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HINWEIS: Männliche C57BL / 6-Mäuse (5-7 Wochen alt) werden von Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Kanada.) Und nach Protokollen von der CHU Sainte-Justine Animal Care Committee genehmigt manipuliert. Maus Bronchialgewebe Explantate eine gute Quelle von Primär bronchialen Epithelzellen zur Untersuchung der proapoptotischen Wirkung von LMPs auf Epithelzellen. Dieses Protokoll beschreibt die synthetische Entwicklung LMPs sowie ein Verfahren zum Nachweis apoptotischer Epithelzellen auf LMPs behandelten bronchiale Gewebeexplantaten. Dieses Protokoll besteht aus drei Abschnitten.
1. LMPs Herstellung und Charakterisierung
HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass alle in diesem Experiment verwendeten Materialien sind steril und autoklaviert. Alle Schritte bei Raumtemperatur in einem biologischen Sicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen, sofern nicht anders angegeben.
1.1) Stimulation und Sammlung von Abgeordneten9
- Auftauen ein Aliquot von 10 Millionen CEM-T-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Verdünne in 10 ml vorgewärmten serumfreien hämatopoetischen Medium wie X-VIVO, in einem 15 ml sterilen Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g × 5 min. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 5 ml vorgewärmten Medium.
- Übertragungszellen in einen T75-Gewebekulturkolben (für Suspensionskulturen) mit 15 ml vorgewärmten hämatopoetischen Medium wie X-VIVO und Inkubation für 4 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO 2.
- Nach 4 Tagen übertragen alle Kulturmedium und Zellen in einen T175 Gewebekulturflasche mit 100 ml frischem Medium. Weiter Inkubieren der Zellen für ungefähr 72 Stunden unter den gleichen Bedingungen, bis sie zu einer Dichte von 2 Mio Zellen / ml gezüchtet.
- Gleichmäßig auf vier T175-Flaschen, die jeweils 150 ml frischem Medium und weiterhin Zellkultur, bis Zellen (etwa 48 h Inkubation) zu einer Dichte von 2 Millionen / ml gezüchtet Teilen von Zellen.
- 6 Zellen in ein neues T175-Kolben, der 150 ml frisches Medium, um den 2 Millionen / ml Zelldichte aufrechtzuerhalten.
- Hinzufügen Actinomycin D (gelöst in DMSO bei 2 mg / ml) zu dem Medium in einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml und Inkubation für 24 Std.
- Lassen Sie das gesamte Kulturmedium in 50 ml konischen Röhrchen und Spin-down werden die Zellen bei 750 g für 5 min. Den Überstand in 50 ml konische Röhrchen und zentrifugieren bei 1.500 g für 15 Minuten, um große Zellbruchstücke zu entfernen.
- Den Überstand in einen 250 ml-Flasche und Ultrazentrifuge bei 12.000 × g für 50 min. Überstand verwerfen und sammeln Pellets.
- Wasch LMPs angereicherten Pellets mit 40 ml sterilem PBS in ein 50 ml Röhrchen durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 50 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Sammeln Sie die letzten Waschüberstand; wird sie als Fahrzeugsteuerung verwendet werden. Suspend die LMPs Pellets in 1ml PBS und Übertragung in einem 1,5 ml sterilen Mikroröhrchen. Aliquotieren und Speicher isoliert LMPs bei -80 ° C (um mehrere freie und Auftauen zu vermeiden).
1.2) Charakterisierung der Abgeordneten über FACS-Analyse 4
- Planen 2 Proben von Annexin Puffer, 1 mit und andere ohne CaCl 2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus oder minus 5 mM CaCl 2.
- Filtern Annexin Puffer und FACS Strömungs Hüllfluid mit einem 0,22 um Filter, um Partikel zu entfernen.
- Verdünnen Sie 1 ul LMPs in 44 ul von Annexin-Puffer mit 5 mM CaCl 2 in einer FACS-Röhrchen. Bereiten anderes Rohr mit 1 ul LMPs in 44 ul Annexin Puffer ohne CaCl 2 (Negativkontrolle).
- In 5 ul der Annexin-Cy5 in jeder Röhre und gut mischen. Inkubieren für 15 min bei RT im Dunkeln. Die Reaktion durch Verdünnen der Mischung mit 400 ul FACS Fluss Mantelfluid in jedem Röhrchen.
- In 10 ul (200.000 Kügelchen) von 7 um das Zählen beads Suspension als interner Standard in jedem Röhrchen, um eine absolute Anzahl ermitteln.
- Stellen Toren der relativen Größe (FSC-H, PMT E00, logarithmischer Maßstab) und die relative Granularität (SSC-H, PMT 325, logarithmischer Maßstab) Dot-Plot auf dem Durchflusszytometer mit Größe kalibriert fluoreszierende Kügelchen von 1 um (Tor 1) und Zählen Perlen Tor bei 7 um (Tor 2).
