Methodenartikel

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

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DOI:

10.3791/52685

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17. April 2015

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Auswahl der Gelgröße zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten für die Next-Generation-Sequenzierung. Die Ranger-Technologie ermöglicht die vollständige Automatisierung des gesamten Prozesses der Beladung des Agarosegels, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von DNA-Zielfragmenten und ermöglicht so einen hohen Durchsatz und eine hohe Qualität der Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.

Zusammenfassung

Die Sequenzierung von Umweltproben der nächsten Generation kann aufgrund der unterschiedlichen DNA-Quantität und -Qualität in diesen Proben eine Herausforderung darstellen. Für optimale Ergebnisse aus dem Next-Generation-Sequencing werden hochwertige DNA-Bibliotheken benötigt. Umweltproben wie Wasser können eine geringe Qualität und Menge an DNA sowie Verunreinigungen aufweisen, die mit der DNA mitausfallen. Die mechanischen und enzymatischen Prozesse, die bei der Extraktion und der Bibliotheksvorbereitung beteiligt sind, können die DNA weiter schädigen. Die Auswahl der Gelgröße ermöglicht die Aufreinigung und Rückgewinnung von DNA-Fragmenten einer definierten Größe für Sequenzierungsanwendungen. Nichtsdestotrotz ist diese Aufgabe einer der zeitaufwändigsten Schritte im Arbeitsablauf bei der Vorbereitung von DNA-Bibliotheken. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die vollständige Automatisierung der Agarosegelladung, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von gezielten DNA-Fragmenten.

In dieser Studie beschreiben wir einen Hochdurchsatz-Ansatz zur Herstellung hochwertiger DNA-Bibliotheken aus Süßwasserproben, die auch auf andere Umweltproben angewendet werden können. Wir verwendeten einen indirekten Ansatz, um Bakterienzellen aus Süßwasserproben aus der Umwelt zu konzentrieren. Die DNA wurde mit einem kommerziell erhältlichen DNA-Extraktionskit extrahiert, und die DNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung eines kommerziellen Transposon-basierten Protokolls hergestellt. DNA-Fragmente von 500 bis 800 bp wurden mit Hilfe der Ranger-Technologie, einer automatisierten Elektrophorese-Workstation, in der Gelgröße ausgewählt. Die Sequenzierung der größenselektierten DNA-Bibliotheken zeigte signifikante Verbesserungen der Leselänge und der Qualität der Sequenzierlesevorgänge.

Einleitung

Metagenomik beinhaltet die Sequenzierung des gesamten genetischen Materials in einer Probe, um die vorhandenen mikrobiellen Gemeinschaften zu charakterisieren. Es handelt sich um einen komplexen und teuren Prozess, bei dem extrahierte Nukleinsäuren in DNA-Bibliotheken umgewandelt und anschließend eine Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt wird. Qualitativ hochwertige Bibliotheken sind für eine maximale Datenausgabe und eine genaue Metagenomik-Analyse unerlässlich. Umweltproben, wie z. B. Wasserproben, stellen aufgrund geringer DNA-Mengen, die auch1-3 abgebaut werden können, und des Vorhandenseins von Inhibitoren der PCR4-6 oft eine große Herausforderung für die Erstellung hochwertiger Bibliotheken dar.

Qualitativ hochwertige Bibliotheken bestehen idealerweise aus längeren DNA-Segmenten innerhalb eines engen Längenbereichs. Um die Menge an nützlichen Daten, die pro Sequenzierungslauf erzeugt werden, zu maximieren, sollte die Länge der DNA in der Bibliothek mindestens so lang sein wie die maximale Leselänge der verwendeten Sequenzierungsmethode. Bei der Verwendung einer Sequenzierungstechnologie durch Synthese wie der Illumina MiSeq beeinflusst die Größe der DNA-Fragmente die Effizienz, mit der Cluster auf der Durchflusszelle erzeugt werden. Wenn eine Bibliothek beispielsweise sowohl kürzere als auch längere DNA-Fragmente enthält, sind die kürzeren in den Sequenzierungsdaten überrepräsentiert7,8. Im Gegensatz dazu wird eine Bibliothek mit ähnlich großen DNA-Fragmenten proportional in den Sequenzierungsdaten repräsentiert. Viele Bibliotheksvorbereitungskits verwenden ligationsbasierte Methoden, um den DNA-Fragmenten Adapter hinzuzufügen, und eine Größenauswahl ist erforderlich, um Adapterdimere zu entfernen, die kein Insertenthalten 9,10. Es gibt zahlreiche Methoden11,12, um dies zu erreichen, aber die eine Technik, die die konsistentesten Ergebnisse liefert, ist die elektrophoretische Trennung der DNA, gefolgt von der Wiederherstellung der gewünschten DNA-Längen13,14. Dieser Prozess kann für eine kleine Anzahl von Proben manuell durchgeführt werden, aber wenn es um die Verarbeitung von Hunderten von Proben geht, sind automatisierte Lösungen erforderlich. Die derzeit verfügbaren Plattformen für die automatisierte Auswahl der Gelgröße weisen einen geringen Durchsatz auf und es werden neue Plattformen benötigt, um eine große Anzahl von Proben für die Sequenzierung zu verarbeiten. Die Ranger-Technologie kann in bestehende Liquid-Handling-Workstations integriert werden, um den Einsatz der Agarose-Gelelektrophorese für die Größenauswahl und analytische Zwecke in einem Maßstab zu ermöglichen, der der heutigen Hochdurchsatzumgebung gerecht wird.

