Method Article

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

DOI:

10.3791/52691

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May 1st, 2015

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1Murdoch Childrens Research Institute, The Royal Children’s Hospital, 2Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 3Department of Anatomy and Developmental Biology, Faculty of Medicine, Nursing and Health Sciences, Monash University, Clayton

In This Article

Summary

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Das Ziel des Protokolls ist es, lymphatische Endothelzellen menschlicher Lymphmissbildung zystenartige Gefäße und Vorhaut mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Anschließende Zellkultur und Expansion dieser Zellen ermöglicht eine neue Stufe der experimentellen Raffinesse für genetische, Proteomik, funktionale und Zelldifferenzierung Studien.

Abstract

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Lymphsystems, wie primäre Lymphödem, lymphatischen Missbildungen und lymphatischen Tumoren sind seltene Erkrankungen, die einer erheblichen Morbidität verursachen, aber wenig über ihre Biologie bekannt. Isolierung hochreiner menschlichen lymphatischen Endothelzellen (LECs) von kranken und gesunden Gewebe wäre Studien des lymphatischen Endothels bei genetischen, molekularen und zellulären Ebene zu erleichtern. Es wird erwartet, dass diese Untersuchungen können Ziele für neue Therapien, die die klinische Behandlung von diesen Bedingungen ändern können offenbaren. Ein Protokoll, die Isolierung von humanen Vorhaut LECs und Lymphmissbildung lymphatischen Endothelzellen (LM LECs) beschreibt, wird vorgestellt. Zu erhalten, eine Einzelzellsuspension Gewebe wurde zerkleinert und mit Dispase II und Collagenase II enzymatisch behandelt. Die resultierenden Einzelzellsuspension wurde dann mit Antikörpern gegen Cluster of Differentiation (CD) Marker CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) und podoplanin markiert. StaiNed lebensfähige Zellen wurden auf einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) sortiert werden, um das CD34-CD31 Low Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LM LEC Population aus anderen endothelialen und nicht-endothelialen Zellen abzutrennen. Die sortierten LM LECs wurden kultiviert und auf Fibronektin-beschichteten Kolben für weitere experimentelle Nutzung erweitert.

Introduction

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Eine Hauptfunktion des lymphatischen Gefäßsystems ist es, Lymphe, einen Überschuß der interstitiellen Flüssigkeit enthaltenden Lipide, Proteine ​​und Zellbestandteile aufnehmen und führen es in die Blutvenensystem. Ein Netzwerk von lymphatischen Kapillaren lenkt Lymphe zu den Lymphknoten, wo sie auf das Vorhandensein von fremden Antigenen, ein wichtiger Prozess bei der Immunüberwachung und Bereitstellung von weißen Blutkörperchen auf fremde Antigene zu neutralisieren gescreent.

Die unidirektionale Lymphsystem beginnt in Geweben mit dem anfänglichen lymphatischen Kapillaren, eine einzigartige Struktur mit einer diskontinuierlichen Einzelsc....

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Protocol

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Ethics Statement: Ethische Genehmigung für die Sammlung von Lymphmissbildung und Vorhaut Geweben wurde von den Human Research Ethik-Kommissionen in der Royal-Kinderklinik, Melbourne, Australien erhalten. Unterzeichnet Zustimmung wurde von Patienten Eltern erhielten vor der Operation. Gewebeproben wurden von Patienten mit LMs zogen chirurgischen Verfahren als Teil ihrer klinischen Management und elektiven Beschneidung diagnostiziert gesammelt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Health und Medical Research Council, Australien durchgeführt.

1. Herstellung der Zellsuspension aus Vorhaut und Lymphmissbild....

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Results

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Nach der anfänglichen Gewebe Verdauung, nach 24 Stunden in Kultur von unfraktionierten Proben deutliche endothelialen Zellkolonien zusammen mit Fibroblasten-ähnliche Zellen und glatten Muskelzellen beobachtet werden (Abbildung 2A). Im Anschluss an das Sortieren und nach 24 Stunden in der Zellkultur, die CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos Zellen befestigen und zeigen typische Kopfsteinpflastermorphologie (2B und C). V.......