- Analysieren Sie den LMPs Probe auf FSC-H / SSC-H Grundstück mit den etablierten Toren und FL-4-Kanal für Annexin (PMT 765, logarithmischer Maßstab) Dot-Plot, durch Erfassen eines Signals, bis 20.000 Zählen Perlen sind in Tor 2 erreicht.
- Ermitteln Sie die positive Annexin Ereignisse LMPs in Annexin-Puffer, der CaCl 2, und dann die Ereignisse des LMPs in Annexin Puffer subtrahieren ohne CaCl 2 (Negativkontrolle).
- Berechnung der absoluten Anzahl der MPs basierend auf der folgenden Gleichung:
1.3) Bestimmung des MP Protein Konzentration (Bradford-Assay)
- Bereiten 5 Reihenverdünnungen eines Proteinstandard 1,25-20 ug / ml. Pipette 800 ul jeder Standard- und Probenlösung in ein sauberes Reagenzglas in zweifacher Ausfertigung. Gib 200 ul Brad Farbstoffreagens zu jedem Röhrchen. Gut mischen, dann bei Raumtemperatur für 5 min.
- Messung der Extinktion bei 595 nm. Bestimmung der Proteinkonzentration von LMPs der linearen Regression der Standardkurve.
2. Bronchial Gewebeexplantaten und LMPs Behandlung
HINWEIS: Achten Sie besonders auf die sterile Arbeitsumgebung, und aseptisch bereiten die Lösungen und mittel folgenden Experimenten verwendet. Um die vollständige Heilung Medium vorbereiten, 1 ml der Gewebeheilung Mittelergänzung mit Serum (auf Eis aufgetaut) auf 100 ml Gewebeheilung Medium und gut mischen.
2.1) Herstellung von Bronchialgewebe Explantate
- Vor dem Kultivieren zerkratzen 6 Bereiche von 1 cm 2jeweils an der Kante der Fläche von je 100 mm Gewebekulturschale mit einem Skalpell. Coat jeweils zerkratzt 100 mm Gewebekulturschale mit 2 ml der Kulturschale Beschichtungslösung und Inkubation wird die Schale in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator O / N bei 37 ° C. Vakuum saugen Sie den Überschusslösung und füllen Sie die Schale mit 15 ml Gewebewaschmedium.
- Euthanize C57BL / 6-Mäuse (5-7 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation nach Protokollen, die von der Tierpflege Ethik-Kommission genehmigt.
- Aseptisch sezieren Lungengewebe mit Skalpell, Dumont superfeinen Pinzette und chirurgische Schere. Parenchym und Blutgefäße vorsichtig entfernen. Zeigen Lungengewebe in eiskaltes Gewebewasch Medium für den Transport ins Labor, falls zutreffend.
- Ferner sezieren Bronchus im Tissue Waschmedium getaucht und trenne die Bronchien mit einem Durchmesser von 1 bis 2,5 mm vom peripheren Lungengeweben. Scheibe Bronchialgewebe in ca. 5 mm dick Bronchien Ringe mit einem Skalpell.
Verwenden Sie einen Schöpfbewegung mit den sterilen gebogenen microdissecting Pinzette zu holen die bronchiale Fragmente und legen Sie sie auf die verkratzten Stellen der Gerichte. - Entfernen Sie die Gewebewaschmedium und bebrüten die Fragmente bei RT ~ 5 Minuten, damit sie an die Gerichte zu halten.
- 10 ml komplette Heilung Medium zu jeder Schale und legen Sie sie in einer kontrollierten Atmosphäre modulare Inkubatorkammer. Spülen Sie die Kammer mit hoher O 2 Gasgemisch (70% O 2, 25% N 2 und 5% CO 2). Legen Sie die Kammer in einem Benchtop Orbital-Inkubator und schütteln Sie sie bei 37 ° C. Schüttle die Kammer für 24 h bei 10 Zyklen pro Minute, bis das Medium, um intermittierend über die Fragmente fließen.
- Nach 24 Stunden Inkubation, beachten Sie Gewebeexplantaten unter einem Phasenkontrast-invertierten Lichtmikroskop. Wählen bronchiale Explantate mit kompletter, feines Haar Bewegung und lebendige Bronchialepithel für nachfolgende LMPs Behandlung.
2.2) LMPs Behandlung
- Bereiten komplette Wachstumsmedium wie folgt: Tau-Wachstumsmedium ergänzt mit Serum und Fibroblasten-Inhibitor auf Eis. 1 ml des Wachstumsmediums ergänzt mit Serum und 200 ul Fibroblasteninhibitor zu 100 ml des Wachstumsmediums; gründlich mischen. Erwärmen die vollständige Wachstumsmedium bei 37 ° C für 10 min vor der Verwendung.
- Verdünne isoliert LMPs in ein neues steriles Eppendorf-Röhrchen mit PBS auf eine LMPs Lager in einer Konzentration von 800 ug / ml herzustellen.
- Mit 0,5 ml vollständigem Wachstumsmedium in jede Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte.