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Protokoll

1. Wassersammlung und Filtration

  1. Sammeln Süßwasserproben von verschiedenen Standorten (Abbildung 1). Geben Proben durch eine Reihe von Filtern: 1 & mgr; m-Filter, 0,2 & mgr; m-Filter und 30 kDa cutoff Tangentialstromfilter systematisch separaten eukaryotische, bakterielle und virale große Partikel auf.
    Hinweis: Nur der Reinigung und Analyse des Materials an der 0,2 & mgr; m-Filter (frei lebenden Bakterien) gewonnen wird in diesem Bericht beschrieben, jedoch ähnlichen Ansätzen kann für die anderen Partikel vom Filter gewonnen werden.

2. Bakterien Konzentration, DNA-Extraktion und Reinigung

  1. Entfernen Sie die 0,2 um-Membranfilter (s) von der Wasser-Filtersystem (schematische Darstellung, Figur 2). Falten Sie die 0,2 um Scheibenfilter in der Mitte und legen Sie es in einen 50-ml-Röhrchen mit der offenen Seite nach oben. 5 ml 1x phosphatgepufferter Lösung (PBS) und 0,01% Tween, pH 7,4, indas Rohr. Wenn mehr als ein Filter während des Verfahrens verwendet verwenden eine andere Röhre pro Filter. Öffnungsrohr (e) mit Filter bei 4 ° C bis zur Verarbeitung. Andernfalls fahren Sie mit Schritt 2.2.
  2. Entfernen Sie den 0,2 um-Membranfilter aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Platz-Filter (n) auf eine Petrischale (lassen Sie die PBS-Puffer in der Röhre).
    1. Mit einer sterilen Pinzette und einer sterilen Schere, schneiden Sie den Filter in kleine Streifen (1 cm x 1 cm). Desinfizieren Pinzette und Schere durch Einweichen in 70% Isopropanol, Abwischen mit einem DNA-Dekontaminations Oberfläche und Spülen mit Reinstwasser vom Typ 1 zwischen verschiedenen Proben.
  3. Setzen Sie den Filter in Streifen geschnitten wieder in den gleichen 50-ml-Tube. 10 ml 1x PBS und 0,01% Tween, pH 7,4 zu den Filtern gibt es insgesamt 15 ml Puffer in 50-ml-Röhrchen.
  4. In 6 Reinwolframkügelchen (Durchmesser 3 mm) in jede 50 ml Tube, decken Sie die Röhrchen mit Parafilm und Vortex kräftig 20 min (zu verwenden 50-ml-Röhrchen Vortex-Adapter). Wenn multiple Filter werden von einer Probe, die Weitergabe und Pool alle Homogenat in ein sauberes 50-ml-Tube verarbeitet. Zentrifugiere die Röhrchen bei 3.300 xg für 15 min bei 4 ° C.
  5. Das Pellet und aliquoten Bakterienzellen (~ 1 ml Aliquots) in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Beachten Sie, dass es 5 Mikrozentrifugenröhrchen pro Probe.
  6. Spin down die Reaktionsgefäße bei 10.000 × g für 10 Minuten, und entfernen Sie die meisten der Überstand bis auf ~ 200 & mgr; l-Marke.
  7. Lagern Sie die Proben bei -80 ° C, oder fahren bakterielle DNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen DNA-Isolierungskits nach den Angaben des Herstellers extrahiert. Während bakterielle DNA-Extraktion verwenden entweder PBS oder Wasser als negative Extraktionskontrolle und E. coli als positive Extraktionskontrolle.
  8. Da DNA aus mehreren Rohren extrahiert werden, bündeln parallel Unterteilmengen aus der gleichen Probe in ein 2-ml-Tube. Diese führen eine O / N Niederschlag unter Verwendung einer Lösung von 0,1 umfassteVolumen von 3 M Natriumacetat, 2 Volumina 100% Ethanol und 5 & mgr; l von 5 & mgr; g / & mgr; l lineares Acrylamid. Gut mischen und Proben bei -80 ° C.
  9. Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit (17,000 · g) für 30 min bei 4 ° C. Waschen Pellet mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol, der Luft trocknen in einer Biosicherheitswerkbank für nicht mehr als 5 Minuten und resuspendieren DNA-Pellet in 34 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
    Hinweis: Linear Acrylamid wird dazu beitragen, DNA-Pellet nach der O / N Niederschlag zu visualisieren.
  10. Bestimmen DNA Menge und Qualität mit einer hohen Empfindlichkeit fluoreszierender Nukleinsäure Quantifizierung Assay und eine Mikrovolumen Spektralphotometer jeweils folgenden Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Wenn mehrere Proben werden zum Zeitpunkt hergestellt wird, kann eine hochempfindliche fluoreszierende Nukleinsäurefärbemittel Assay zur Quantifizierung dsDNA und plattenbasierte Fluorometer / Spektrophotometer stattdessen verwendet werden.

