Methodenartikel

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

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DOI:

10.3791/52656

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15. März 2015

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1Department of Pediatrics, Stanford University School of Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.

Zusammenfassung

Bone ist die häufigste Stelle der Metastasierung von Brustkrebs. Obwohl es allgemein, dass der Mikro Einflüsse Krebszellverhalten akzeptiert wird, wird wenig über Brustkrebszell Eigenschaften und Verhaltensweisen in der nativen Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe bekannt. Wir haben Ansätze zu verfolgen, zu quantifizieren und zu modulieren menschlichen Brustkrebszellen in der Mikroumgebung des entwickelten kultivierten menschlichen Knochengewebefragmenten aus gebrauchten Femurköpfe nach Hüft-TEP Operationen isoliert. Verwendung Brustkrebszellen für Luciferase konstruiert und verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) Expression sind wir in der Lage, reproduzierbar zu quantifizieren Migration und Proliferation Muster mit Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), Spur Zell-Wechselwirkungen innerhalb der Knochenfragmente mittels Fluoreszenzmikroskopie und auszuwerten Brustzellen nach Besiedlung mit Durchflusszytometrie. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind: 1) eine native, architektonisch intaktem Gewebe MicroEnvironment relevanten Zelltypen des Menschen beinhaltet, und 2) direkten Zugriff auf die Mikroumgebung, die eine schnelle quantitative und qualitative Überwachung und Störung der Brust und Knochenzelleigenschaften, Verhaltensweisen und Interaktionen ermöglicht. Eine Haupteinschränkung, derzeit ist die finite Lebensfähigkeit der Gewebefragmente, die das Fenster der Studie, um Kurzzeitkultur beschränkt. Anwendungen des Modellsystems umfassen die Untersuchung der Grundlagen der Biologie von Brustkrebs und anderen Knochensuchmalignomen in der metastatischen Nische, und die Entwicklung therapeutischer Strategien zur zielgerichteter Brustkrebszellen in Knochengewebe.

Einleitung

Die Tumor-Mikroumgebung wird weithin als ein kritischer Faktor für die Krebszelle Verhalten bei Brustkrebs Progression und Metastasen erkannt verteilt 1-3. Das Ziel der hier vorgestellten Verfahren ist die Untersuchung von Brustkrebs-Zellen in der Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe, die häufigste Stelle der Brustkrebsmetastase 4-6 erleichtern. Knochen von mineralisierten und Mark Fächer 7-9, die beide beherbergen Zellen sezerniert Faktoren bei metastasierendem Progression 10,11 verwickelt zusammen. Obwohl weit verbreitet in vivo Mausmodellen zu erleichtern systemische Studien des metastatischen Prozesses 12-15, Zell-Wechselwirkungen innerhalb des Skeletts sind nicht für die Beobachtung und direkten Störung leicht zugänglich. Modellsysteme für die Untersuchung und Kultivierung von Maus-Knochengewebe und Knochenmarkzellen der Maus einen besseren Zugang und haben viele Erkenntnisse über Sprechen und Mechanismen, die Brustkrebs-Zell m ergabetastasis der murinen Gerüst 16-22. Studien haben jedoch ergeben, dass es artspezifische Muster osteotropism für Knochengewebe 23,24 sein. Diese Muster inhärent speziesspezifische Unterschiede in der Knochengewebeeigenschaften, von Differenzen aus veränderten Knochenmarkspopulationen in immundefizienten Mäusen 11 und / oder der relativ jungen Alter der Mäuse in Experimenten verwendet, von denen alle voraussichtlich Determinanten des Knochens beziehen könnte Mikroumgebung.

