Methodenartikel

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

DOI:

10.3791/52655

⸱

6. Mai 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) wurde ausgiebig mit traditionellen Transgen Methoden zur Impfstoffentwicklung modifiziert. Die reduzierten Wirkungsgrade dieser traditionell geändert Ad5-Vektoren in klinischen Studien konnte in erster Linie mit Ad5 vorbestehenden Immunität (PEI) bei der Mehrheit der Bevölkerung korreliert werden. Um Ad5-vektorImpfstoffEntwicklung durch die Lösung der Anliegen der Ad5 PEI fördern, hat die innovative Antigen Capsid-Incorporation Strategie verwendet worden. Von Vorteil dieser Strategie Ad5 vektor wir zunächst die Hexon Shuttle konstruierte Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S durch Subklonieren der hypervariablen Region (HVR) 1 von Hexon in einen zuvor aufgebauten Shuttle-Plasmid HVR5-His 6 / pH5S, das hatte seine 6-Tag in die HVR5 eingebaut. Diese HVR1 DNA Fragment, das ein HIV-Epitop ELDKWAS synthetisiert. HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S war dann linearisiert und co-transformiert mit linearisierter Plasmid-Rückgrat pAd5 / ΔH5 (GL),zur homologen Rekombination. Diese kombinierte Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 wurde in Zellen transfiziert, um erzeugen den viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Dieser Vektor wurde validiert, um qualitative Eignung durch virale Titer physikalischen (VP / ml) angegeben, infektiöse Titer (IP / ml) und entsprechende VP / IP-Verhältnis haben. Sowohl die HIV-Epitop und His 6 -Tag waren oberflächenexponierten auf der Ad5 Kapsid, und behielt Epitop-spezifischen Antigenität ihrer eigenen. Ein Neutralisationstest zeigte die Fähigkeit dieser zweiwertigen Vektor Neutralisierung durch Ad5-positiven Seren in vitro zu umgehen. Mice Immunisierung zeigten die Erzeugung von robuster humorale Immunität spezifisch für die HIV-Epitop und His 6. Diese Proof-of-Principle-Studie vorgeschlagen, dass das Protokoll mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie assoziiert könnten durchaus für die Erzeugung von Ad5-vektor Impfstoffe durch Modifikation verschiedener Kapsidproteine ​​genutzt werden. Dieses Protokoll kann auch feiter zur Erzeugung von Seltenen Serotyp adenoviralen Impfstoffe modifiziert.

Einleitung

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Humanen Adenovirus (Ad) ist eine mittelgroße, nicht umhüllte Virus mit einem ikosaedrischen Nukleokapsid, das eine doppelsträngige DNA-Genom. Anzeige gehört zu der Familie Adenoviridae, mit einer Einteilung in sieben Gruppen (A bis G). Jede Gruppe enthält Virus der verschiedenen Serotypen. Von denen, Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) aus der Gruppe C war der am besten untersuchten und die am meisten für vectored Ansätze wie die Gentherapie und Impfungen angewendet.

Die traditionelle Strategie Transgen wurde entwickelt und für Ad5 Modifikationen, die durch die Verschiebung der Virus-Early-Gene mit einem Gen von Interesse charakterisiert ist, und der fokussierte Expression des Gens von Interesse in einem Wirt. Beispiele sind der Bau von pENV9 / Ad5hrΔE3 durch Ersetzen des frühen Gens 3 (E3) mit rev-Gen des Simian Immunodeficiency Virus 1, die Konstruktion AdCMVGag durch Ersetzen des frühen Gens 1 (E1) mit dem gag-Gen des Human ImmunodeficiencyVirus (HIV) 2, und der Aufbau der Anzeige lac Z durch Ersetzen E1 mit lac Z-Gen 3. Die breite Anwendung der traditionellen transgene Strategie für Ad5 hängt von folgenden Vorteile: die Vielzahl von Hosts für Ad5, die machbar Gentechnik auf Viren und Virusvermehrung, die große Aufnahme von Fremdgens Einsatz und die Sicherheit von Ad5 4,5. Allerdings sind die reduzierten Wirkungsgrade Ad5-vektor klinischen Therapien durch die Verwendung dieser Strategie war ein wichtiger Engpass, der kartiert hat in erster Linie mit Ad5 PEI zugeordnet werden, da Ad5 ist so weit verbreitet bei der Mehrheit der Kinder und Erwachsene 4,6.