3. DNA-Bibliothek Vorbereitung

  1. Normalisieren genomischen von Wasserproben auf eine Konzentration von ~ 0,2 ng / & mgr; l Bakterien-DNA extrahiert.
  2. Enzymatisch Fragment ein Nanogramm von bakterieller DNA mit einem Transposon-beruhenden Methode (tagmentation). Fügen Sie Adapter und Indexfolgen auf fragmentierte DNA nach den Anweisungen des Herstellers. Gegenstand tagmented Proben zu 12 PCR-Zyklen, wie in den Anweisungen des Herstellers, an welchem ​​Punkt die Sequenzierungs Indizes eingeschlossen angegeben.

4. Automatisierte Gel Größenauswahl

  1. Überspringen Standard Post-PCR-Clean-up-Schritt in den Anweisungen des Herstellers beschrieben (siehe Tabelle der Materialien). Größe wählen Post-PCR-Proben direkt mit Hilfe eines automatisierten Gel-Basis Größenauswahl Plattform.
    1. Hinzufügen 3,5 ul Beladungspuffer zu jeder Probe.
    2. Nach dem Protokoll des Herstellers, laden Sie die Proben auf die Elektrophorese-Workstation, die Angabe eines Größenselektionsziel von 500 bis 800 bp, in einem 300 ul ExtraktIonenvolumen unter Verwendung eines vorgegossenen 1,5% Agarose-Kassette.
    3. Konzentriere das rohe Ausgangsmaterial (300 ul) auf 25 & mgr; l über Ethanolfällung.
      Hinweis: Alternativ können Sie die Elektrophorese Workstation an Konzentration für eine größere Anzahl von Proben über Filterplatte und Vakuumkammer zu automatisieren.
      1. Ausfällung des rohen Elutionsvolumen unter Verwendung von 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat, 2 Volumina 100% Ethanol und 5 & mgr; l von 5 & mgr; g / & mgr; l linear Acrylamid. Gut mischen, Ort Proben bei -80 ° CO / N. Zentrifuge Proben bei 17.000 xg für 30 min.
      2. Verwerfen Überständen und fahren Sie mit DNA-Pellet mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol waschen.
      3. Zentrifuge Proben wieder bei 17.000 × g für 30 min, die Überstände verworfen, an der Luft trocknen, und schließlich zu resuspendieren DNA Pellet in 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
  2. (Optional) Verwenden Sie 1 ul DNA-Bibliotheken Größe mit dem automatisierten Gelgröße Auswahl Plattform ausgewählt, um einen fünf machenfache Verdünnung mit Tris-EDTA-Pufferlösung, pH-Wert 8,0. Analysieren Bibliotheken unter Verwendung einer Chip-basierte Kapillarelektrophorese Instrument dsDNA Qualität entsprechend den Anweisungen des Herstellers analysiert.

5. Bibliothek Normalisierung und Sequencing

  1. Fahren Sie mit Proben mit Bibliothek Normalisierung Perlen (in der Transposon-basierte Bibliothek Vorbereitung Kit im Lieferumfang enthalten), wie in den Hersteller Vorbereitung Guide beschrieben zu normalisieren.
    1. Alternativ Maßnahme dsDNA-Bibliotheken mit einer hohen Empfindlichkeit fluoreszierender Nukleinsäurequantifizierungsassay, gefolgt durch die Bündelung in äquimolaren Verhältnissen, um eine endgültige dsDNA Konzentration von 2 nM erreichen. Fahren Sie mit Bibliotheken mit 10 ul der gepoolten Bibliotheken und 10 ul 0,2 N NaOH denaturiert, Inkubation für 5 min bei RT. Denaturierter Bibliotheken unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (mit der Transposon-basierte Zubereitung Satz enthalten) in einem Endvolumen von 1 ml und die Konzentration von 23.05.
  2. Lastprobes in einer der nächsten Generation Sequenzierungsplattform durch folgende Standardsequenzierungsprotokolle des Herstellers.