In vitro-Ansätzen zur Untersuchung Brustkrebszellen in menschlichen Knochen Kokulturen wurden typischerweise auf bestimmten Knochenzelltypen wie Mark abgeleiteten Osteoblasten oder Stromazellen als Monolayer kultiviert oder in konstruierte 3-dimensionale Modellsysteme 25-35 konzentriert. Obwohl 2-dimensionalen Zellkulturmodellen haben die Hauptstütze der in vitro gebildeten Ansätze für die Krebsforschung ist seit langem bekannt, dass das Zellverhalten ist grundsätzlich in m verändertonolayer Kultursystemen 18,36,37. Dies hat zur Entwicklung von technisch Mikroumgebungen, die die Komplexität von 3-dimensionalen lebenden Geweben, einschließlich Matrix- und Gerüst basierende Modelle von natürlichen Materialien wie Collagen nachahmen geführt, oder synthetische Polymere geimpft mit spezifischen Zelltypen, die gewebeartige Mikroumgebungen zu schaffen 36-41. Engineered Ansätze haben auch die Verwendung von Bioreaktor Plattformen zu kontrollieren und zu untersuchen das hormonelle Milieu der Mikro 18,19,41-43. Obwohl biomimetische Modelle und Bioreaktoren bieten viele Elemente eines komplexen Gewebemikroumgebung, in einer kontrollierten Umgebung und wurden erfolgreich angewendet, um die Studie von Brustkrebs Metastasen in Knochen 18,19,35,42,43 voranzubringen, müssen entwickelt Modellsysteme in der Regel nicht übernehmen das gesamte Spektrum von Zelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten innerhalb der nativen Knochen Umwelt vorhanden.

Bis vor kurzem BrustkrebsZellen wurden nicht innerhalb der nativen intakten, 3-dimensional-Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe untersucht worden. Vor kurzem berichteten wir die Entwicklung eines Co-Kultur-Modell mit menschlichen Knochengewebefragmenten aus Hüft isoliert (THR) Chirurgie Proben 44. Diese Proben bergen sowohl die Mineralisierung und Knochenmark Fächer notwendig, Mechanismen Mikrometastasen in Kurzzeitkultur zugrunde zu studieren. In früheren Arbeiten haben wir Proof-of-Prinzip für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), die Proliferation von Luciferase-exprimierenden Brustkrebszellen (MDA-MB-231-Fluc) co-kultiviert mit Knochenfragmente 44 zu überwachen. Hier haben wir für das Studium der Brust Zellkrebs Proliferation, Kolonisierung und Migration im Rahmen der nativen Mikroumgebung mit menschlichen Knochen Gewebeexplantaten Gehende bestehende experimentelle Protokolle.

Zuerst ein Protokoll für Co-Kultivierung Brustkrebszellen neben Knochenfragmenten an Brust messen präsentieren wirZellproliferation mit BLI. In diesem Abschnitt werden die Brustzellsuspensionen Zellflecken in 6-well Platten angrenzend an Knochenfragmente, die durch Stücke von Knochenwachs immobilisiert werden ausgesät. Kontrollvertiefungen enthalten Knochenwachs, aber keine Knochenfragment. Sobald Zellflecken zu befestigen, ist Medium gegeben und die Platte wird für 24 Stunden, nach der Biolumineszenz-Signalintensität (mit Zellzahl assoziiert) mit BLI gemessen kultiviert. Im nächsten Schritt stellen wir Verfahren zur Co-Kultivierung Brustkrebszellen direkt auf Knochenfragmente beimpft, um Ansiedlung und Vermehrung zu studieren. Hier werden die Brustzellsuspensionen werden direkt auf die Knochengewebefragmenten, die in Kultur durch BLI und Fluoreszenzmikroskopie über die Zeit überwacht werden, um Kolonisation und Zellzahl verfolgen pipettiert. In diesem Verfahren wird der Markraum kann von den Knochenfragmenten zu jedem Zeitpunkt für die Analyse von kolonisierten Brustkrebszellen durch Durchflusszytometrie gespült werden oder Mark-Lebensfähigkeitstests.

