Methodenartikel

Die Entfernung der Spurenelemente von Kupferoxid Nanopartikeln aus Uranium In-situ- Wiederherstellung Blutwasser und Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit

DOI:

10.3791/52715

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21. Juni 2015

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1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Produktionsblutwasser (PBW) wurde mit Kupferoxid-Nanopartikeln (CuO-NPs) behandelt und die zelluläre Toxizität in kultivierten menschlichen Zellen bewertet. Das Ziel dieses Protokolls war es, die native Umweltprobe in ein Zellkulturformat zu integrieren, um die Veränderungen der Toxizität aufgrund der CuO-NP-Behandlung zu bewerten.

Zusammenfassung

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In situ-Gewinnung (ISR) ist die vorherrschende Methode der Urangewinnung in den Vereinigten Staaten. Während der ISR wird Uran aus einem Erz Körper ausgelaugt und durch Ionenaustausch extrahiert. Die sich ergebende Produktionsblutwasser (PBW) enthält Schadstoffe wie Arsen und andere Schwermetalle. Proben von PBW von einem aktiven ISR-Urananlage wurden mit Kupfer-II-Nanopartikel (CuO-NPs) behandelt. CuO-NP Behandlung PBW reduziert vorrangiger Schadstoffe einschließlich Arsen, Selen, Uran und Vanadium. Unbehandelt und CuO-NP behandelt PBW wurde als die flüssige Komponente der Zellwachstumsmedien und Änderungen der Lebensfähigkeit verwendet wurden mit dem MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) bestimmt Assay in humanen embryonalen Nieren (HEK 293) und die menschliche Leberzellkarzinom (Hep G2-Zellen). CuO-NP-Behandlung wurde mit verbesserten HEK und HEP Lebensfähigkeit der Zellen verbunden. Beschränkungen dieses Verfahrens umfassen die Verdünnung des PBW durch Wachstumsmedienkomponenten und während osmolnalität Verstellung sowie notwendige pH-Einstellung. Dieses Verfahren wird im weiteren Kontext durch Verdünnungseffekte und Veränderungen im pH-Wert der PBW die jedoch üblicherweise leicht sauer ist begrenzt; Diese Methode könnte einen breiteren Einsatz der Beurteilung CuO-NP Behandlung in neutraler Gewässer.

Einleitung

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Etwa 20% des US-Stromversorgung durch Kernenergie und zum Teil auf der Grundlage nationaler Anreize zur Energieunabhängigkeit zu erhöhen, US nukleare Kapazität wird voraussichtlich weiter steigen 1. Weltweites Wachstum der Kernenergie auch wird sich voraussichtlich fortsetzen, wobei ein Großteil des Wachstums außerhalb der USA 2 auftritt. Ab 2013 wurde 83% der US Uran importiert, aber 952.544 Tonnen Reserven in den USA 3,4 vorhanden sind. Im Jahr 2013 gab es 7 neue Anlage-Anwendungen und 14 Neustart / Erweiterung von Anwendungen zwischen Wyoming, New Mexico, und Nebraska 5. In den USA Uran vorwiegend durch in situ-Gewinnung (ISR) verarbeitet 6 extrahiert. ISR bewirkt, dass weniger Land Unterbrechung und verhindert die Schaffung Halden, die Umweltschadstoffe 7 freigeben können. ISR verwendet wasserbasierte Oxidations Lösungen für Uran von der U-Erzkörper, wonach das Uran aus dem Sickerwasser durch extrahiert auslaugenein Ionenaustauschverfahren 8. Um eine negative Wasserbilanz in der Erzkörper zu halten, wird ein Teil des Sickerwassers, bluten genannt Produktionswasser (PBW) ist abfallend. Ein Teil der PBW wird mit Umkehrosmose (RO) und dekontaminiert in den Abbauprozess wieder eingeführt, aber PBW könnte auch von Vorteil industriellen oder landwirtschaftlichen Nutzen haben, wenn toxische Schadstoffe auf ein annehmbares Niveau von staatlichen Aufsichtsbehörden für die Oberflächen ermittelt und reduziert werden Grundwasser 9. Gegenwärtig sind die meisten ISR-Uran Einrichtungen nutzen RO, um Verunreinigungen aus PBW entfernen. Allerdings ist RO Bearbeitungsenergieintensiv und erzeugt giftige Abfälle Sole, die geregelte Entsorgung erfordert.