Um den Engpass von Ad5 zu überwinden, ist das vorrangige Ziel, eine alternative Strategie Umgehung Ad5 PEI zu entwickeln. Angeborenen Immunität 7 adaptiven Immunität wie neutralisierende Antikörper (NAbs) 8-10 und CD8 + T-Zellantworten gegen 10 Ad5 wurde gezeigt, zusammenntribute zu Ad5 PEI mit Ad5 NAbs erscheinen, um die dominante Rolle bei den Beiträgen um Ad5 PEI 10,11 zu spielen. Außerdem Ad5 NABS Zielepitope in Kapsidproteine ​​gelegen, darunter die Hauptprotein Hexon, Ballaststoffe und Pentonbasis. Davon ist Hexon das Hauptziel von Ad5 NAbs 8,11-13. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine innovative Antigen Capsid-Incorporation Strategie eingeführt. Diese neue Strategie hebt die Ersatz oder Einbau von Proteinen von Interesse auf Ad5 Kapsid-Proteine, welche die Ad5 neutralisierende Epitope verschiebt oder Masken, die zur Anerkennung durch die verringerte NAbs und effiziente Ad5 Vektor Verwaltungen. Es ist bemerkenswert, dass diese Strategie ist wettbewerbsfähig, weil es kann auch helfen, Hosts zu entlocken robuste humorale Immunität und starke zelluläre Immunität durch direkte Präsentation von Antigenen von Interesse für das Immunsystem 4,14,15. Auf der Basis dieser Strategie kann die molekulare Klonierung und rekombinante virale Vektor Ad Rettungsstrukturteilenin vier Schritten: (a) die Herstellung von Gen-of-Interest-Fragment entweder durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der Synthese; (B) die Ligation des Genfragments in einem Shuttle-Plasmid, das das Gen von Interesse homologe Fragment und Arme an einen Adenovirus-Rückgrat enthält; (C) eine homologe Rekombination durch Co-Transformation mit dem Shuttle-Plasmid, das das Gen von Interesse Fragment mit dem linearisierten Plasmid-Rückgrat pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) die Transfektion linearisiert rekombinanten adenoviralen Plasmid zu retten, die das rekombinante Ad-Vektor mit Antigenen von Interesse aufgenommen.

Unsere Gruppe und einige andere haben dieses alternative Ad Einarbeitung Strategie für Ad vectored Entwicklung von Impfstoffen gegen verschiedene Infektionserreger erweitert. Wir berichteten die Erzeugung eines rekombinanten Vektors Ad Ad-HVR1-Lgs-His 6 -V3 durch Einbringen eines His-HIV-1-Antigen V3 in die HVR1 Gebietsschema der Ad5 Hexon (hexon5). Dies erzeugt vector ausgelöst strOng humoralen Immunantwort spezifisch für die V3-Epitop 4. Wir berichteten auch die Entwicklung von Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 indem HIV-1-Membran proximalen Ektodomäne Bereich (MPER) in die HVR2 locale hexon5 2. Darüber hinaus hat Dr. Zhous Gruppe die Vorteile dieser Ad Einbau-Strategie verwendet, um Ad-Serotyp 3 (Ad3) vektorisierte Impfstoffe, dh. Die Entwicklung, die Erzeugung von viralen Vektor R1SP70A3 durch den Einbau eines neutralisierende Epitop SP70 von Enterovirus 71 in den HVR1 der Ad3 Hexon (hexon3). R1SP70A3 erzeugt starke NAbs und IFN-γ Produktion spezifisch für das Epitop SP70, die auf die hohe Rate der Schutz gegen Enterovirus 71 Herausforderung 15 führen.