Darüber hinaus haben wir deSchreiber zwei verschiedene Ansätze zur Messung von Brustkrebszellmigration. Im ersten Verfahren wird zur Messung der Migration in Richtung Knochengewebekulturüberständen Schritten beschrieben. In diesem Protokoll die Brustkrebszellen ausgesät werden, auf die inneren, oberen Flächen der Transwell einfügen Membranen mit einer 8 um Porengröße (wie in 1A gezeigt). Die Einsätze werden dann in einer Aufnahmeplatte mit Vertiefungen, die Knochengewebe Überstand oder Kontrollmedium platziert. Im Laufe von 20 Stunden Inkubationszeit eine kleine Anzahl von Brustkrebszellen wandern durch den Einsatz Membranen in die unteren Gewebekulturvertiefungen, wo sie für den Nachweis durch BLI befestigen. In der zweiten Migrations-Verfahren die Brustkrebszellen werden auf die untere Außenflächen Transwell-Einsatz Membranen ausgesät. Knochengewebefragmente werden in die Einsatzschalen gelegt und die Brustkrebszellen wandern nach oben durch die Membranen an den Knochenfragmenten zu kolonisieren (wie in 1B dargestellt), diewerden dann aufgenommen mit BLI.

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Protokoll

Kugelköpfe wurden von Patienten nach elektiven THR Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Alle Gewebe wurden als de-identifizierte Proben in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Stanford University Research Compliance Office gesammelt.

1. Auswählen einer Brustkrebszelllinie (n)

  1. Erhalten oder Transfektion die gewünschte Brustkrebszelllinie (n) mit einem Luciferase-GFP-Reporterkonstrukt. Die folgenden Versuche wurden durch Transfektion mit dem Transposon Sleeping Beauty Plasmid PKT2 / Lubig unter Verwendung der MDA-MB-231 und MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien für die stabile Expression von Firefly Luziferase entwickelt (Fluc) und enhanced green fluorescent protein (EGFP) und die Transposase Plasmid pK / hUbiC-SB11 45,46.
    HINWEIS: Die transfizierten Zelllinien werden als MDA-MB-231-FluC-EGFP und MCF-7-FluC-EGFP bezeichnet.

2. Isolieren Tissue Fragments von Hüftköpfe

  1. Nach THR Chirurgie, sammeln die verworfen Hüftkopf in einem sterilen Behälter mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Die Probe wird im Labor und verarbeiten es in 1-3 Stunden nach der Operation. Hinweis: wenn es eine Verzögerung in der Verarbeitung, Man gibt die Probe bei 4 ° C.
  2. Bereiten Sie einen Arbeitsbereich, indem Sie die folgenden Elemente auf einem saugfähigen Matte in einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube: sterile Handschuhe, chirurgische Zange, Zangen, Becherglas mit 70% igem Isopropanol, Instrumente und Gewebekulturgefäße gründlich wie unten für jede Art von Experiment festgelegt .
  3. Das Tragen eines sterilen OP-Handschuh, um die Runde Femurkopf in einer Hand zu halten, verwenden Sie die Zange in der anderen Hand, um Trabekelknochen Fragmente gewünschter Größe (~ 2-5 mm) von der freiliegenden oberen Welle des Oberschenkelknochens zu extrahieren. Übertragen Knochenfragmente in das Kulturgefäß (beispielsweise 6, 12 oder 24-Well-Gewebekulturplatte oder Migration Kammer), abhängig von der Art der Proliferation, colonization oder Migration Experiment wie in den Schritten 3, 4 oder 5 beschrieben.
    HINWEIS: Knochengewebefragmenten sollte wie oben, nachdem Sie die ersten Schritte für jede spezifische Proliferation, Kolonisierung oder Migrationsassay beschrieben geerntet werden. Fragmente in einem Größenbereich, wie in Abbildung 2 dargestellt. Fragmente können vor oder nach Versuchen zum Zwecke der Standardisierung abzuwägen.

3. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen Angrenzend an Knochenfragmente zu Brustzellproliferation messen Mit BLI

  1. Vor dem Experiment Eine Suspension, die 2 x 10 5 Brustkrebszellen / 50 ul, und bereiten Stopfen aus Knochenwachs zur Immobilisierung von Knochenfragmenten in Kultur. Schneiden Sie ein P200 Mikropipettenspitze in 3 Teile, verwenden Sie das schmale Ende der größte Stück in einem "Cookie-Cutter" Art und Weise, um kleine (~ 35 mg) Knochenstücke Wachs geschnitten. Verwenden Sie das breite Ende der kleinste Stück, um die Knochenwachs Stecker in eine Petrischale ausgeworfenfür die Lagerung.
  2. Legen Sie ein Stück Knochenwachs auf der 12-Uhr-Position jeder Vertiefung und drücken Sie leicht mit einem sterilen Handschuhen Zeigefinger.
  3. Je 50 ul der Zellsuspension mit 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in der Mitte jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. (Alternativ Samenzellen in einem verteilten Muster, falls gewünscht.) Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern.
  4. Zeigen 1 Knochenfragment auf 1 Stück Knochen Wachs für jeden experimentellen gut und sanften Druck mit der Knochenzange, um sie zu sichern. Führen Experimenten in dreifacher Ausfertigung, dass 3 Knochenfragmente von einem bestimmten THR Probe werden in den ersten drei Vertiefungen gegeben, während die unteren drei Brunnen enthalten Knochenwachs nur als Kontrolle.
  5. Unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam zu liefern 5 ml DMEM-10% FBS zu der Seite jeder Vertiefung zu vermeiden Verdrängen der Brustzellen oder Knochenfragmenten. Die Platte wird in eine 3776; C Gewebekultur-Inkubator für 20-24 Std.
  6. Um Biolumineszenz-Bildgebung durchzuführen (BLI) entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Luciferinsubstrat (um eine Konzentration von 300 ug / ml zu erreichen) in jede Vertiefung. Bild die Platte sofort in einem IVIS Imaging Platform mit den folgenden Parametern: Blende von 1, kleine Binning, Belichtungszeit von 1 Sekunde, Ebene D. Messen Sie die Signalintensität der einzelnen sowie durchschnittliche Strahldichte (Photonen / Sekunde / Quadratzentimeter / Steradiant).
  7. Verwenden Sie Imaging-Software zu definieren, Regions of Interest (ROI), die durchschnittliche Strahlung für alle experimentellen und Kontrollvertiefungen zu quantifizieren. Export durchschnittliche Strahlungswerte in ein Excel-Blatt, Statistiken führen und Grafiken erstellen.

4. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen direkt Gesetzte Auf Knochenfragmente zur Kolonisation und Cell Number Studieren

  1. Verwenden einer Pinzette, um Knochenfragmente direkt in die leeren Wells einer 24-Well-Gewebekulturplatte (1 Fragment / Vertiefung) zu platzieren.
  2. Pipette 50 ul Zellsuspension Tröpfchen aus DMEM-10% FBS mit 1 X 3-6 Oktober Brustkrebszellen direkt aufeinander Knochenfragment. Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. Hinzuzufügen sanft 1-2 ml DMEM-10% FBS in die Seite jeder Vertiefung, so daß das Fragment wird vollständig in einem Medium eingetaucht ist. Inkubieren der Platte in einem 37 ° C Brutschrank für 20-24 Std.
  3. Nach der Inkubation verwenden Pinzette jedes Knochengewebefragment in ein frisches 24-Well-Platte mit 1 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung zu übertragen. Um BLI durchzuführen, führen Sie die Schritte 3,6-3,7 oben. Zusätzlich können Fragmente mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, oder gespült, um den Markpopulation für Analysen der Brustkrebs-Zellzahlen und den Eigenschaften wie in Schritt 6 beschrieben, erhalten.
  4. Um die intakten Fragmente zur qualitativen Bewertung durch Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet folgenden BLI, Pipette 5 ul von fluoreszierenden Bisphosphonat Markierungslösung (preVergleich nach den Anweisungen des Herstellers) in jede Vertiefung, um die mineralisierte spicules der Knochenfragmente zu markieren. Die Platte in der Gewebekultur-Inkubator für weitere 24 Stunden.
  5. Nach 24 Stunden der Kultur in der Leuchtstoff Bisphosphonat Etikettierungslösung Verwenden einer Pinzette, um die Fragmente zu Gewebekulturplatten mit Phenolrot-freiem Medium und Ausblick mit einem Fluoreszenzmikroskop für Bild GFP (485 nm) und Bisphosphonat-Etikett (680 nm) konfiguriert übertragen.

