Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Zusammenfassung

Die Analyse der physiologischen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen stößt immer noch an technische Grenzen. Hier erfassen wir sie durch perforierte Patch-Clamp in einer intakten Präparation des olfaktorischen Epithels bei gengesteuerten Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung von Membraneigenschaften und Reaktionen auf spezifische Liganden von Neuronen, die definierte Geruchsrezeptoren exprimieren.

Zusammenfassung

Analysieren der physiologischen Reaktionen von Riechzellen (OSN), wenn sie mit spezifischen Liganden stimuliert ist kritisch, um die Basis der olfaktorischen getriebenen Verhaltensweisen und deren Modulation zu verstehen. Diese Codierungseigenschaften hängen stark von der anfänglichen Interaktion zwischen Geruchsmolekülen und der Geruchsrezeptor (OR), ausgedrückt in der OSN. Die Identität, Spezifität und Ligandenspektrum der ausdrücklich oder kritisch sind. Die Wahrscheinlichkeit, den Liganden des OR finden Ausdruck in einer nach dem Zufallsprinzip im Epithel gewählt OSN ist sehr gering. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird in diesem Protokoll genetisch tagged Mäusen das fluoreszierende Protein GFP unter der Kontrolle des Promotors des definierten Randlage zum Ausdruck. OSNs sind in einer engen und organisierte Epithel der Nasenhöhle gelegen, mit Nachbarzellen zu beeinflussen ihre Reifung und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um eine intakte Riechepithel zu isolieren und durch Patch-Clamp-Aufnahmen erfassen die Eigenschaften OSNs expressing definierten Geruchsrezeptoren. Das Protokoll kann eine OSN Membraneigenschaften zu charakterisieren, während der Einfluss der benachbarten Gewebe. Analyse der Patch-Clamp-Ergebnisse ergibt eine präzise Quantifizierung der Ligand / oder Wechselwirkungen, Übertragungswege und Pharmakologie, OSNs "Kodierungseigenschaften und deren Modulation an der Membranebene.

Einleitung

Riechzellen (OSN) stellen den ersten Schritt der Geruchswahrnehmung. Das Hotel liegt im Riechepithel Auskleidung der Nasenhöhle in Nagetieren, verwandeln sie die chemische Informationen von Geruchsstoffen in Aktionspotentiale durch ihre Axon an das Gehirn gesendet. Die Duftverarbeitung Mechanismen besser zu verstehen, ist es notwendig, die Transduktion und Membraneigenschaften OSNs charakterisieren. Bis vor kurzem waren die meisten Techniken verwendet werden, um die Eigenschaften von Säugetier OSNs charakterisieren wurden an dissoziierten OSNs ^1-4 durchgeführt. Die Dissoziation Verfahren verwendet verschiedene mechanische und chemische (dh Enzyme) Prozesse, die OSNs aus ihrer Umgebung zu befreien. Diese Prozesse führen zu einer geringen Anzahl von verfügbaren Zellen für Aufzeichnungen. Diese geringe Zahl kann im Fall von GFP markierten Zellen noch kritisch. Dissoziation entfernt auch die lokale Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen OSNs und anderen Zellen des olfaktorischen Epithels surviv erhöhen kannal und Modulation OSNs 'Eigenschaften. Um die Dissoziation Verfahren umgehen, wurde ein intaktes Präparat ⁵ entwickelt.

Jedes OSN drückt eine Geruchsrezeptor (OR), die aus einer großen Multigenfamilie ^6. Es gibt ~ 1.000 OPs im Haupt Riechepithel in der Maus zum Ausdruck gebracht. Aufgrund der großen Anzahl von OR in Wildtyp-Tiere, die Chancen zu OSNs exprimieren denselben Datensatz oder sehr gering sind. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Gen gerichtet Mäusen vorhanden, in der alle OSNs exprimieren eine bestimmte oder mit einem fluoreszierenden Protein, ^7-9 bezeichnet. Diese markierten OSNs wurden verwendet, um Funktionsanalyse in dissoziierten Vorbereitungen ^7,10,11 mit den bereits erwähnten Nachteilen zu tun. Ein intaktes Epithel Vorbereitung ⁵ aus genetisch markierten Mäusen umgeht daher diese Fragen. Es erlaubt die Überwachung der Aktivität des OSNs exprimieren genau definierten ORs in einer Umgebung so dicht in vivo wie möglich. Außerdem Patch-Clamp-Aufnahmen von OSNs erlauben auch genaue Analyse der Membraneigenschaften, Übertragungsweg Pharmakologie, Ligand / oder Wechselwirkungen. Alle diese Themen kaum mit extrazellulären Aufnahmen analysiert werden. Wir nutzten diese Technik, um die Reaktionen der OSNs Expression der Geruchsrezeptoren SR1 und MOR23 ^12,13 überwachen. Die Machbarkeit der Technik wurde von anderen Gruppen auf MOR23 ausdrücken OSNs ¹⁴ sowie auf andere Regionen in äußerster Rand exprimierenden Neuronen ^15,16 bestätigt. Die Überwachung eines definierten Population von OSNs können zur Analyse ihrer Eigenschaften in vielen verschiedenen Zusammenhängen wie Entwicklung ¹⁴ führen, Alterung ^17, Geruchsstoff induzierter Plastizität ^18, und die Rolle der Veränderungen in Folge der Geruchsrezeptor in Duftkodierung ^15. Dieses Protokoll stellt somit ein leistungsfähiges Werkzeug, um die funktionellen Eigenschaften definiert OSNs an der Membranebene zu überwachen.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Tierpflege Richtlinien der Université de Bourgogne und wurde von der Université de Bourgogne Ethikkommission genehmigt.