Zum Zwecke der technischen Referenz, nahmen unsere Studie Vorteil der qualitativen Antigen Capsid-Incorporation Strategie, sich auf die Erzeugung eines zweiwertigen Ad5 Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 konzentrieren indem ein HIV-1-Antigen in HVR1 einda His-Tag in der HVR5 hexon5. Die erzeugte Virusvektor wurde ebenfalls immunologisch bewertet. Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie könnte auf die Entwicklung von Ad5-vektor Impfung Ansätze gegen verschiedene Infektionskrankheiten eingesetzt werden.

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Protokoll

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Die Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Benutzung und Pflege Committee genehmigt die Verwendung von Mäusen, wie sie hier im Rahmen der genehmigten Protokoll-Nummer 101109272 beschrieben.

1. Genetische Konstruktion eines modifizierten Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie

  1. Der Bau des Shuttle-Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S
    1. Bestellen ein Plasmid, das die synthetisierte DNA Sequenz HVR1-KWAS zwischen den Restriktionsenzymstellen auf AgeI AccI von hexon5 Gens.
    2. Verdauen 6 ug des synthetisierten Fragments (HVR1-KWAS) mit den Enzymen AgeI (6 Einheiten) und AccI (6 Einheiten) für 3 Stunden bei 37 ° C. Die verdauten Fragments in einem 2% igen Agarosegel durch Elektrophorese und Reinigung des Fragments mit einem DNA-Gel-Extraktions-Kits gemß dem Protokoll des Herstellers.
    3. Bezogen auf das molare Verhältnis von Insert zu Vektor 3: 1, zu verwenden T4 DNA-Ligase und Ligase-buffer bis 12 ng des Fragments (HVR1-KWAS) in 100 ng eines zuvor aufgebauten Shuttle-Plasmid ligiert HVR5-His 6 / pH5S 17 in einem Volumen von 10 ul bei Raumtemperatur für 2 h über den Stellen der AgeI und AccI.
    4. Transformations 1 ul von 10 & mgr; l des Ligationsprodukts in 50 ul elektrokompetente DH5a-Zellen in einem Elektroporator (bei 1800 V). Add 950 ul SOC-Medium zu den transformierten DH5a-Zellen und Inkubieren des Gemisches für 1 Stunde bei 37 ° C mit 300 Umdrehungen pro Minute. Verteilt 100-200 ul der 1 ml Mischung auf Luria-Bertani (LB) -Agar, enthaltend Kanamycin und inkubieren O / N bei 37 ° C.
      1. Auf Bildschirm ~ 10 Kolonien durch PCR gezielt den Fragment HVR1-KWAS, mischen Sie die Vorwärts-Primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), Reverse-Primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) und ein Einzel DH5a Kolonie in ein PCR-Master-Mix-Lösung (nach Herstellerprotokoll). Führen Proben auf einem Thermocycler unter Bezugnahme auf das Handbuch mit der PCR-Mastermix Lösung bereitgestellt.
      2. Verwenden Sie die Vorwärts-Primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), um das Fragment HVR1-KWAS in den Klonen im Abschnitt 1.1.4.1 abgeschirmt zu sequenzieren.
  2. Konstruktion des Plasmids pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Digest 6 ug HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S mit Enzymen EcoRI (6 Einheiten) und PmeI (6 Einheiten) für 3 Stunden bei 37 ° C und Reinigung des Fragments, das die homologe Rekombination Arme und die Doppel modifizierten hexon5 Gen, wie in Schritt 1.1.2 angegeben. Linearisieren das Rückgrat Plasmid pAd5 / ΔH5 (GL) 16 mit SwaI.
    2. Co-Transformation 100 ng der Ziel-Fragment aus dem Shuttle-Plasmid und 100 ng des linea pAd5 / ΔH5 (GL) Rückgrat in 50 ul elektrokompetenter BJ5183-Zellen für die homologe Rekombination in einem Elektroporator (bei 1800 V). Add 950 ul SOC-Medium zu den transformierten Zellen und Inkubieren des Gemisches für 1 Stunde bei 37 ° C, 300 Upm. Verbreiten 100-200 ul der 1 ml Mischungauf der LB-Agar mit Kanamycin (final 50 ug / ml) für die O / N-Inkubation bei 37 ° C.
      1. Pick ~ 10 winzige Kolonien in 3 ml flüssiges LB, welches Kanamycin (final 50 ug / ml) für O / N Inkubation bei einem Schüttler (250 rpm, 37 ° C). Extrahieren Plasmide aus der Kultur. Verwenden Sie die PCR-Analyse, um die 10 Kolonien, indem sie auf das Fragment HVR1-KWAS Bildschirm wie in Schritt 1.1.4.1 dargestellt.
      2. Um die gleichen Kolonien durch PCR-Analyse zur Förderung der pIX Fragment des Backbone-Genom-Bildschirm, mischen Sie die Vorwärts-Primer (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), Reverse-Primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) und ein Einzel BJ5183 Kolonie in ein PCR-Master-Mix-Lösung (nach Herstellerprotokoll). Führen Proben auf einem Thermocycler unter Bezugnahme auf das Handbuch mit der PCR-Master-Mix-Lösung zur Verfügung gestellt.
      3. Bezeichnen die PCR doppelt positive Kolonien als pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
    3. Transform 100 ng des Plasmids pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 inum Zellen DH5 wie in Schritt 1.1.4 dargestellt.
      1. Verwenden Sie die PCR-Analyse zu, indem sie auf das Fragment HVR1-KWAS Bildschirm ~ 10 Kolonien, wie in Schritt 1.1.4.1 dargestellt.
      2. PCR-Analyse verwenden, um die gleichen Kolonien durch Targeting des pIX-Fragment des Genom-Backbone-Bildschirm, wie in Schritt 1.2.2.2 dargestellt.
      3. Verwenden Sie die Vorwärts-Primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), um das Fragment HVR1-KWAS in pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 sequenzieren.