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Ergebnisse

DNA-Konzentration, and Quality Assessment

Bakterielle DNA-Konzentrationen reichten von 0,01 bis 0,11 ng ​​/ ml pro Wasserprobe der verschiedenen Einzugsstellen (Tabelle 1). DNA aus Bakterien-Fraktion isoliert hatte eine 260/280 und A-260/230-Verhältnisse von 1,4 bis 1,8 und 0,3 bis 1,6 auf. Während einige der A 260/230 Verhältnisse waren relativ niedrig war, wurde keine offensichtliche Hemmung in der hergestellten Bibliothek ...

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Diskussion

Die Anwesenheit von Adapter Dimere und Clusterbildung von kleinen Plattengrößen bevorzugt in aktuellen Plattformen sequenziert stellen eine Abnahme der nutzbaren Ertrag und Unterauslastung der Kapazität 15 der Geräte. Die Verwendung von Wulst zu schlagen Methoden kombiniert mit einer Transposon-basierten Ansatz, um Bibliotheken vorbereiten kann in mehrere DNA-Scherung führen im Vergleich zu anderen Methoden der Extraktion 4,5. Trotzdem werden alle Methoden der Extraktion und Bibliotheks Herstellung...

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Offenlegungen

Jared R. Slobodan und Matthew J. Nesbitt beide halten Aktien der Küsten Genomics, ein in Privatbesitz British Columbia Corporation bietet die Ranger Technologie.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Genome BC, Genome Canada und Coastal Genomics finanziert. Die Autoren danken Kirby Cronin und Michael Chan für ihre Hilfe bei der Probenentnahme und -verarbeitung. Wir möchten uns auch bei Thea Van Rossum und Dr. Fiona Brinkman für die Unterstützung bei der Bioinformatik bedanken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Schlauchpumpe Masterflex P/S Serie 1400Thermo Scientific 1400-1620
0,2 &Mikro; m Supor MembraneVWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Wolframkarbid-Kügelchen 3 mm (200)Qiagen69997
Isopropylalkohol 70%Jedmon Products825751Healthcare Plus
DNA awayVWR7010Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q WasseraufbereitungssystemFisher ScientificZMQS6VF0YMerck Millipore. Dieses System wurde eingestellt.
20x PBS pH 7,5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher Chemikalien
Vortex-Adapter für 2 (50  ml) RöhrenVWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (Modell G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
Beckman CentrifugeRaeyco Lab Equipment Systems Management LtdModell J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA-IsolationskitVWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Adapter für 24 (1,5-2 ml) RöhrchenVWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 ZentrifugeBeckman Coulter367160
Nimbus Select-Arbeitsplatz mit Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01Enthält die Liquid-Handling-Workstation und den integrierten Ranger Tech (Elektrophorese-Hardware)
Ranger-ReagenzienkitCoastal GenomicsCG-10600-150-12-21Enthält Ladepuffer und Kassetten
Ethylalkohol (wasserfrei)Kommerzielle AlkoholeP016EAANGreenfield-Ethanol
NatriumacetatSigma-AldrichS2889-250G
Lineares Acrylamid (5  mg/ml)Life TechnologiesAM9520Ambion
Eppendorf KühlzentrifugeRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Puffer EB (250 ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 SpektralphotometerThermo ScientificND-1000
Qubit FluorometerLife TechnologiesQ32857Invitrogen. Dieses Produkt wurde eingestellt.
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854Invitrogen
Hochempfindliches DNA-ReagenzAgilent Technologies5067-4626
Hochempfindliche DNA-ChipsAgilent Technologies5067-4626
Agilent 2011 BioanalysatorAgilent TechnologiesG2938B
Nextera XT DNA-ProbenvorbereitungskitIlluminaFC-131-1024
Nextera XT IndexKit IlluminaFC-131-1001
MiSeq Reagenzienkit v2 (500 Zyklen)IlluminaMS-102-2003
Miseq SystemIlluminaSY-410-1003

Referenzen

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Schlagwörter

DNA BibliothekserstellungRanger TechnologieElektrophorese Arbeitsstationbakterielle DNA ExtraktionGr enselektion 500 800 bpHochdurchsatzverarbeitungAnalyse mikrobieller Gemeinschaften

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