- Übertragung der gewählten bronchiale Explantate mit den gekrümmten microdissecting Pinzette aus dem vorherigen Protokoll (Abschnitt 2.1) in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte.
- Beschriften Sie die Kulturplatte angemessen auf LMPs Behandlung Brunnen und Kontrollvertiefungen zu identifizieren. In 25 ul LMPs Lager ineinander LMPs Behandlung gut (für eine Endkonzentration von 40 ug / ml) und 25 ul Kontrollfahrzeug (siehe LMP s-Produktion) zu den Kontrollvertiefungen.
- Fortsetzung der Inkubation in einer kontrollierten Atmosphäre modularen Inkubatorkammer bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
- Nach 24 Stunden, waschen Explantate 3-mal mit PBS und fahren Sie mit dem nächsten Schritt (4% Paraformaldehyd [PFA] Fixierung).
3. Histopathologische Untersuchung
3.1) die folgenden Lösungen an, bevor Sie den nächsten Schritte
- Bereiten 1x PBS-Puffer hergestellt, indem 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2 PO 4, pH 7,4.
- Die Herstellung von 4% PFA, aufzulösen 20 g PFA in 400 ml Wasser, bei 60 ° C unter Rühren erhitzt; ein paar Tropfen von 10 M NaOH, um die Lösung zu löschen. Next hinzufügen 1x PBS-Puffer und die Lautstärke auf 500 ml und pH-Wert auf 7,4. Filter und aliquoten; bei -20 ° C.
- Bereiten Sie die folgenden Austrocknung oder Rehydrierung Reagenzien; 100%, 90%, 70%, 50% Ethanol und Xylol.
e_step "> 3.2) Explantation Fixierung und Gewebeschnitten Entparaffinierung
- Legen Sie jedes Explantat in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,5 ml 4% PFA und Inkubation O / N bei 4 ° C. Zweimal Spülen Sie die Explantate mit 1x PBS.
- Entwässern Explantate durch eine Alkoholreihe (70% Ethanol: jeder 3-mal 30 Minuten, 90% Ethanol: je 2 mal 30 min; 100% Ethanol: 3 mal 30 Minuten jeweils, dann Xylol: 3 mal 20 Minuten jede). Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur in einem Abzug.
- Imbed Gewebeexplantate in Paraffin bei 58 ° C in einem Ofen. Bereiten Sie 5 um dicken Gewebeschnitten unter Verwendung eines Rotationsmikrotoms.
- Schweben Sie die Abschnitte in einem 56 ° C Wasserbad, und montieren Sie die Schnitte auf beschriftet histologischen Präparaten. Objektträger in manuelle Färbung Racks und trocken bei 65 ° C für 1 Stunde. Die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Tauchen Sie die Racks in 4 aufeinander folgenden Fleckenschalen mit Xylol 10 min je nach Paraffin zu entfernen. Tauchen die Racks mit einer Ethanolserie Entfernung von Xylol: 100%, dann 95%, then 80%, dann 70%, dann 50% Ethanol (5 Minuten für jeden Schritt). Spülen Sie die Ständer mit Leitungswasser für 5 Minuten, um Ethanol zu entfernen.
3.3) Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung
- Weiterhin mit den Gewebeschnitten; legen die Zahnstange in einen Färbetrog mit Mayers Hämatoxylin gefüllt für 15 min. Spülen Sie das Rack mit Leitungswasser auf Hämatoxylin für 20 Minuten zu entfernen.
- Platzieren in destilliertem Wasser für 30 sec.Place in 95% Ethanol für 30 sec. Platzieren Sie in Eosin G Färbelösung Gericht für 1 min. Dehydratisieren durch 2 Änderungen von 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol, jeweils 2 min.
- Führen Sie eine schnelle Überprüfung unter dem Mikroskop, damit überschüssiges Eosin wird entfernt. Zeigen 2-3 Tropfen Eindeckmedium (Fisher SP15-100) auf jeder Folie, dann decken mit einem Deckglas.
3.4) In-situ-Cell Death Detection: TUNEL Assay
- Bevor Sie beginnen, bereiten Proteinase K Arbeitslösung: 20 ug / ml in10 mM Tris / HCl, pH 7,4.
- Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 5 von Ziffer 3.2 (Explantation Fixierung und Gewebeschnitt Entparaffinierung). Spülen Sie die Folien mit deionisiertem H 2 O
- Tauchen Sie die Objektträger mit 1x PBS für 10 min. Lassen Sie das überschüssige PBS. Inkubieren Gewebeschnitten 30 min bei RT mit Proteinase K-Arbeitslösung. Rinse gleitet zweimal mit 1 × PBS.
- Führen Sie die TUNEL-Assay, wie in der Bedienungsanleitung der Zelltod-Nachweis-Kit beschrieben. Montieren Sie mit Eindeckmedium und Deckglas von Hand mit Deckgläsern.
- Analysieren Sie die Proben unter einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie Image Pro 4.5, um die apoptotischen Zellen in der braunen Farbe analysieren.