in die entsprechenden Stellen an den negativen Zustand, miRNA # 1, # 2 und miRNA in das "3'LIFE - Einzelplattenanalyse" Tabellenkalkulation.
  2. Das Spreadsheet berechnet automatisch Firefly / Renilla-Verhältnis und normalisieren jede miRNA auf die entsprechende negative Kontrolle und Repression zu normalisieren Werte in jeder Platte.
    HINWEIS: Diese Tabelle wird automatisch Brunnen mit geringer Luciferase-Signal zu identifizieren, markieren Sie deutlich unterdrückte Vertiefungen und bieten Maßnahmen repressiauf über die gesamte Platte. Siehe 24 für eine detaillierte Erläuterung der statistischen Analyse.
    1. Kopieren Sie die Werte aus der "Normalized RI Index" Box, in die entsprechenden Zellen in der "3'LIFE - Mehr Analyse" Tabellenkalkulation an der Position, die für jedes miRNA getestet replizieren # 1. Wiederholen Sie dies für alle biologischen Replikaten an verschiedenen Tagen durchgeführt.
  3. Falls gewünscht, legen Sie die Gennamen und Zielvorhersagestatus in Spalten B und D auf.
    1. Lassen Sie die Tabelle, um den Durchschnitt aller Platte automatisch zu berechnen. Beachten Sie die Daten in 96-Well-Format als Wärme Karte (Abbildung 2). Die Datei organisiert auch die Daten in Listenform (Abbildung 2).
      HINWEIS: Die Repression Index ist die verwendet werden, um mutmaßlichen miRNA Targets zu identifizieren Maßnahme. Verschiedenen Stringenzbedingungen Parameter verwendet werden, basierend auf individuellen Vorlieben. Im Durchschnitt sehen wir wahrscheinlich Treffern unter Repression Index 0.8 und durch t-Test (p -Wert <0,05) statistisch signifikant. Wie in Abbildung 3 potentielle Ziele auf der Grundlage dieser Kriterien wird in rot hervorgehoben.

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Ergebnisse

Das Luminometer Ausgabedatei enthält Rohmessungen für beide Firefly und Renilla-Luciferase-Proteine. Das RAW-Format ist mit dem "3'LIFE - Einzelplattenanalyse" kompatibel "3'LIFE - Mehr Analyse" Arbeitsblätter zur Verfügung von der Mangone lab Website ( www.mangonelab.com ). Die einzelne Platte Analyse Tabellenkalkulation berechnet automatisch Firefly / Renilla-Verhältnis, normalisiert jeweils miRNA an die entsprechende Negativkontroll...

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Diskussion

Die 3'LIFE Assay identifiziert Funktions miRNA Ziele in 3'UTRs in Hochdurchsatz. Dieser Assay ist nützlich für Forscher, die experimentell Identifizierung einer großen Anzahl von mutmaßlichen Ziele für deren miRNA interessiere möchten. Die 3'LIFE Assay ein leistungsfähiger Ansatz zur 3'UTR angetrieben Regulierung abzufragen, indem der Assay stellt ein funktionelles Maß miRNA Targeting und die binäre Testen eines einzelnen Reporter :: 3'UTR gegen eine einzelne miRNA vertrauens adressieren das Targetin...

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Offenlegungen

Diese Arbeit wird durch Mittel des College of Liberal Arts and Science und des Biodesign Institute an der Arizona State University sowie durch den NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1 unterstützt.

Danksagungen

Wir danken Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer für Ratschläge und Diskussionen. Karen Anderson, John Chaput und Josh LaBaer für die gemeinsame Nutzung von Reagenzien und Instrumenten, Michael Gaskin und Andrea Throop für technische Beratung und Protokolle. Justin Wolter ist Maher-Stipendiat und dankt der Familie Maher für ihre großzügige Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
GlycylglycinSigmaG1127-25G
Kx PO4SigmaP2222
EGTASigmaE3889
ATPSigmaFLAAS
DTTSigmaD0632
MgSO4SigmaM7506
CoASigmaC4282
LuciferinSigmaL9504
NaClSigmaS7653
Na2EDTASigmaE0399
K H2 P O4Sigma1551139
BSASigmaA2153
NaN3SigmaS2002
CoelenterazinSigmaC3230
PBS/HEPESCorning21-040-CV
DMEMSigmaD5546
FBSSigmaF2442
Pennicilin/StreptomicinSigmaP4333
TrypsinT2600000
Verbrauchsmaterialien
MaxiPrep KitPromegaA2392
96-Well-Miniprep-PlattePall8032
96-Well-Shuttle-PlattenLonzaV4SP-2096
5x Lysis BufferPromegaE1941 
Instrumente
96-well GloMax Plate ReaderPromegaE9032
Biomech FX Liquid Handler RoboterBeckmannA31842
4D-Nukleofector Core UnitLonzaAAF-1001
96-Well-Shuttle-SystemLonzaAAM-1001
Zellzähler CountessInvitrogenNr. C10227

Referenzen

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  2. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
  3. Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
  4. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
  5. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  6. Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
  7. Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
  8. Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
  9. Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
  10. Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
  11. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
  12. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  13. Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
  14. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  16. Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
  17. Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
  18. Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
  19. Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
  20. Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838(2011).
  21. Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
  22. Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
  23. Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068(2012).
  24. Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
  25. Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3'UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
  26. Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
  27. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
  28. Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204(2013).
  29. Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
  30. Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
  31. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
  32. Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
  33. Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).

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