Viele Wasserdekontaminationsverfahren existieren, einschließlich Adsorbentien, Membranen und Ionenaustausch. Von diesen ist die Adsorption der am häufigsten verwendet wird, und die jüngsten Entwicklungen in der Synthese von Nanopartikeln ist die Leistungsfähigkeit des Adsorptionsmittels basierten Wasser Dekontaminierungsverfahren 10 verbessert. Cupric oxide-Nanopartikel (CuO-NPs) hatte zuvor nicht umfassend auf Uran ISR PBW studiert, aber in den letzten Studien der Entfernung von Verunreinigungen aus dem Grundwasser, CuO-Nanopartikel wurden gefunden, um einzigartige Eigenschaften, einschließlich nicht vor oder nach der Wasserbehandlungsschritte erfordern (haben B. Einstellen des pH oder Redox-Potential) und eine gute Leistung in unterschiedlichen Wasserzusammensetzungen (beispielsweise in verschiedenen pH-Werten, Salzkonzentrationen oder konkurrierende Ionen) 11. Zusätzlich sind CuO-NPs leicht durch Auslaugen mit Natriumhydroxid (NaOH), wonach der regenerierte CuO-NPs können wiederverwendet werden regeneriert. Details der CuO-NP Spurenmetallfilterfunktionen von natürlichen Gewässern haben bisher veröffentlichten 11-14 worden.

Obwohl nützlich für die Wasserbehandlung können Metalloxidnanopartikel toxisch für lebende Organismen, aber das Ausmaß der Toxizität hängt teilweise von Nanopartikel Merkmale und Bestandteile 10,15,16. Daher ist es wichtig zu untersuchen simultaneous Entfernung von Verunreinigungen und Nanopartikel-Toxizitäten vor Feldeinsatz. Die aktuelle Studie ermittelt die Fähigkeit des CuO-Nanopartikel zu Prioritäts PBW Verunreinigungen (einschließlich Arsen, Selen, Vanadium und Uran) zu entfernen, und bewertet die Wirkung von CuO-NP-Behandlung auf PBW Zytotoxizität.

PBW wurde aus einer aktiven ISR Urananlage gesammelt und verwendet, um die Wirksamkeit von CuO-NP Behandlung Priorität Verunreinigungsentfernung zu bestimmen. PBW Zytotoxizität vor und nach der CuO-NP Behandlung auch beurteilt. PBW ist eine komplexe geologische (Industrie / Umwelt) des Gemischs und sowohl das National Institute of Environmental Health and Science (NIEHS) und der Agentur für Toxic Substances & Disease Registry (ASTDR) werden den Schwerpunkt auf die Untersuchung der Toxizität von umweltrelevanten Gemischen, einschließlich Mischungen wie sie in der Natur oder industriellen Umgebungen, sowie die Förderung in vitro-Tests bestehen, um Chemikalien für weitere in-vivo-Tests zu priorisieren17-19. Studien zur chronischen, niedrig dosierte Mischung Engagements sind eine Herausforderung, weil chronische Exposition gegenüber einer niedrigen Dosis Mischung nicht produzieren offensichtlichen Auswirkungen, zumindest nicht in der kurzen Zeit der meisten Laborstudien. Ähnlich den meisten in-vitro-Untersuchungen von chemischen Mischungen aussetzen Zellen einer definierten Labor hergestellten Mischung aus 2 oder mehreren Metallen 20,21. Diese Studien liefern Basisinformationen, aber vereinfachte Mischung nicht den komplexen antagonistischen und synergistischen Interaktionen, die in einer nativen, Umweltprobe, in der das gesamte Spektrum der Mischungskomponenten vorliegen, die auftreten können zu replizieren.

Die Ziele dieser Studie waren alternative Schmutzentfernungsverfahren für PBW zu untersuchen und die Wirkung (CuO-NP) Behandlung auf PBW Cytotoxizität an kultivierten menschlichen Zellen zu bewerten. Die Ergebnisse könnten die Uranindustrie durch die Entwicklung effizienter und umweltfreundliche Methoden zur Entfernung von Verunreinigungen zu profitieren. Diese Studie liefertder erste Beweis, dass die Reduktion der vorrangigen Schadstoffe in PBW von CuO-Nanopartikel reduziert Zytotoxizität in Säugetierzellen 22.

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Protokoll

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Alle Proben wurden bei der Uranflüssigkeitsverarbeitung Bau einer Uran ISR-Anlage in Wyoming gesammelt.