1. Tiere

1. Verwenden gentechnisch OR-IRES-tauGFP Mäuse verfügbar am Jackson Laboratory. Diese Mäuse wurden in Dr. Peter Mombaerts 'Labor, um Axon-Targeting und Entwicklung des olfaktorischen Systems ¹⁹ Analyse entwickelt. ZB die MOR23-IRES-tauGFP Linie, Fahrzeugnummer 006643, trägt den offiziellen Namen Stamm B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; Auch die SR1-IRES-tauGFP Linie, Fahrzeugnummer 6717 trägt den offiziellen Namen B6; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. In Bezug auf das Alter der Tiere: für ein besseres Ergebnis der Protokoll verwenden Tieren zwischen 2 und 4 Wochen alt sind. In dieser Altersgruppe ist die Präparation leichter (weicher Knochen, festere Riechepithel) und die dendritischen Knöpfe sind bigger Vergleich zu älteren Tieren.

2. Herstellung von Elektroden und Lösungen

1. Für die anregende Pipetten: Kauf prepulled anregende Pipetten. Andernfalls manuell vorzubereiten.
   1. Unter Verwendung einer Flamme, biegen sechs 1 mm Glaspipetten bei etwa 1 cm von der Spitze. Legen Sie diese sechs Pipetten sowie eine gerade ^7. in 1,5 cm Schrumpfschlauch zu stärken durch eine Öse.
   2. Schrumpf den Schlauch, um die Fässer miteinander verbunden zu halten. Bringen Sie eine zusätzliche Schrumpfschlauch, um das andere Ende der Fässer. Ziehen Sie diese anregende Pipette mit einem Multi-Barrel Magnet.
   3. Fügen Sie etwas weiß Flüssigkleber rund um die Öse, um die gebogenen Spitzen zu stärken. Trocknen lassen O / N.
2. Vorbereitung 1 oder 2 L normaler Ringer- extrazelluläre Lösung (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO ₄ 1.3, CaCl _{2 2,} NaHCO ₃ 26, NaH ₂ PO ₄ 1,25, Glucose 15, pH 7,6 und 305 mOsm). Halten bei 4 ° Cbis zur Verwendung.
3. Vorbereitung intrazellulärem Stammlösung (in mM): KCl 70, KOH 53, Methansulfonsäure 30, EGTA 5, HEPES 10, Saccharose 70; pH 7,2 (KOH) und 310 mOsm. Halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Gut für mehrere Wochen.
4. Bereiten intrazellulären Recording-Lösung mit Nystatin aus dem Stegreif (in letzter Minute), bevor Experiment.
   1. Wiegen 3 mg Nystatin, fügen Sie 50 ul DMSO; Wirbel 20 sec beschallen dann 2-3 Minuten, bis vollständig verdünnt.
   2. Mit 20 & mgr; l DMSO-Nystatin-Lösung in 5 ml Stammlösung intrazellulär. Vortex 20 sec, dann 3 min beschallen. Diese Lösung wird bei 4 ° C und vor direktem Licht schützen, ist Nystatin lichtempfindlich. Diese Lösung kann für einige Stunden verwendet werden. Jeden Tag zu ersetzen.
   3. Sobald das Riechepithel Präparat unter dem Mikroskop, nehmen Sie etwas von dieser Lösung in einer 1-ml-Spritze mit einer Flamme und gedehnten gelber Spitze, um die Elektroden zu füllen; vor direktem Licht schützen. Sobald bei RT, der Nystatin-Lösungnicht stabil ist; ersetzen Sie die Lösung in der 1 ml Spritze jede Stunde oder halten Sie es in Eis.
5. Ziehen Aufzeichnungselektroden mit einer Abziehvorrichtung langen Hals und kleine Spitze (~ 2 & mgr; m) mit einem Widerstand von 15-20 MOhm mit dem internen Nystatin-Lösung zu erhalten.
6. Bereiten Geruchsstoff-Lösung mit 0,5 M in DMSO unter Abzug; aliquoten bringen und -20 ° C bis zur Verwendung. Verdünnte Riechstoff in Ringer-Lösung, bis die gewünschte Konzentration. Füllen Sie den stimulierenden Pipette.