2. Herstellung von modifiziertem Ad5 viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6

  1. Bilden die Komplettmedium durch Zugabe von FBS (final 10%), 100X Non-essentiellen Aminosäuren (final 0,1 mm), 200 mM L-Glutamin (2 mM final) und Penicillin / Streptomycin-Lösung (final 1%) in DMEM mit hohem Glucose . Pflege der menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK293-Zellen) in vollständigem Medium in einem Brutschrank (37 ° C und 5% CO2 bei 85% befeuchteten Bedingungen).
  2. Rettung von viralen vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Samen 3,0 x 10 6 HEK293-Zellen in einem T-25-Kolben mit 5 ml Vollmedium und Kultur O / N, um eine Monoschicht mit 80% Konfluenz zu erreichen.
    2. Linearisieren 15 ug pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 in einem Volumen von 100 ul mit dem Restriktionsenzym PacI (15 Einheiten) bei 37 ° C für 3 Stunden.
      1. Extrahieren linearisiert pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Zentrifugieren der Reaktions zweimal (10.000 × g für 1 min) mit einem gleichen Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (Verhältnis 25: 24: 1) in einer Abzugshaube und durch sequentielle Zentrifugation (10.000 × g für 10 min) mit einer gemischten Lösung (300 & mgr; l 100% Ethanol und 10 ul Natriumacetat) und 700 ul 70% Ethanol. Überstand verwerfen an jedem Zentrifugationsschritt.
    3. Resuspendieren des gereinigten Plasmids in ~ 40 ul destilliertem Wasser und Tris-EDTA (TE) Puffer. Quantifizierung der Plasmid-DNA durch Messung der optischen density (OD) bei 260 nm.
    4. Transfektion von 3 ug des linearisierten Plasmids mit kommerziellen liposomalen Transfektionsreagenz im T-25-Kolben, entsprechend der Anleitung des Herstellers. Ändern Sie das Transfektionsmedium mit Komplettmedium bei 6 Stunden nach der Transfektion und nachfolgende Inkubation im Brutschrank. Pflegen transfizierten Zellen durch Ersetzen Komplettmedium alle zwei bis drei Tage, bis einzelne viralen Plaques bilden.
    5. Wenn Plaques entwickeln die volle cytopathische Wirkung (CPE), kratzen die restlichen Zellen von der Flasche in eine sterile Haube und des Ernte Zelllysat durch Zentrifugation Medium bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Suspendiere das Zellpellet in ~ 1 ml Medium, enthaltend 2% FBS und brechen die Zellen durch Einfrieren und Auftauen viermal. Sammeln Sie den Überstand, der nach dem Zentrifugieren gewonnenen Virus-Lysat bei 10000 g 10 min bei 4 ° C.