5. Mess Migration von Brustkrebszellen zu Knochengewebe Fragmente und kultivierten Knochenfragment Stände

  1. Migration in Richtung Knochengewebekulturüberstand.
    HINWEIS: Führen Experimenten in dreifacher Ausführung, so daß 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe verwendet werden, um 3-Überstände zu erzeugen. Für jedes Experiment wird die Migration auf drei Vertiefungen, die Knochenüberständen gegen drei Brunnen, die nur Steuermedium verglichen.
    1. Geneknochen tisklagen Ständen indem Knochenfragmente in die Wells einer 12-Well-Platte mit 2,2 ml DMEM-10% FBS pro Mulde. Kultur in einem 37 ° C Brutschrank für 24 Stunden. Ziehen Sie das Medium nach 24 Stunden und ersetzen mit 2,2 ml frischem DMEM-10% FBS. Treat Kontrollvertiefungen enthaltenden DMEM-10% FBS in der gleichen Weise.
      HINWEIS: Das Medium wird nach 24 Stunden geändert, um Faktoren als Reaktion auf Gewebetrauma nach einer Operation erfolgen abgesondert zu entfernen. Weil Knochengewebe Überstände werden in generierten FBS enthaltenden Medium, Vertiefungen, die FBS enthaltenden Medium nur enthalten, um für die Beiträge der FBS, um Brustkrebs-Zellmigration steuern.
    2. Nach 48 Stunden, sammeln 0,9 ml jedes Überstands / Steuermedium und Pipette in die Vertiefungen einer Aufnahmeplatte. Die Einsätze werden später in diese Vertiefungen gelegt werden. Inkubieren Sie die Aufnahmeplatte in der Gewebekultur-Inkubator während der Aussaat der Einsätze. Hinweis: Der verbleibende Überstand (~ 1 ml nach dem Eindampfen) können für die Analyse von Sekretom facto gesammeltrs auf Wunsch 44.
    3. Um die Transwell-Einsätze Saatgut, legen Sie sie in ein Standard, leere 24-Well-Gewebekulturplatte. Pipette 350 ul Zellsuspension, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS auf das obere, innere Membranoberfläche jedes Einsatzes, wie in 1A gezeigt. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die die gesetzten Einsätze in den 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Befestigung zu fördern.
    4. Sobald die Zellen an den Einsätzen befestigt sind, verwenden Zange, um die Einsätze an der Aufnahmeplatte nach den Anweisungen des Herstellers übertragen. Angle jeder Einsatz, wenn Sie diese in den Receiver auch um eine Blasenbildung zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch Überstand zu verhindern. Inkubieren des Empfängerplatte mit Einlagen für 20 h in einem 37 ° C Brutschrank.
      HINWEIS: Blasen zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch supernatan Überprüfen Sie die Unterseite der Aufnahmeplattet. Sind Blasen sichtbar, entfernen Sie die spezifische Einsätze und legen Sie sie wieder in den Empfänger gut, bis keine Luftblasen vorhanden sind.
    5. Nach 20 h Verwendung einer Pinzette, um die Einsätze von der Aufnahmeplatte zu entfernen. Unter Verwendung der Verfahren in Schritten von 3,6 bis 3,7 durchgeführt BLI für Bild in die Zellen, die in migriert und auf den Boden der Aufnahmeplatte Brunnen angeschlossen haben.
  2. Migration in Richtung Knochengewebefragmenten.
    HINWEIS: Führen Sie Versuche in dreifacher Ausfertigung, dass 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe werden in 3 verschiedene Inserts platziert und 3 Glasperlen werden in 3 verschiedene Einsätze als Kontrollen gelegt.
    1. Bereiten Sie die Aufnahmeplatte durch Pipettieren von 0,9 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung. Legen Sie sie in den Brutschrank, während der Vorbereitung der Einsätze.
    2. Um die Einsätze Saatgut, kehren sie auf der Oberfläche eines Kunststoffmikrozentrifugenröhrchen Box, die einen Deckel hat. Pipettieren Sie 50 ul Zellsuspension Tropfen DMEM-10% FBS, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen direkt auf die äußere, untere Fläche jedes Einsatzes Membran (zugewandte auf der invertierten Einsätze). Bedecken Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Box mit dem Deckel aufgeschlagen und übertragen sie an die 37 ° C-Inkubator Gewebe für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern.
    3. Übertragen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Feld, um die Gewebekultur Kapuze, und verwenden Sie Pinzette, um die gesetzten Einsätze rechten Seite nach oben drehen und sie in die Vertiefungen der Aufnahmeplatte. Pipette 0,450 ml DMEM-10% FBS in jede Einsatzschale. Mit einer Pinzette, übertragen Sie einen Knochengewebe Fragment (ca. 3 mm) in jede vorbereitete Einsatzschale. Optional können Sie mit Glasperlen als negative Kontrollen in weitere Bohrungen. Die Platte wird in einem Gewebekultur-Inkubator für 20 Stunden.
    4. Um die Migration zu messen, bereiten Sie einen Standard-24-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml DMEM-10% FBS pro Vertiefung. Entfernen Sie die Aufnahmeplatte aus dem Inkubator und verwenden Pinzette, um die Knochenfragmente und Perlen aus jeweils in separate Vertiefungen der Standardplatte übertragen einfügen. Luciferin hinzufügenSubstrat in jede Vertiefung (um eine Endkonzentration von 300 ug / ml zu erreichen) und führen BLI unter Verwendung der Verfahren in den Schritten 3,6-3,7.

