Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen werden normalerweise aus Knochenmark gewonnen und benötigen eine Expansionskultur. Wenn Proben vor der Verarbeitung gerinnen, kann ein Protokoll mit dem (enzymatischen) thrombolytischen Medikament Urokinase angewendet werden, um das Gerinnsel abzubauen. So werden Zellen freigesetzt und stehen für die Expansionskultur zur Verfügung. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur erneuten Probenahme.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) - normalerweise aus Knochenmark gewonnen - benötigen oft eine Expansionskultur. Unser Protokoll verwendet Urokinase in klinischer Qualität, um Gerinnsel im Knochenmark abzubauen und MSCs für die weitere Verwendung freizusetzen. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Knochenmarkprobenahme. Knochenmark ist eine wichtige Quelle für MSCs, die für das Tissue Engineering und autologe Stammzelltherapien interessant sind. Bei der Entnahme kann das Knochenmark gerinnen, da es das gesamte hämatopoetische System umfasst. Die resultierenden Gerinnsel enthalten auch MSCs, die für die Expansionskultur oder die direkte Stammzelltherapie verloren gehen. Wir stellten fest, dass 74 % der Knochenmarkproben von Hunden Gerinnsel enthielten und weniger als die Hälfte der Stammzellzahl ergaben, die von nicht geronnenen Proben erwartet wird. Daher haben wir ein Protokoll für den enzymatischen Verdau dieser Gerinnsel entwickelt, um arbeitsintensive und kostspielige Knochenmark-Neuproben zu vermeiden. Urokinase - ein klinisch zugelassenes und leicht verfügbares Thrombolytikum - beseitigt die Knochenmarkgerinnsel fast vollständig. Infolgedessen ergeben behandelte Knochenmarkaspirate eine ähnliche Anzahl von MSCs wie ungeronnene Proben. Auch nach der Urokinase-Behandlung behielten die Zellen ihre Stoffwechselaktivität und die Fähigkeit, sich in chondrogene, osteogene und adipogene Linien zu differenzieren. Unser Protokoll rettet geronnene Blut- und Knochenmarkproben, ohne die Qualität der Zellen zu beeinträchtigen. Dies macht die erneute Probenahme überflüssig, reduziert die Probenahmekosten erheblich und ermöglicht die Verwendung von geronnenen Proben für Forschung oder Therapie.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) spielen eine wichtige Rolle in der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering. Sie können Migration, Differenzierung in verschiedene Zelltypen ¹ und einprägen, die ihnen die idealen Kandidaten für autologe Therapien ^2,3 macht. In letzter Zeit, klinischen Studien mit MSCs für Knochen- und Knorpelreparatur, Graft-versus-Host-Erkrankung oder Herzerkrankung wurden eingeführt ^4. Diese MSCs aus der Nabelschnur oder Fettgewebe gewonnen werden, sondern die vielversprechendsten Ergebnisse wurden aus dem Knochenmark stammenden Stammzellen ⁵ erhalten.

Der Beckenkamm ermöglicht, eine beträchtliche Menge von Knochenmark gesammelt und dient daher als Hauptstelle der Aspiration ^6. Die Qualität des Aspirat nimmt jedoch mit zunehmendem Volumen von Knochenmark entnommen. Während die ersten 5 ml Knochenmarkaspirat enthält MSCs von hoher Qualität, Entzug von größeren Mengen führt zu einer Verwässerung des absaugen mit peripheren Blut fROM Die gefäßKnochen ^7. Aufgrund der gegenwärtigen Megakaryozyten-Plättchen sind Knochenmarkaspiraten anfällig für die Blutgerinnung, es sei denn, Antikoagulanzien eingesetzt werden. Aber auch mit Antikoagulantien kann Blutgerinnsel auftreten.

