Mesenchymale Stammzellen werden normalerweise aus Knochenmark gewonnen und benötigen eine Expansionskultur. Wenn Proben vor der Verarbeitung gerinnen, kann ein Protokoll mit dem (enzymatischen) thrombolytischen Medikament Urokinase angewendet werden, um das Gerinnsel abzubauen. So werden Zellen freigesetzt und stehen für die Expansionskultur zur Verfügung. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur erneuten Probenahme.
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Methodenartikel
Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) - normalerweise aus Knochenmark gewonnen - benötigen oft eine Expansionskultur. Unser Protokoll verwendet Urokinase in klinischer Qualität, um Gerinnsel im Knochenmark abzubauen und MSCs für die weitere Verwendung freizusetzen. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Knochenmarkprobenahme. Knochenmark ist eine wichtige Quelle für MSCs, die für das Tissue Engineering und autologe Stammzelltherapien interessant sind. Bei der Entnahme kann das Knochenmark gerinnen, da es das gesamte hämatopoetische System umfasst. Die resultierenden Gerinnsel enthalten auch MSCs, die für die Expansionskultur oder die direkte Stammzelltherapie verloren gehen. Wir stellten fest, dass 74 % der Knochenmarkproben von Hunden Gerinnsel enthielten und weniger als die Hälfte der Stammzellzahl ergaben, die von nicht geronnenen Proben erwartet wird. Daher haben wir ein Protokoll für den enzymatischen Verdau dieser Gerinnsel entwickelt, um arbeitsintensive und kostspielige Knochenmark-Neuproben zu vermeiden. Urokinase - ein klinisch zugelassenes und leicht verfügbares Thrombolytikum - beseitigt die Knochenmarkgerinnsel fast vollständig. Infolgedessen ergeben behandelte Knochenmarkaspirate eine ähnliche Anzahl von MSCs wie ungeronnene Proben. Auch nach der Urokinase-Behandlung behielten die Zellen ihre Stoffwechselaktivität und die Fähigkeit, sich in chondrogene, osteogene und adipogene Linien zu differenzieren. Unser Protokoll rettet geronnene Blut- und Knochenmarkproben, ohne die Qualität der Zellen zu beeinträchtigen. Dies macht die erneute Probenahme überflüssig, reduziert die Probenahmekosten erheblich und ermöglicht die Verwendung von geronnenen Proben für Forschung oder Therapie.
Einleitung
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) spielen eine wichtige Rolle in der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering. Sie können Migration, Differenzierung in verschiedene Zelltypen 1 und einprägen, die ihnen die idealen Kandidaten für autologe Therapien 2,3 macht. In letzter Zeit, klinischen Studien mit MSCs für Knochen- und Knorpelreparatur, Graft-versus-Host-Erkrankung oder Herzerkrankung wurden eingeführt 4. Diese MSCs aus der Nabelschnur oder Fettgewebe gewonnen werden, sondern die vielversprechendsten Ergebnisse wurden aus dem Knochenmark stammenden Stammzellen 5 erhalten.
Der Beckenkamm er....
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Protokoll
HINWEIS: Human Knochenmarkaspiraten aus dem Beckenkamm wurden vom mündigen Spender mit Zustimmung der Ethikkommission des Kantons Luzern gesammelt. Canine Knochenmarkaspiraten aus dem Beckenkamm wurden mit Hundebesitzers consent.Human gesammelt (ca. 20 ml) und Hunde (ca. 10 ml) Knochenmarkaspiraten waren antikoaguliert durch Zugabe von 15 ml 3,8% Natriumcitrat unmittelbar nach dem Rückzug im Operationssaal. Die Proben wurden auf die Laborumgebung zum Verarbeiten der gleiche Tag wie zurückführt.
1. Herstellung von Urokinase (Vor dem 1. Verwenden)
- Rekonstituieren Urokinase mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (P....
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Ergebnisse
Die Tatsache, dass 74% der Hundeknochenmarkproben (n = 54) enthalten sind Blutgerinnsel, wenn sie in unserem Labor (1A) kam zusammen mit verringerter MSC Erträge aus diesen Proben, hat uns davon überzeugt, dass eine beträchtliche Anzahl von MSCs wurde innerhalb der Blutgerinnsel gefangen . Tatsächlich ist ein einfaches DAPI-Färbung des geschnittenen Nungsmaterial bestätigt die Anwesenheit von kernhaltigen Zellen in hoher Dichte (1B). Dies führt letztlich zu geringe Zahl von MSCs für die.......
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Diskussion
Routinemäßig wir probieren Knochenmark, während der Patient in der Chirurgie (in unserem Fall vor allem Wirbelsäulenchirurgie), mit dem Vorteil, dass nur wenig zusätzliche Arbeit muss durch das Personal im Operationssaal durchgeführt werden. Auch wenn die Proben mit Natriumcitrat sofort nach Entnahme gemischt wurden viele Proben teilweise geronnen, wenn sie im Labor zur Verarbeitung angekommen. Zu diesem Zeitpunkt würde Resampling zu Clotted Exemplare zu ersetzen eine separate zusätzliche Intervention erforderlich wiede.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Schweizerische Nationalstiftungsstipendium CR3I3_140717/1 und die Schweizer Paraplegiker-Stiftung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Basal Medium Komponenten | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha mit Nukleosid, mit stabilem Glutamin | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Hitzeinaktiviertes | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogene Mediumkomponenten | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Kaninchen Serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethason | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazon | Sigma | R2408 | |
| Pantothenat | Sigma | P5155 | |
| Öl Rot-O | Sigma | O0625 | |
| des osteogenen Mediums | |||
| L-Ascorbinsäure 2-phosphat | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphat | Sigma | G9422 | |
| Silbernitrat (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Komponenten des chondrogenen Mediums | |||
| Biopad - schwammförmiges Medizinprodukt | Euroresearch | ||
| L-Prolin | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selen X | Gibco | 51500056 | |
| Menschlicher transformierender Wachstumsfaktor-β 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear Fast Red | Sigma | N8002 | |
| Generisches | |||
| Tri-Natriumcitrat-Dihydrat | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac 1976826 | ||
| 0,5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa Färbung | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyd | Applichem | A0877 | |
| Schwefelsäure (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesiumchlorid (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidinhydrochlorid | Applichem | A1499 | |
| Verbrauchsmaterial | |||
| 50 ml Reaktionsröhrchen | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml Spritze | Braun | 4606108V | |
| Sterican Nadel (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1,7 ml Mikroröhrchen | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μ m Zellsieb | Falcon | 6.05935 | |
| Pinzette | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| steriles Skalpell | Braun | 5518059 | |
| Primaria Zellkulturschale | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| Zellkulturflasche - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Ausstattung | |||
| Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Klasse II | Skan | 82011500 | |
| Wasserbad | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serologische Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| Mikroskop | Olympus | CKX41 | |
| befeuchteter Inkubator Heracells 240 | Thermo wissenschaftliche | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo wissenschaftliche | 75004331 |
Referenzen
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., e....
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Nachdrucke und Genehmigungen