3. Herstellung von Riechepithel

Hinweis: oder-IRES-tauGFP Mäuse exprimieren das tauGFP unter der Steuerung der ODER-Promotor. Bei diesen Mäusen werden alle Neuronen, die oder von Interesse mit GFP markiert. Dieses Protokoll wird für die Regionen in äußerster Rand in allen Zonen ausgedrückt angepasst. Allerdings sind Dissektionen und Aufnahmen einfacher für OPs im Rückenbereich ausgedrückt.

1. Betäuben das Tier durch Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (150 mg / kg und 10 mg / kg BODy Gewicht, respectively). Enthauptung kann mit einer scharfen Schere für junge Mäuse oder mit einem ordnungsgemäß gewartet Nagetier Guillotine für ältere Mäuse durchgeführt werden.
   1. Verwendung Ring Präparierscheren einen mittleren Längsschnitt durch die Rückenhaut. Entfernen Sie die Haut, indem Sie sie auseinander. Mit der Schere, schneiden Sie die Unterkiefer im Kiefergelenk. Entfernen Sie die oberen Frontzähne durch einen koronalen Schnitt parallel zu den Zähnen.
   2. Machen Sie einen koronalen Schnitt des Kopfes hinter den Augen, und nur den vorderen Teil des Kopfes zu halten. Tauchen sie in eiskaltes Ringer-Lösung für die Präparation in den Geltungsbereich.
2. Sezieren in den Anwendungsbereich: in der Bauchseite, stellen einen Längsschnitt entlang der Oberkiefer / Zähne. Schneiden Sie die dorsalen Knochen in Längsrichtung nach der dorsolateralen Seite der Nasenhöhle. Entfernen Sie die meisten Knochen und Gaumen; übertragen die Scheidewand und das Epithel mit ihm verbunden in Sauerstoff angereichert Ringer bei RT.
3. Für die endgültige Präparation: Kurz vor Beginn der AufzeichnungSitzung, abziehen der Epithel von der zugrunde liegenden Septum mit einer Pinzette. Nehmen Sie das Epithel mit einer Pinzette und mit zwei 4-5 mm Scherenschnitte (Verwendung microvannas Schere) auf den vorderen Teil der Nasenscheidewand, wo die Haftung ist stärker.
   1. Entfernen Sie vorsichtig die Vomeronasalorgans durch Ausschneiden entlang der dorsalen Verbindung zum Septum-Epithel. Übertragen Sie das Epithel zu einer Aufzeichnungskammer, die mit der Schleimschicht nach oben; halten Sie es flach in der Kammer mit einer Harfe.
4. Installieren Kammer unter einem aufrechten Mikroskop mit Fluoreszenzoptik und einer empfindlichen Kamera ausgestattet. Visualisieren Sie die Vorbereitung auf dem Computerbildschirm bei hoher Vergrößerung durch ein 40-fach Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur 0,8) und ein extra 2X oder 4X Vergrößerung durch eine Vergrößerungslinse erreicht. Perfundieren kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert Ringer bei RT (1-2 ml / min).