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Discussion

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LECs spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Fluid, Immunantwort auf fremde Antigene, und die Absorption und den Transport von bestimmten Nährstoffen. LEC-Homöostase durch Krankheitsprozesse wie bakterielle Infektionen und Tumormetastasen betroffen sein, aber LECs können somatische Mutationen, die in der Bildung von dysfunktionalen Lymphgefäße und signifikante Morbidität für die betroffenen Patienten führen zu entwickeln. Um mehr Verständnis Lymphmissbildung Ätiologie durch Implantation .......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Die Autoren möchten die Baker-Stiftung und dem Königskinder "Women in Science Fellowship 'Foundation Unterstützung Zerina Lokmić anzuerkennen. Andrew G. Elefanty und Edouard G. Stanley sind NHMRC Senior Research Fellows. Arbeit in ihren Labors wurde von NHMRC und Stammzellen Australien unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLife Technologies (Gibco)11965-092Wird zur Entnahme von Gewebeproben aus dem Operationssaal verwendet.
EGM-2 MV Bullet KitLonzaCC-3202EGM-2 MV Bullet Kit enthält 500 ml EBM-2 Medium und humanes EGF, Hydrocortison, Gentamycin (GA-1000), fötales Rinderserum (FBS), VEGF, humanes FGF-b, R3-IGF-1 und Ascorbinsäure.
VEGF-CR& D Systems2179-VC-025Vollständiges Endothelzellmedium wird mit 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotika-Antimykotik-Lösung (100x) ergänztLifeTechnologies (Gibco)15240-062Diese Lösung enthält 10.000  U/ml Penicillin, 10.000   mg/ml Streptomycin und 25  mg/ml Fungizone Antimykotikum. Bei einer Verdünnung von 1:100 verwenden.
Fibronektin aus humanem PlasmaSigma-AldrichF2006Wird in Konzentrationen von 10 mg/ml verwendet. Es kann bis zu 1 Monat lang wiederverwendet werden, wenn es bei 4  ° C und steril gehalten. Verwenden Sie 7  ml zum Beschichten von 150 cm2 Kolben.
StemPro Accutase Reagenz zur ZelldissoziationLife Technologies (Gibco)A11105-01StemPro® Accutase® wird mit 0,05 ml pro cm2 verwendet, um die gesamte Oberfläche des Kolbens abzudecken. Die Verwendung kleinerer Volumina kann zu einer unvollständigen Zellablösung führen.
0,4 % Trypanblau-FarbstoffLife Technologies (Gibco)15250-061Wird als Viabilitätsfleck verwendet.
Dispase IIRoche Applied Biosciences4942078001Verwendet mit 0,04 %
Kollagenase IIWorthington Lab4176Verwendet mit 0,25 %
DNase IRoche Applied Biosciences11284932001Verwendet mit 0,01 %
70 mm Nylon-ZellsiebeBD Falcon352350<
PE-konjugierter VEGFR-3-Klon 9D9F9, Klon WM59BioLegend356204Verwendet bei einer Verdünnung von 1:50
PE-Cy7-konjugiertem CD34, Klon 581BioLegend343516Verwendet bei einer Verdünnung von 1:200
APC-konjugiertes Maus gegen humanes CD31, Klon WM59BioLegend303116,verwendet bei 1:100 Verdünnung
Alexa 488-konjugiertes Ratten-Anti-Human-Podoplanin, Klon NC-80.BioLegend337006Verwendet bei einer Verdünnung von 1:200
PE-konjugiertes Maus-IgG1, k-Isotyp, Klon MOPC-21BioLegend400112Verwendet bei einer Verdünnung von 1:50
PE-Cy7-konjugiertes Maus-IgG1, k-Isotyp, Klon MOPC-21BioLegend400126Verwendet bei einer Verdünnung von 1:200
APC-konjugiertes Maus-IgG1, k-Isotyp, Klon MOPC-21BioLegend400120Verwendet bei einer Verdünnung
von 1:100Alexa 488-konjugierte Maus IgG2a, k-Isotyp, Klon RATK2758BioLegend400525Verwendet in einer Verdünnung von 1:200
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
  2. Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of ....

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Lymphatic Endothelial CellsFluorescence Activated Cell SortingMulti parameter FACSTissue DigestionCell Surface MarkersCD34 CD31 VEGFR 3 PodoplaninCell Culture ExpansionFibronectin coated FlasksFlow Cytometry StainingPropidium Iodide Exclusion

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