Im Knochenmark-MSCs stellen nur einen kleinen Anteil der Gesamtzellpool ⁸ und haben in Kultur für die meisten Gewebezüchtung oder therapeutische Anwendungen ⁴ erweitert werden. Die Qualität einer solchen Kultur hängt weitgehend von der ursprünglichen Zellpool, dh., Vielfalt und eine hohe Startnummer ^9. Niedrige Werte von MSCs aus Entnahmen kann teilweise durch Spendervariabilität erklärt werden. Auf der anderen Seite, MSCs von niedriger Qualität Proben erfordern längere Zeit in der Kultur und erweitert Passage, um die gewünschte Anzahl von Zellen zu erreichen. In jedem Fall ist verlängert Passagierung eine Quelle von Zellalterung und kann zum Verlust der Differenzierungspotential ¹⁰ führen. Daher optimierte Protokolle, Zell y maximieren könnenield und verhindert nachteilige Effekte entwickelt ^11,12 werden müssen.

Als wir begannen, mit Hunde-MSCs zu arbeiten, waren wir erstaunt zu sehen, dass etwa drei von vier Hundeknochenmarkproben enthalten Blutgerinnsel, während glücklicherweise geronnen Humanproben (jede zehnte) wurden weniger häufig. Auf der anderen Seite war es keine Überraschung, dass wir viel niedrigeren Renditen von MSCs aus geronnenen Proben beobachtet. Um die wiederkehrende Frage der geronnenen Proben zu lösen, haben wir das Protokoll entwickelt, mit dem Thrombolytikum Urokinase anstelle von Resampling.

Thrombolytische Therapien lebensbedrohlichen Situationen wie Verschluss von Blutgefäßen verursacht Herzinfarkt, Schlaganfall oder Embolien aufgrund unerwünschter Blutgerinnung entgegenwirken. Sie wirken, indem sie den Abbau der Thromben durch enzymatische Spaltung von Fibrin durch Plasmin und Enzym Plasminogenaktivatoren. Trotz der breiten Verwendung zur Behandlung von Patienten, existieren nur sehr wenige Veröffentlichungen, die verwendet thrombolytischen Aktivitätenfür Laboranwendungen bis geronnenen Proben zu retten, vor allem mit Schwerpunkt auf Lymphozyten. 1987 Nikus et al. beschrieben die Verwendung von Streptokinase zur Auflösung von Blutgerinnseln, was zu Funktions Lymphozyten ¹³ und vier Jahre später, De Vis et al. erweitert die Verwendung von Streptokinase Leukämiezellen aus Blut und Knochenmark für die Durchflusszytometrie-Anwendungen ¹⁴ zu isolieren. Eine neuere Veröffentlichung schlägt die Verwendung von Alteplase für die Krebsdiagnostik ^15. Während der Verwendung des gleichen Enzym Ansatz konzentriert sich unser Protokoll für die Isolierung von multi MSCs Form Knochenmark, um ein Werkzeug für Forscher in der Stammzell-Bereich bieten.

Protokoll

HINWEIS: Human Knochenmarkaspiraten aus dem Beckenkamm wurden vom mündigen Spender mit Zustimmung der Ethikkommission des Kantons Luzern gesammelt. Canine Knochenmarkaspiraten aus dem Beckenkamm wurden mit Hundebesitzers consent.Human gesammelt (ca. 20 ml) und Hunde (ca. 10 ml) Knochenmarkaspiraten waren antikoaguliert durch Zugabe von 15 ml 3,8% Natriumcitrat unmittelbar nach dem Rückzug im Operationssaal. Die Proben wurden auf die Laborumgebung zum Verarbeiten der gleiche Tag wie zurückführt.

1. Herstellung von Urokinase (Vor dem ^1. Verwenden)

1. Rekonstituieren Urokinase mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) nach den Anweisungen des Herstellers: 10 ml PBS zu dem Septum-Einlaß Kolben unter Verwendung einer 10 ml Spritze. Lösen Sie die Trockensubstanz durch Verwirbelung zu 50.000 Einspritzeinheiten (U) pro ml zu erhalten.
2. Bereiten Sie 500 ul Aliquots (jeweils 25.000 U) in sterile Rohre. Speicher Aliquots -20 ° C und verwenden es, wenn sie für mindestens 6 Monate benötigt.

2. Präparative Schritte (Vor jeder Knochenmarkbehandlung)

1. Auftauen ein Aliquot von Urokinase (25.000 U) pro geronnen Knochenmarkaspirat (Aspirate Volumina bis zu 25 ml wurden erfolgreich unter Verwendung eines einzigen Aliquot 25.000 U behandelt wurde).
2. Heizen Sie ein Wasserbad oder Schüttelinkubator bis 37 ° C.

