Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.
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Methodenartikel
Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) wurde ausgiebig mit traditionellen Transgen Methoden zur Impfstoffentwicklung modifiziert. Die reduzierten Wirkungsgrade dieser traditionell geändert Ad5-Vektoren in klinischen Studien konnte in erster Linie mit Ad5 vorbestehenden Immunität (PEI) bei der Mehrheit der Bevölkerung korreliert werden. Um Ad5-vektorImpfstoffEntwicklung durch die Lösung der Anliegen der Ad5 PEI fördern, hat die innovative Antigen Capsid-Incorporation Strategie verwendet worden. Von Vorteil dieser Strategie Ad5 vektor wir zunächst die Hexon Shuttle konstruierte Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S durch Subklonieren der hypervariablen Region (HVR) 1 von Hexon in einen zuvor aufgebauten Shuttle-Plasmid HVR5-His 6 / pH5S, das hatte seine 6-Tag in die HVR5 eingebaut. Diese HVR1 DNA Fragment, das ein HIV-Epitop ELDKWAS synthetisiert. HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S war dann linearisiert und co-transformiert mit linearisierter Plasmid-Rückgrat pAd5 / ΔH5 (GL),zur homologen Rekombination. Diese kombinierte Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 wurde in Zellen transfiziert, um erzeugen den viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Dieser Vektor wurde validiert, um qualitative Eignung durch virale Titer physikalischen (VP / ml) angegeben, infektiöse Titer (IP / ml) und entsprechende VP / IP-Verhältnis haben. Sowohl die HIV-Epitop und His 6 -Tag waren oberflächenexponierten auf der Ad5 Kapsid, und behielt Epitop-spezifischen Antigenität ihrer eigenen. Ein Neutralisationstest zeigte die Fähigkeit dieser zweiwertigen Vektor Neutralisierung durch Ad5-positiven Seren in vitro zu umgehen. Mice Immunisierung zeigten die Erzeugung von robuster humorale Immunität spezifisch für die HIV-Epitop und His 6. Diese Proof-of-Principle-Studie vorgeschlagen, dass das Protokoll mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie assoziiert könnten durchaus für die Erzeugung von Ad5-vektor Impfstoffe durch Modifikation verschiedener Kapsidproteine genutzt werden. Dieses Protokoll kann auch feiter zur Erzeugung von Seltenen Serotyp adenoviralen Impfstoffe modifiziert.
Einleitung
Humanen Adenovirus (Ad) ist eine mittelgroße, nicht umhüllte Virus mit einem ikosaedrischen Nukleokapsid, das eine doppelsträngige DNA-Genom. Anzeige gehört zu der Familie Adenoviridae, mit einer Einteilung in sieben Gruppen (A bis G). Jede Gruppe enthält Virus der verschiedenen Serotypen. Von denen, Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) aus der Gruppe C war der am besten untersuchten und die am meisten für vectored Ansätze wie die Gentherapie und Impfungen angewendet.
Die traditionelle Strategie Transgen wurde entwickelt und für Ad5 Modifikationen, die durch die Verschiebung der Virus-Early-Gene mit einem Gen von Interesse charakterisiert ist, und ....
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Protokoll
Die Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Benutzung und Pflege Committee genehmigt die Verwendung von Mäusen, wie sie hier im Rahmen der genehmigten Protokoll-Nummer 101109272 beschrieben.
1. Genetische Konstruktion eines modifizierten Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie
- Der Bau des Shuttle-Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S
- Bestellen ein Plasmid, das die synthetisierte DNA Sequenz HVR1-KWAS zwischen den Restriktionsenzymstellen auf AgeI AccI von hexon5 Gens.
- Verdauen 6 ug des synthetisierten Fragments (HVR1-KWAS) mi....
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Ergebnisse
Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Abbildung 1A) wurde eingesetzt, um das zweiwertige Ad5 virale Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 zu erzeugen. Zunächst wird das Shuttle-Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S wurde durch Subklonieren HVR1-KWAS Fragment in den früheren Shuttle-Plasmid konstruiert HVR5-His 6 / pH5S 17 aufgebaut. Zweitens das Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14 wurde durch eine homologe Rekombination zwischen .......
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Diskussion
Die Anwendung des traditionellen Transgen Strategie Ad5 Modifikation für die Entwicklung von Impfstoffen wurde in erster Linie auf den Flaschenhals mit der Ad5 PEI 4,6 zugeordnet vermindert worden. Dieser Engpass kann teilweise durch Anwendung der alternativen Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Abbildung 1A) vermindert werden, da diese Strategie kann die Neutralisation von Ad5 NAbs entziehen indem neutralisierende Epitope von Ad5 mit Antigenen von Interesse, und erleichtert die Erzeugung.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch National Institutes of Health gewährt 5T32AI7493-20 und 5R01AI089337-03 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | für die Zellspaltung |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | für die Herstellung von Dialysepuffern |
| Glycerin | SIGMA | G5516-1L | für die Herstellung von Dialysepuffern |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | für die Aufbereitung von Viruslysepuffern |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | Bestandteil des Kulturmediums |
| 100x nicht-essentielle Aminosäuren nbsp; | Thermo Scientific | SH30238.01 | Bestandteil des Kulturmediums |
| 200 mM L-Glutamin | Cellgro | 25-005-CI | Bestandteil des Kulturmediums |
| Penicillin/Streptomycin-Lösung | Cellgro | 30-002-CI | Komponente des Kulturmediums |
| DMEM mit hohem Glukosegehalt | Thermo Scientific | SH30081.01 | für HEK293 Zellkultur |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | für HeLa Zellkultur |
| Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol | SIGMA | P3803-100ML | für die großflächige DNA-Aufreinigung |
| Cäsiumchlorid | Research Products International Corp. | C68050 | für die Virusaufreinigung |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | für die Herstellung von CsCl-Lösungen |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | für die Virusrettung und Upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | für Neutralisationsassay |
| T-25-Kolben | Thermo Scientific | 156367 | für Zellkultur |
| T-75 Kolben | CORNING | 430641 | für Zellkultur |
| T-175 Kolben | Thermo Scientific | 159910 | für Zellkultur |
| Ultrazentrifuge | BECKMAN | NA | für die Virusaufreinigung |
| Ultrazentrifugenröhrchen | BECKMAN | 344059 | für die Virusaufreinigung |
| Dialysekassette | Thermo Scientific | 66380 | für die Virusdialyse |
| ELISA-Platte | Thermo | Scientific 442404 | für ELISA |
| humanes Anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagenzprogramm | 1475 | für immunologische Assays |
| Maus Anti-His-Tag mAb | GenScript | A00186 | für immunologische Assays |
| SOC-Medium | CORNING | 46-003-CR | für die Transformation |
| PCR-Mastermix-Lösung | QIAGEN | 201445 | für PCR |
| Tierlanzette (Punktlänge bei 5 mm) | MEDIpoint | für Blutungen bei Mäusen | |
| Biophotometer | Eppendorf | für die physikalische Titertitration von Viren |
Referenzen
- Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
- Matthews, Q. L., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