  3. Groß angelegte Ausbreitung des viralen Vektors Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Propagieren thE-Virus in einer T-75-Kolben, der HEK293-Zellen in der sterilen Abdeckung durch Infektion mit 1/3 bis volle Lysat aus dem T-25-Kolben. Erlauben Sie vollen CPE innerhalb von zwei bis drei Tagen in der Kulturbrutschrank zu entwickeln. Ernten Sie die Lysatüberstand wie in Schritt 2.2.5 angegeben.
    2. Propagieren das Virus in 2.59 T-175-Kolben in dem sterilen Haube durch Infektion mit 1/2 bis volle Lysat aus dem T-75-Kolben in Abhängigkeit von den Ausbreitungsbedingungen Virus. Erlauben Sie vollen CPE innerhalb von zwei bis drei Tagen in der Kulturbrutschrank zu entwickeln. Ernten Sie die Lysatüberstand wie in Schritt 2.2.5 angegeben.
    3. Propagieren das Virus in einem Dutzend oder mehr T-175-Kolben in dem sterilen Haube durch Infektion mit 1/2 bis volle Lysat aus dem vorherigen T-175-Kolben (n). Die Höhe der Kolben Nutzung basierend auf den Virusausbreitungsbedingungen und der Menge des Virus in der Notwendigkeit. Ernten Sie die Lysatüberstand wie in Schritt 2.2.5 angegeben, wenn sie voll CPE innerhalb von zwei bis drei Tage in der Kulturbrutschrank auf.
  4. Purification von Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Cäsiumchlorid-
    1. Man stellt zwei Dichten CsCl-Lösungen in 5 mM HEPES: 1,33 g / ml und 1,45 g / ml, während die Vermeidung des Kontakts mit CsCl.
    2. Last 4 ml CsCl (1,33 g / ml) in einer sterilen Ultrazentrifugenröhrchen, und sanft geladen 4 ml CsCl (1,45 g / ml) gegen die Unterseite des Rohres. Last 4 ml Lysatüberstand langsam auf der Oberseite der Gradienten in dem sterilen Haube.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 110.000 × g für 3 Stunden bei 4 ° C, um das reife / niedriger Virusbande von der defekten / höhere Virusbande zu trennen. Sammeln Sie das untere Band unter Verwendung einer 3-ml-Spritze mit einer 33 G-Nadel bewaffnet und verdünnt das Band mit 5 mM HEPES mit einem 4 ml Volumen in der sterilen Haube.
    4. Legen Sie eine andere Röhre mit zwei Dichten von CsCl-Lösungen und der verdünnten Band von Virus, wie in Schritt 2.4.2 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 110.000 xg O / N bei 4 ° C. Sammeln Sie die Virus Band, wie in Schritt 2.4.3 beschrieben.
    5. Spritzen Sie die gesammelten Virus-Lösung in einem dialysKassette ist durch eine 3-ml-Spritze mit einer 33 G-Nadel in den sterilen Haube bewaffnet.
    6. Setzen Sie die Kassette in 700 ml 1x Dialysepuffer (1 L Rezept: 100 ml 10x PBS, 100 ml 100% Glycerin und 800 ml destilliertem Wasser, filtern die Puffer durch ein 0,22 um-Filter) und ersetzen Sie die Dialysepuffer alle 3 Stunden für 4 mal. Saugen Sie dialysierten Virus-Lösung unter Verwendung von Nadelvlies-Spritze.