3. Enzymatische Digest des Clot

1. Alle Arbeiten in einer laminaren Strömung Biosicherheitswerkbank, um eine mikrobielle Kontamination der Knochenmarkproben während der Verarbeitung zu vermeiden. Bei der Arbeit mit potenziell infektiöses humanes Material ist die Verwendung von Schutzhandschuhen sowie sorgfältige Umgang beraten.
2. Legen Sie eine 100 um Zellsieb auf einem sterilen 50 ml-Tube. Gießen Sie das Knochenmarkaspirat durch die Zelle Sieb, Kippen des Schmutzfänger oder bewegen das Gerinnungsmaterial. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze fürbessere Durchströmung des Filtergitter.
   Hinweis: Vermeiden Sie jede Verdünnung des Gerinnsels, beispielsweise durch Waschen der Gerinnsel mit PBS. Urokinase wirkt indirekt und erfordert Komponenten des Serums (dh., Plasminogen) von der Biopsie zur wirksamen verdauen. Während der Fortsetzung des Verfahrens mit dem Gerinnungsmaterial, kann das Filtrat bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verwendung in Schritt 3.6 gehalten werden.
3. Übertragen Sie die Knochenmark Blutgerinnsel Material in einen leeren Zellkulturschale mit einer sterilen Pinzette. Schneiden Sie den Schmutz in kleine Stücke von etwa 2 mm ³ mit einem sterilen Skalpell.
4. Übertragen der kleinen Stücke des Gerinnsels in einen 50 ml Reaktionsgefäß unter Verwendung der sterilen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das Hackfleisch Gerinnsel hat eine Wet-Optik. Wenn es trocken zu sein scheint, verwenden Sie etwas von dem Filtrat aus Schritt 3.1 zu befeuchten.
5. Man reibt das Gerinnsel durch Auf- und Abpipettieren für 5-mal mit einer 5 ml Pipette Mikrotiterplatten. 1 Aliquot von Urokinase an der Probe. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C entweder in einem Wasserbad oder inein Schütteln (sanft) Inkubator.
6. Verreiben durch Auf- und Abpipettieren für 5 mal mit einer 5-ml-Pipette. Führen Sie diesen Schritt in einer Biosicherheitswerkbank. Inkubieren für weitere 30 min bei 37 ° C. Nach der Inkubation verreiben wieder 5-mal mit einer 5 ml Pipette. Fahren Sie über eine neue 100 um Zellsieb mit dem Filtrat aus Schritt 3.2 zu bündeln.
7. Zentrifuge die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 500 x g. Überstand verwerfen. Re-suspend das Zellpellet in Medien wie unten oder nach dem Standardverfahren Ihres Labors für MSC Expansion Kultur beschrieben.

4. Seeding für Expansion Zellkultur und CFU-Platten

1. Resuspendieren der Zellen (die aus Erythrozyten und mononukleäre Zellen) in 50 ml Basalmedium: Alpha-MEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin und 2,5 mg / ml Amphotericin B supplementiert . Zählen Sie die Zellen 1:10 in Trypanblau Lösung unter Verwendung einer Neubauer chamber.
2. Platte, die Zellen in Zellkulturflaschen in einer Dichte von 5 × 10 ⁷ Zellen / cm ² und Inkubation in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Falls vorhanden, hypoxische (5% Sauerstoff) Bedingungen. Für den CFU-Assay Steuerung Platte 10 ⁹ Zellen in einer Zellkulturschale von 10 cm Durchmesser.
3. Nach 3 Tagen Kultur werden die mesenchymalen Stammzellen an der Zellkulturschale befestigt ist, während andere Zellen in Suspension verbleiben. Ändern der Medien mit Basalmedium mit 5 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) ergänzt. Für die CFU-Test Kontrolle, Behandlung der Zellkulturschale ebenfalls.
4. Weiterhin Zellkultur für insgesamt 2 Wochen Austausch von Medien dreimal wöchentlich. Wenn die Zellen 80% Konfluenz überschreiten, durch Trypsinierung aufgeteilt. Für den CFU-Assay Steuerung, tauschen die Medien ebenfalls, doch spalten nicht die Zellen im Verlauf der zwei Wochen.