4. Recording Session

1. Suchen Sie für fluoreszierende Zelle: regen die Herstellung bei 480nm für EGFP, die Licht im Bereich 530-550 nm emittiert; Ziel einer dendritischen Knopf, der in der Fluoreszenz und unter Hellfeld zuverlässig sichtbar ist.
2. Füllen Elektrode mit intrazellulären Lösung mit Nystatin; entfernen Luftblasen durch leichtes Antippen auf der Elektrode.
3. Einfügen Elektrode auf Elektrodenhalter, gelten positive Druck in der Pipette; Widerstand sollte 15-20 MOhm sein.
4. Bringen Elektrode in der Nähe der Zelle; einmal Widerstand erreicht ~ 40 MOhm, lassen Druck und mit leichtem Unterdruck wird eine undurchlässige erreichen.
5. Sobald Dichtung erreicht ist, setzen Sie das Membranpotential von etwa -75 mV;
6. Sobald die Zelle geöffnet wird, fahren Sie mit Stimulationsprotokolle, pharmakologische Behandlungen. Um die Antwort auf eine einzelne Riechstoff Stimulation Rekord 200-500 ms von spontaner Aktivität zu messen, zu stimulieren für 500 ms und messen die Antwort der Zelle bis zu 10 sec ^13. Für pharmakologische Behandlungen, durchströmen die pharmakologischen Mitteln andie gewünschte Konzentration ^20.

5. Datenanalyse

1. Analysieren von Geruchsstoffströme Stimulation ausgelöst wie folgt: die maximale Amplitude, die Anstiegszeit (Zeit notwendig, 90% der Maximalamplitude erreichen, in msec), dem Gesamtstrom (Fläche unter der Kurve in PAS), die Zeit, zu 50% (Zeit zwischen dem Beginn und dem Versatz der Reaktion bei 50% der maximalen Amplitude in ms).
   1. Mit den Spitzenübertragungsströme (maximale Amplitude erreicht) in unterschiedlichen Konzentrationen, ziehen und passen eine Dosis-Wirkungs-Kurve mit der Hill-Gleichung: I = Imax / (1 ​​+ (K _1/2 / C) ^n), wobei I den Spitzenstrom Imax die maximale Antwort bei sättigenden Konzentrationen, K1 / 2 die Konzentration, bei der die Hälfte der maximalen Reaktion erreicht war, C die Konzentration des Geruchsstoffs und n der Hill-Koeffizient.
2. Analysieren Sie Aufnahmen von Membranpotential in Stromzange für die maximale Depolarisation, die total Potential ausgelöst (Fläche unter der Kurve in mVsec); Rekord spontane spiking Aktivität über 30 sec bis 1 min-Aufnahmen; Rekord Erregbarkeit durch Spikes durch Injektion von Strömen (5-10 pA) ausgelöst.

Ergebnisse

Das Ergebnis dieses Protokolls ist abhängig von der Qualität der Präparation. Diese Dissektion Schritte müssen kurz (weniger als 10 bis 15 min) und präzise (dh auf Schäden des Epithels zu vermeiden) sein. Die 1 veranschaulicht, wie eine ideale Vorbereitung sieht aus wie bei verschiedenen Vergrößerungsstufen. Bei einer niedrigen Vergrößerung unter Hellfeld die verschiedenen Zelltypen (wie Knöpfe OSNs, Stützzellen) sind zu unterscheiden (Abbildung 1A). Bei der höchsten Vergrößeru...