3. Validierung des rettete viralen Vektor

  1. Viralen Vektor Titrationen
    1. Für das Virus physikalischen Titers verwässern beide Virus und Dialysepuffer (Hintergrundkontrolle) bei 1: 10 und 1: 20 in Virus Lysepuffer (10% SDS in Tris-EDTA) in Röhrchen, und Inkubieren alle Röhrchen bei 56 ° C 10 min.
    2. Schalten Sie ein BioPhotometer und stellen Sie den Modus der Absorption bei OD 260 nm. Verwenden Sie den Dialysepuffer verdünnt (1: 10), um das Hintergrundsignal durch Klicken auf die "leere" unten auszugleichen. Geben Sie "10 + 90" im BioPhotometer screen, und lesen Sie das Signal des verdünnten Virus (1: 10).
    3. Lesen Sie das Signal des verdünnten Virus (1: 20) Nach dem Verfahren in Schritt 3.1.2, sondern geben Sie "5 + 95" im BioPhotometer Bildschirm. Multiplizieren die beiden Virusauslese Zahlen von 1.1x10 12 und der Berechnung der mittleren Titer mit einer Einheit wie VP / ml, basierend auf den zwei individuellen Titer der beiden Verdünnungen.
    4. Für das Virus infektiöse Titer (IP / ml), verwenden Sie die Karber statistischen TCID 50 Verfahren 14, um die Infektion Tiefe auf HEK293-Zellen nach 10 Tagen nach der Infektion zu bestimmen (dpi)
  2. Bewertung der antigenen Belichtungsanzeige auf dem viralen Vektor
    1. Mantel der virale Vektor in einer ELISA-Platte und fahren Sie mit dem Rest der Schritte in einem Standard-ELISA-Verfahren 14. Verwenden menschlichen anti-gp41 (2F5) monoklonale Antikörper (mAb) und Maus-anti-His Tag-mAb für den Nachweis von Antigenen 14 entsprechend eingebaut.
    2. Beheben Sie den viralen Vektor in einem denatured Protein-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und fahren Sie mit dem Rest der Schritte in einem Standard-Western-Blot-Verfahren 14. Verwenden menschlichen anti-gp41 (2F5) monoklonale Antikörper (mAb) und Maus-anti-His Tag-mAb für den Nachweis von Antigenen 14 entsprechend eingebaut.
  3. In-vitro-Bewertung des Vektors auf der Fähigkeit, Ad5-positve Seren umgehen
    1. Aufrechtzuerhalten HeLa-Zellen in Komplettmedium in der Kulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO 2 bei 85% befeuchteten Bedingungen). Bilden die Komplettmedium durch Zugabe von FBS (final 10%), 200 mM L-Glutamin (2 mM final) und Penicillin / Streptomycin-Lösung (final 1%) in Minimum Essential Medium Eagle (MEME).
    2. Seed HeLa-Zellen in 6-Well-Platten mit 1x10 6 Zellen / Vertiefung und inkubieren Sie die Platten in der Kulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO 2 unter 85% befeuchteten Bedingungen) für 2 Stunden. Inkubieren Ad5-positiven Seren (0,1 & mgr; l bzw. 0 & mgr; l) mit 5 IP / Zelle viraler Vektor (Ad5 oder Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6) in dem Brutschrank 1 h vor der Zugabe der Mischungen auf die Platten mit 6 Vertiefungen, die Zellen enthält.
    3. Nach 24 Stunden nach der Infektion (hpi), spülen Zellen einmal mit PBS und lysieren Zellen in 0,5 ml Lysepuffer. Zentrifugieren bei 15.000 xg für 5 min und Sammeln des Überstandes. Mix 20 ul des Überstands mit 100 ul Luciferase-Substrat für die Luciferase-Signal das Lesen, da die Viren enthalten, die die Luciferase-Gens.