5. Giemsa Stain für CFU-Assay

1. Bereiten Sie 10 ml Giemsa-Lösung pro Schale: dilute die Stammlösung (7,6 g / l Giemsa in Glycerin: Methanol) 1:10 in sterilem Wasser (immer eine neue Arbeitsverdünnung).
2. Druckmaterial aus der Zellkulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS. Seien Sie sehr vorsichtiger bei der Anwendung von Flüssigkeit auf die Petrischale und vermeiden Abwaschen der Zellen.
3. Fix Zellen in reinem Methanol für 5 min bei RT. Entsorgen Sie die Methanol. Hinzufügen die Giemsa-Lösung und Inkubation für 60 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C.
4. Zweimal mit PBS waschen. Air zuerst trocknen Sie die Platte Kopf auf einem Papiertuch. Die Kolonien manuell. Dies wird am besten mit einem Filzstift auf der Rückseite der Platte erreicht.

6. MSC Differenzierung

1. Canine MSCs Differenzierung
   HINWEIS: Canine MSCs wurden in chondrogene, knochenbildende und adipogene Linien durch Stimulation mit den entsprechenden Medien über vier Wochen differenziert.
2. Für Adipogene Differenzierung, Kultur MSCs in Monolayer bei 4 x 10 ⁵ cells / cm ² abwechselnd zwei unterschiedliche Kulturbedingungen wie folgt;
   1. Kultur in Adipogenese Erhaltungsmedium, das DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B und 170 mM Insulin.
   2. Kultur in Adipogenese Induktionsmedium mit Erhaltungsmedium mit 3% FBS, 5% Kaninchenserum, 1 uM Dexamethason ergänzt, 500 uM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin, 33 uM Biotin, 5 uM Rosiglitazon und 17 uM Pantothenat ^16.
   3. Schwelgen Sie die Lipidtröpfchen durch Färbung mit Oil Red-O. Kurz gesagt, reparieren Zellen mit 10% Formaldehyd, mit PBS waschen und färben mit 0,35% Oil red O in Isopropanol.
3. Für osteogene Differenzierung Kultur MSCs in Monoschicht auf 7 x 10 ³ Zellen / cm ² und in der folgenden zu stimulieren:
   1. Erweiterte DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B, 501; M L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 10 mM ß-Glycerophosphat und 100 nM Dexamethason.
   2. Identifizieren Sie die Mineralisierung Einlagen von Von Kossa-Färbung (5% AgNO _3). Kurz gesagt, fixieren Sie die Zellen mit 10% Formaldehyd, Waschen mit PBS und Fleck mit 5% AgNO ₃ in destilliertem Wasser.
4. Chondrogene Differenzierung
   1. Cut Würfel (3 mm je Seite) von einem Schwamm geformt Medizinprodukt, gebildet aus lyophilisierten Kollagen Typ I, und als Gerüstmaterial verwendet, um Zellen ¹⁷ zu unterstützen.
   2. Seed MSCs auf der Oberseite der Würfel in einer Konzentration von 4 x 10 ⁶ Zellen / ml (~ 70.000 Zellen / Cube).
   3. Vor der Zugabe der Medien, um die Zellen, die den Würfel 30 Minuten einzuhalten.
   4. Pflegen MSC-Kollagenstrukturen in chondrogenem Medium aus DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B, 40 ng / ml Dexamethason, 50 ug / ml Ascorbinsäure -2-phosphat,50 ug / ml L-Prolin, 1x Insulin-Transferrin-Selen-X, und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-β1.
   5. Verwenden Alcianblau Färbung, um die Ansammlung von Proteoglykanen in Konstrukte Abschnitte zu visualisieren. Kurz gesagt, färben die Abschnitte O / N mit 0,4% Alcianblau in 0,01% H ₂ SO ₄ und 0,5 M Guanidinhydrochlorid. Anschließend wurden die Schnitte waschen für 30 min in 40% DMSO und 0,05 M MgCl ₂ gewaschen. Die Zellen wurden mit Kernechtrot gegengefärbt.