6. Zusätzliche Pre- und Post-experimentellen Analysen

  1. Analyse gespült Mark.
    1. Übertragen einer Knochenfragment in eine 70 & mgr; m Zellsieb an der Spitze einer konischen 50 ml-Röhrchen gegeben. Verwenden einer 10 ml-Spritze mit einer 25 G Nadel, um kräftig zu spülen das Fragment mit 10 ml PBS, um eine Suspension von Knochenmarkzellen in der konischen Röhre zu erhalten. Zentrifuge wurde die Zellsuspension 3 Minuten bei 300 × g und 21 ° C, saugt den Überstand und Resuspendieren der pelletierten Zellen in PBS oder andere gewünschte Lösung für die Durchflusszytometrie.
      HINWEIS: Resuspension Volumen wird in Abhängigkeit von der Größe der Zellpellet nach der Zentrifugation und der Anwendung variieren.
    2. Für Lebensfähigkeitstests ~ 75-300 ul-Volumina von PBS angemessen sind, und diese Suspensionen können analysiert werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen fluorescence basierend Lebensfähigkeitstests nach den Anweisungen des Herstellers, pipettiert in einen herkömmlichen Hämozytometer und mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop gezählt.
    3. Für die Durchflusszytometrie oder Sortierung basierend auf der Erfassung GFP-positiven Brustkrebszellen, Zellpellet in 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS, 2 mM EDTA und 10 mM HEPES, so dass die Konzentration 1 x 10 6 Zellen / ml.
  2. H & E-Färbung und Immunhistochemie.
    1. Um die Fragmente für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung und / oder Immunhistochemie Dabei legen die Fragmente in Plastikkassetten mit einer Nummer 2 Bleistift markiert, und tauchen in einen Behälter mit 10% gepuffertem Formalin für 24 Stunden aufgefüllt.
    2. Prozess-Gewebe für Paraffineinbettung, Schneiden und Färben Verwendung von Routineprotokollen, die eine Entkalkung Schritt für die mineralisierten Nadeln in jedem Fragment Konto gehören.