4. Immunologische Bewertung des rettete viralen Vektor

  1. Bereiten Sie zwei Immunisierung Gruppen: Ad5 und Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
    1. Injizieren Mäusen (n = 8 / Gruppe) intramuskulär mit Viren zu 1x10 10 VP / Maus, in einer homologen "Prime-Boost" Immunisierungsschema, mit einem Abstand von 2 Wochen.
    2. 2 Wochen nach jeder Injektion, bluten Mäuse ohne Betäubung durch Wange Blutungen mit Tierlanzetten (5 mm Spitzenlänge) bissammeln Blut in 1,5 ml-Röhrchen.
  2. Mischen Sie das Blut in den Rohren durch Umdrehen auf und ab, und Inkubation das Blut bei Raumtemperatur 30 min. Dreh die Röhrchen bei 10.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Transfer Seren (Oberschicht), neue 1,5-ml-Röhrchen.
    1. Dreh die neue Röhrchen bei 10.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Transfer Seren neu bei -80 ° C markiert 1,5 ml Röhrchen für die Lagerung.
  3. Auswertung der Antigen-spezifische humorale Immunität durch Seren basierenden ELISA
    1. Verdünnen Sein Peptid (Lager bei 1 mM) und HIV-1-Peptid (Lager bei 1 mM) separat in 100.
    2. mM Carbonatpuffer (pH 9,5), um das Peptid Beschichtungskonzentration auf 10 & mgr; M zu erreichen. Beschichtung der ELISA-Platten mit den Peptiden getrennt verdünnt durch Zugabe von 100 ul pro Vertiefung und Inkubation der Platten O / N bei 4 ° C.
    3. Waschen Sie die Platten mit PBST viermal mit 200 ul / Vertiefung und Block für 1 Stunde in 5% BSA in PBST. Gelten Mäuseseren auf die Platten in einer 1: 100 Verdünnung in Blockier buffer, 100 ul / Vertiefung. Inkubieren für 2 h bei RT inkubiert.
    4. Viermal Waschen Sie die Platten mit PBST. Die Platten durch Inkubation bei RT für 30 Minuten in Blockierungspuffer mit 100 ul / Vertiefung.
    5. Gelten Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP (1: 5000 in Blockierpuffer) mit 100 ul / Vertiefung zu den beiden mit seinem Peptid und HIV-1-Peptid einzeln beschichteten Platten. Inkubieren für 2 h bei RT. Mit PBST waschen die Teller.
    6. Lesen der Platten bei OD450 nm nach der Inkubation mit HRP-Substrat für 30 min.

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Ergebnisse

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Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Abbildung 1A) wurde eingesetzt, um das zweiwertige Ad5 virale Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 zu erzeugen. Zunächst wird das Shuttle-Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S wurde durch Subklonieren HVR1-KWAS Fragment in den früheren Shuttle-Plasmid konstruiert HVR5-His 6 / pH5S 17 aufgebaut. Zweitens das Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14 wurde durch eine homologe Rekombination zwischen ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Anwendung des traditionellen Transgen Strategie Ad5 Modifikation für die Entwicklung von Impfstoffen wurde in erster Linie auf den Flaschenhals mit der Ad5 PEI 4,6 zugeordnet vermindert worden. Dieser Engpass kann teilweise durch Anwendung der alternativen Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Abbildung 1A) vermindert werden, da diese Strategie kann die Neutralisation von Ad5 NAbs entziehen indem neutralisierende Epitope von Ad5 mit Antigenen von Interesse, und erleichtert die Erzeugung...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch National Institutes of Health gewährt 5T32AI7493-20 und 5R01AI089337-03 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01für die Zellspaltung 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02für die Herstellung von Dialysepuffern
GlycerinSIGMAG5516-1Lfür die Herstellung von Dialysepuffern
SDSBIO-RAD161-0301für die Aufbereitung von Viruslysepuffern
Fötales Rinderserum (FBS)Thermo ScientificSH30910.03Bestandteil des Kulturmediums
100x nicht-essentielle Aminosäuren nbsp;Thermo ScientificSH30238.01Bestandteil des Kulturmediums
200 mM L-GlutaminCellgro25-005-CIBestandteil des Kulturmediums
Penicillin/Streptomycin-Lösung Cellgro30-002-CIKomponente des Kulturmediums
DMEM mit hohem GlukosegehaltThermo ScientificSH30081.01für HEK293 Zellkultur
Minimum Essential Medium EagleSIGMAM5650für HeLa Zellkultur
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol SIGMAP3803-100MLfür die großflächige DNA-Aufreinigung
Cäsiumchlorid Research Products International Corp.C68050für die Virusaufreinigung
HEPESCellgro25-060-CIfür die Herstellung von CsCl-Lösungen
HEK293ATCC51-0036für die Virusrettung und Upscale
HeLaATCCCCL-2für Neutralisationsassay
T-25-KolbenThermo Scientific156367für Zellkultur 
T-75 KolbenCORNING430641für Zellkultur 
T-175 KolbenThermo Scientific159910für Zellkultur 
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Referenzen

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