Ergebnisse

Die Tatsache, dass 74% der Hundeknochenmarkproben (n = 54) enthalten sind Blutgerinnsel, wenn sie in unserem Labor (1A) kam zusammen mit verringerter MSC Erträge aus diesen Proben, hat uns davon überzeugt, dass eine beträchtliche Anzahl von MSCs wurde innerhalb der Blutgerinnsel gefangen . Tatsächlich ist ein einfaches DAPI-Färbung des geschnittenen Nungsmaterial bestätigt die Anwesenheit von kernhaltigen Zellen in hoher Dichte (1B). Dies führt letztlich zu geringe Zahl von MSCs für die...

Diskussion

Routinemäßig wir probieren Knochenmark, während der Patient in der Chirurgie (in unserem Fall vor allem Wirbelsäulenchirurgie), mit dem Vorteil, dass nur wenig zusätzliche Arbeit muss durch das Personal im Operationssaal durchgeführt werden. Auch wenn die Proben mit Natriumcitrat sofort nach Entnahme gemischt wurden viele Proben teilweise geronnen, wenn sie im Labor zur Verarbeitung angekommen. Zu diesem Zeitpunkt würde Resampling zu Clotted Exemplare zu ersetzen eine separate zusätzliche Intervention erforderlich wiede...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Basal Medium Komponenten
PenStrep 100X	Gibco	15140122
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
MEM Alpha mit Nukleosid, mit stabilem Glutamin	Amimed	1-23S50-I
FBS Hitzeinaktiviertes	Amimed	2-01F36-I
Amphotericin B	Applichem	A1907
Adipogene Mediumkomponenten
DMEM-HAM F12 + GlutaMAX	Amimed	1-26F09-I
Insulin	Sigma	I5500
Kaninchen Serum	Gibco	16120099
Dexamethason	Applichem	D4902
3-Isobutyl-1-methylxanthin	Sigma	I5879
Biotin	Sigma	B4639
Rosiglitazon	Sigma	R2408
Pantothenat	Sigma	P5155
Öl Rot-O	Sigma	O0625
			des osteogenen Mediums
L-Ascorbinsäure 2-phosphat	Sigma	A8960
ß-glycerophosphat	Sigma	G9422
Silbernitrat (AgNO3)	Sigma	S6506
Komponenten des chondrogenen Mediums
Biopad - schwammförmiges Medizinprodukt	Euroresearch
L-Prolin	Sigma	P5607
Insulin-Transferrin-Selen X	Gibco	51500056
Menschlicher transformierender Wachstumsfaktor-β 1	Peprotech	100-21
Alcian Blue 8GX	Sigma	A3157
Nuclear Fast Red	Sigma	N8002
Generisches
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat	Applichem	A3901
PBS	Applichem	964.9100
Urokinase		Medac 1976826
0,5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400054
Giemsa Färbung	Applichem	A0885
Formaldehyd	Applichem	A0877
Schwefelsäure (H2SO4)	Applichem	A0655
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Applichem	A1584
Magnesiumchlorid (MgCl2)	Applichem	A3618
Guanidinhydrochlorid	Applichem	A1499
Verbrauchsmaterial
50 ml Reaktionsröhrchen	Axygen	SCT-50ML-25-S
10 ml Spritze	Braun	4606108V
Sterican Nadel (22G)	Braun	4657624
1,7 ml Mikroröhrchen	Brunschwig	MCT-175-C
100 μ m Zellsieb	Falcon	6.05935
Pinzette	Bastos Viegas, SA	489-001
steriles Skalpell	Braun	5518059
Primaria Zellkulturschale	Falcon	353803
C-Chip Neubauer Improved	Bioswisstech	505050
Zellkulturflasche - Flask T300	TPP	90301
Ausstattung
Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Klasse II	Skan	82011500
Wasserbad	Memmert	1305.0377
Stripettes Serologische Pipette 5ml	Corning	4487-200ea
Mikroskop	Olympus	CKX41
befeuchteter Inkubator Heracells 240	Thermo wissenschaftliche	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	Thermo wissenschaftliche	75004331

Komponenten sterile