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Ergebnisse

Isolieren von Gewebefragmenten aus Hüftköpfe

Kugelköpfe wurden aus einer gleichen Anzahl von männlichen und weiblichen Patienten (44-90 Jahre) nach elektiven Hüft-Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Jedes verworfen Hüftkopf enthält einen kleinen Teil des oberen Oberschenkel, die trabekuläre Knochengewebe des mineralisierten Nadeln und Mark zusammen birgt. Dieses Gewebe ist durch die chirurgisch freiQuerSchnitt der We...

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Diskussion

Mehra et al. Wurden bereits beschrieben die Obduktion Sammlung und Analyse von Knochenproben von metastasierendem Prostatakrebs-Patienten zum Zeitpunkt der Autopsie entnommen und enthüllt hochwertigen Gewebe und Validierung der Verwendung von menschlichen Knochenproben, um die metastatischen Prozess 47 zu studieren. Hier haben wir Protokolle zur Erhebung, Verarbeitung und Nutzung von menschlichen verworfen Femurköpfe folgenden THR Operation in einer kurzfristigen Co-Kultursystem, um Brustzellmigratio...

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Offenlegungen

Es gibt keine Angaben zu berichten.

Danksagungen

Diese Studien wurden finanziert zum Teil durch Zuschüsse aus dem Alternative Forschungs- und Entwicklungsgemeinschaft (107.588), das National Institute of Health (1U54CA136465-04S1) und dem California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Wir danken Drs. Andrew Wilber und R. Scott McIvor für die großzügige Spende ihrer transponson und pK / hUbiC-SB11 Transposase Plasmide. Wir danken John Tamaresis, Ph.D. Rat der statistischen Methoden, Timothy Brown für die Durchführung der Durchflusszytometrie, Georgette Henrich für die Beratung über Migrationen Assays und Nancy Gamba zur Erleichterung der Sammlung von THR Proben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM (1X) + GlutaMAX-lLife Technologies10569-010Ergänzen Sie alle DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)Life Technologies16600-082Ergänzen Sie alle McCoy's mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Pen/Strep
Fetales RinderserumLife Technologies16000-044
Penicillen StreptomycinLife Technologies15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)InvivoGen ant-blErgänzungsmedium für transfizierte Zelllinien.
Falke® Zellkultureinsätze für 24-Well-Platten mit transparenter PET-Membran (8,0 μ m Porengröße)Corning Incorporated353097
Falcon® 24 Well TC-behandelter Polystyrol-Zellkultureinsatz Companion PlateCorning Incorporated353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *für Säugetierzellen*Invitrogen Detection TechnologiesL-3224
FluoroBrite DMEMLife TechnologiesA18967-01
D-Luciferin Glühwürmchen, Kaliumsalz 5 g (30 mg/ml)Life TechnologiesL-8220
Steriles Zellsieb 70 μmu; mFisher Scientific22363548
6-Well-TC-behandelter Zellkultur-ClusterCorning Incorporated3516
12-Well-TC-behandelter Zellkultur-ClusterCorning Incorporated3513
24-Well-TC-behandelter Zellkultur-ClusterCorning Incorporated3526
Friedman-Pearson RongeurFine Science Tools16021-14
KnochenwachsSurgical Specialties Corporation903
IVIS 50 BildgebungsplattformCaliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software-Programm Caliper Life Sciences/PerkinElmer133026
EVOS FL Imaging SystemLife TechnologiesVersion 4.2
OsteoSense 680 EXPerkinElmerNEV10020EX
MCF-7 BrustkrebszellenATCCHTB-22
MDA-MB-231 BrustkrebszellenATCCHTB-26
Monoklonales Maus-Anti-Human-Cytokeratin AntikörperDAKO CytomationClone (AE1/AE3)

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