Diskussion

Die Fähigkeit dieses Protokoll, um die Eigenschaften der gesunden OSNs korrekt überwachen hängt stark von der Qualität der Vorbereitung. Daher sind die Dissektion Schritte kritisch. Zunächst ist es wichtig, auf die Qualität (pH, Osmolarität), Sauerstoffzufuhr und Temperatur (eiskalten, aber nicht gefroren) der Dissektion Medium zu zahlen. Zweitens müssen die Manipulation der Epithel mit Präparierbesteck so begrenzt wie möglich ist, Schäden zu vermeiden. Schließlich ist es wichtig, eine Zubereitung so flach wie möglich, ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vibrationstisch mit Faradayscher Käfig	TMC	63-500 SERIE	erforderlich: isoliert das Aufzeichnungssystem von Vibrationen, die durch die Umgebung hervorgerufen werden (Bewegungen des Experimentators, Vibrationen von Geräten wie Lüftern zur Kühlung von Computern usw.); kann auch mit einem Faradayschen Käfig gekauft oder mit einem speziell angefertigten Faradayschen Käfig ausgestattet werden; dieser Käfig wird empfohlen, um elektrisches Rauschen durch die
Umgebungsoptik
zu vermeidenMikroskop	Olympus	BX51WI	aufrechtes Mikroskop mit Epifluoreszenz; fester oder beweglicher Tisch, je nach Vorliebe des Benutzers Objektive
	Olympus	LUMPLFL40XW	mindestens 2 Objektive erforderlich: ein 4X oder 10X für die grobe Annäherung an die Zelle; und ein 40X Immersionsmikroskop für große Entfernungen Beispiel Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM
Lupe	Olympus	U-TVCAC	UNBEDINGT ERFORDERLICH: im Strahlengang zwischen Objektiv und Kamera platziert; ermöglicht die Vergrößerung des Bildes auf dem Bildschirm, um den Knopf genau zu erreichen. Mit der
Aufnahmeelektrodenkamera	Olympus	DP72	ist eine gute Kamera erforderlich, um die Neuronen sowohl in der Fluoreszenz als auch im Hellfeld zu sehen; die Steuerungssoftware ist einfach und ermöglicht das Aufnehmen von Bildern und das Erstellen von Live-Kamerabildern, um die Annäherung der Elektrode an die Zelle zu überwachen. Eine hochempfindliche Kamera ist nicht notwendig
filtert	Olympus/Chroma		in Abhängigkeit von dem in den Mäusen verwendeten fluoreszierenden Protein; Beispiel für GFP: Anregung: BP460-490: Emission: HQ530/50m
Verstärker	HEKA	EPC10 USB	überwacht die durch die Aufnahmeelektrode fließenden Ströme und steuert auch das Puffen, indem es ein TTL-Signal an die Schorle sendet; der EPC10-Aufbau wird über eine Computersoftware gesteuert
	HEKA	Patchmaster	steuert den Verstärker während des Experiments
Mikromanipulator	Sutter	MP225	Präzisions-Mikromanipulator, ermöglicht präzise Bewegungen bis zu 1/10 Mikrometer; dieses Modell ist sehr stabil; vermeiden Sie hydraulische Manipulatoren, die abdriften können
Elektrodenabzieher	Sutter	P97	mit einem FT345-B Filament mit breiter Mulde;   zur Vorbereitung von Aufnahmepipetten von ca. 2µ m Durchmesser mit einer langen Spitze, um die Zellen zu erreichen; Der Widerstand sollte 15 bis 20 MOhm mit perforiertem Patch Clamp
Solution Glas	Sutter	BF120-69-10	betragen Unter unseren Aufnahmebedingungen ist dieses Glas ideal für die Aufnahme von Pipetten
Aufnahmekammer	Warner Instruments	RC-26G	eine Kammer wird benötigt, um die Vorbereitung unter dem Mikroskop einzustellen. Um die Präparation in der Mitte der Kammer zu halten, sollte ein Netz/Anker verwendet werden.
			Stimulationsglas
	WPI	TW100F-4	in Gruppen von 7 angebracht, diese Pipetten werden verwendet, um vorgezogene stimulierende Pipetten
Mehrzylinder-Abzieher	MDI	PMP-107-Z	durch Assoziation von Ziehen und Drehen, dieser Abzieher ermöglicht es uns, Puff-Elektroden mit 7 Fässern
Präzisions-Druckinjektor vorzubereiten	Toohey Company	P/N T25-1-900 Einkanal	Dieser Präzisions-Druckinjektor steuert den im Mehrzylinderabzieher abgegebenen Druck; er wird manuell oder vom Verstärker über einen 5V  gesteuert; TTLs
Mikromanipulator	Narishige	YOU-1	ein grober Manipulator reicht aus, um die Puffelektrode in die Nähe der Aufnahmestelle zu bringen
Schläuche	N/A		Tygonschlauch, um den Druck vom Puffer auf die Puffpipette zu bringen
Lösungen/Perfusion/Chemikalien
Vakuumpumpe	Gardner Denver	300 Serie	eine vibrierende Membranpumpe ist leiser und effizienter als andere Pumpentypen
Perfusionssystem	N/A	N/A	Schwerkraftperfusionssystem mit Polyethylenschlauch zum Ein- und Ausbringen der externen Lösung aus der Aufnahmekammer
Nystatin	Sigma-Aldrich	N3503	obligatorisch zur Perpation der internen Lösung für perforierte Patch-Klemme
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	Wird verwendet, um Nystatin für die interne Lösung für perforierte Pflaster aufzulösen
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9625	extrazelluläre Lösung
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P4504	intrazelluläre/extrazelluläre Lösung
Calciumchlorid-Dihydrat	Sigma-Aldrich	C7902	extrazelluläre Lösung
Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	extrazelluläre Lösung
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	extrazelluläre Lösung
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	extrazelluläre Lösung
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S6297	extrazelluläre Lösung
EGTA (Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure)	Sigma-Aldrich	E3889	innere Lösung
Kaliumhydroxyd	Sigma-Aldrich	P1767	innere Lösung
Methylsulfoxid	Sigma-Aldrich	W387509	intrazelluläre Lösung
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	intrazelluläre Lösung
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389	intrazelluläre Lösung