Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine sehr einfache Möglichkeit, Neutrophil Extracellular Traps (NETs) aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu isolieren. Dann zeigt, wie die isolierten Netze können in einem in vitro-Adhäsionstest mit Krebszellen verwendet werden.
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Methodenartikel
Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind vor kurzem im Rahmen der antimikrobiellen Rüstzeug der Neutrophilen zu hinterlassen. Neben ihrer Rolle bei der Bekämpfung von Infektionen haben jüngere Untersuchungen gezeigt, dass sie in vielen anderen Krankheitsprozessen, einschließlich Tumorprogression beteiligt sind. Isolieren von gereinigtem NETs ist ein wesentliches Element, um das Studium dieser Funktionen zu ermöglichen.
In diesem Video zeigen wir, ein vereinfachtes Verfahren zur zellfreien NET Isolierung aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien. Isolierte NETs kann dann für die Immunfluoreszenzfärbung Blotting oder verschiedenen funktionellen Assays verwendet werden. Dies ermöglicht eine Bewertung ihrer biologischen Eigenschaften in Abwesenheit des potenziellen confounding Wirkungen Neutrophile selbst.
Ein Dichtegradient-Trenntechnik verwendet wird, um Neutrophile von gesunden Spender Vollblut zu isolieren. Isolierte Neutrophile werden dann von Phorbol-12-myr stimuliertistate 13-Acetat (PMA) zu NETosis induzieren. Aktivierten Neutrophilen werden dann verworfen, und eine zellfreie NET Lager erhalten wird.
Dann zeigt, wie isolierte Netze können in einem Adhäsionstest mit menschlichen A549-Lungenkrebszellen verwendet werden. Die NET-Aktie zur Beschichtung die Vertiefungen einer 96-Well-Zellkulturplatte O / N, und nach Gewährleistung eines angemessenen NET Monoschichtbildung auf dem Boden der Vertiefungen, beschriftet CFSE A549-Zellen zugegeben. Adhärente Zellen werden quantifiziert unter Verwendung eines Nikon TE300 Fluoreszenzmikroskop. In einigen Brunnen, wird 1000U DNAse1 10 Minuten vor dem Zählen zu NETs abbauen hinzugefügt
Einleitung
Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind neu entdeckte Neutrophilen stammenden Elemente der Stränge der extrazelluläre DNA von Hunderten von Proteinen und Histone dekoriert zusammen. Sie werden von Neutrophilen im Rahmen von Infektionen und Entzündungen folgende spezifische Reize sezerniert und Erstverbuchung galt, einen Teil der neutrophilen Abwehrmechanismen gegen Infektionen. Sie wurden erstmals gezeigt, dass das Einfangen von verschiedenen mikrobiellen Eindringlinge wie Bakterien, Viren und Pilze 1-3 fördern. Überfüllung der Mikrobe würde dann führen zu seiner Zerstörung sowohl direkt durch NET-assoziierten Proteinen 3,4 und indirekt über ....
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Protokoll
HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den lokalen institutionellen ethischen Richtlinien durchgeführt.
1. Blut Zeichnung
- Durch Ellen venipucture, sammeln 14 Röhrchen Blut von einem gesunden Freiwilligen in grüne Spitze (Heparin) Röhrchen und Invertzucker jedes Rohr, bevor sie sich auf dem Eis. Sammeln Blut innerhalb von 10 bis 15 min von Experiment, um eine optimale Neutrophilen Ausbeute zu gewährleisten.
2. Neutrophile Isolierung aus Vollblut
- Waschen Sie jedes grüne Spitze Blutröhrchen mit 5 ml PBS ohne Ca und Mg, um das Blut zu verdünnen. In jeder der 4 x 50 ml k....
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Ergebnisse
Erfolgreiches Erreichen eines statischen Adhäsionsassay mit Netzen erfordert eine adäquate Beschichtung der Vertiefungen mit einer Monoschicht von NETs vor der Zugabe von Krebszellen (Abbildung 1). Alle weiteren Schritte müssen mit Vorsicht durchgeführt, um diese Schicht nicht stören werden. Wenn eine ausreichende Schicht NETs gebildet ist, wird erwartet, dass signifikante Krebszellen Haftung an NETs, wie in 2A und 2C gesehen zu werden. Dieser Effekt wird durch die Zu.......
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Diskussion
Das Neutrophil Extracellular-Falle Isolierungsprotokoll in diesem Video gezeigt, kombiniert verschiedene Techniken, die in der Literatur für neutrophile Isolation und NET Bildung verwendet. Es vereinfacht eine ziemlich komplexe und variable Prozess und bietet eine sehr zuverlässige und reproduzierbare Weise gereinigt zellfreien NETs mit weniger Schritte als andere Protokolle zu isolieren. Außerdem werden leicht erhältliche Reagenzien Zugabe verwendet, um die Protokolle der Einfachheit und die Kosten deutlich reduziert w.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Danksagungen
Die Autoren möchten Dr. Paul Kubes für seine Anleitung und Betreuung danken, die bei der Erstellung dieser Arbeit von zentraler Bedeutung waren.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphozytentrennmedium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextranhydrochlorid (Pulver) | Spectrum | DE130 | 6%ige Dextranlösung wird durch Supplementierung von PBS mit Ca und Mg mit 6% Dextranpulver |
| RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin | Wisent | hergestellt350-000-CL | 3%ige RPMI-Lösung wird durch Supplementierung von RPMI mit 3 % fötalem Rinderserum |
| BD Pharm Lyse Lysing-Puffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol, 12-Myristat, 13-acetat (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| Wisent | 319-075-CL | ||
| fötales Rinderserum (FBS) | hergestelltWisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integride Gewebekulturschale mit 20 mm Raster (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
Referenzen
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