1. Herstellung Bleed Water (PBW)

  1. Sammeln zwei Arten von Wasserproben aus einem ISR-Urananlage: PBW und Umkehrosmose (RO) Wasser. Sammeln PBW von einem Überwachungshahn nach dem Ionenaustauschverfahren, aber vor der Umkehrosmose Dekontamination. Sammeln RO Proben nach der PBW durch Umkehr-Osmose-Behandlung dekontaminiert.
    HINWEIS: Auslaugmittel in Rohrleitungen von mehreren gut Felder zur Uranflüssigkeitsverarbeitungsgebäude, wo es in einer Säule gesammelt und für die Ionenaustausch hergestellt transportiert. Etwa 1-3% der Auslaugmittel nach dem Ionenaustausch aus dem Kreislauf entfernt und bezeichnet Produktionsblutwasser (PBW). PBW ist in den Mining-Prozesse wiederverwendet oder dekontaminiert / mit RO Filtration entmineralisiert.
  2. Sammeln Wasserproben in Polyethylen hoher Dichte (HDPE) Flaschen mit Nullkopfraum nachzu Standardarbeitsanweisungen für die Probenentnahme und Analyse des Wyoming Department of Environmental Quality (WYDEQ) 23.
  3. Messen Sie Temperatur und pH-Vor-Ort-und Transport Proben auf Eis, um sie kühl zu halten.
  4. Speicher PBW bei 4 ° C. Halten Sie das PBW Lösung kühl bis nach der konzentrierten essentiellem Eagle-Minimalmedium (EMEM-10x) wird während der Medienvorbereitung hinzugefügt, wie in dem folgenden Protokoll angewiesen.
    HINWEIS: PBW eine oxidierte Lösung, die ausfällt, wenn man sie einfrieren oder auf Raumtemperatur erwärmt. Nach Verdünnen der PBW Lösung ausreichend verdünnt, daß es nicht ausfallen, wenn es auf 37 ° C vor der Anwendung auf Zellen und während der Inkubation.

2. Herstellung von CuO-Nanopartikel (CuO-NPs)

  1. Kombinieren eines reinen Ethanollösung, die 250 ml von 0,2 M CuCl 2 • 2H 2 O, 250 ml 0,4 M Natriumhydroxid (NaOH) und 5 g Polyethylenglykol (PEG) in einem Rundkolben mit sechs mm Borosilikatglas Bälle.
  2. Legen Sie die Lösung in einer modifizierten Mikrowelle und lassen Sie es unter Rückfluss bei Umgebungsluftdruck für 10 Minuten bei 20% Leistung (Abstand von 6 sec auf 24 sec aus) zu reagieren.
  3. Die Lösung wird auf Raumtemperatur (20 ° C), dann in 50 ml konische Röhrchen dekantiert, wobei die Glaskugeln.
  4. Zentrifuge die Lösung in 50 ml konische Röhrchen bei 1.000 xg für 30 Minuten, dekantiert und wäscht danach den CuO-Nanopartikel, die mit einer Sequenz von 300 ml heißem Wasser (60-65 ° C), 100 ml Ethanol und 100 ml Aceton.
  5. Man trocknet die CuO-NPs auf Raumtemperatur (20 ° C) in den 50 ml konische Röhrchen.
  6. Kratzen Sie die CuO-Nanopartikel aus ihren Röhren in einem Mörser. Decken Sie die CuO-Nanopartikel mit Alufolie und erhitzen das CuO-NPs bis 110 ° C in einem Ofen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Kombinieren CuO-Nanopartikel in einer Charge und wiegen die CuO-Nanopartikel.
    HINWEIS: Die Vorbereitung der CuO-Nanopartikel und CuO-NP Behandlung von PBW wurden in Wasser durchgeführt Qualkeit Laboratory of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming. CuO-NP-Synthese folgte dem Verfahren von Martinson und Reddy (2009) 11.

3. Behandlung von PBW mit CuO-NPs

  1. Dann werden 50 mg (1 mg / ml) von CuO-NP zu einer 50 ml konischen Röhrchen, gefolgt von 50 ml PBW. Verschließen Sie den Schlauch und reagierte für 30 Minuten auf einer Tischorbitalschüttler bei 250 Upm.
  2. Zentrifugenprobenröhrchen bei 250 · g für 30 Minuten und dann auswählen, den Überstand unter Verwendung eines 0,45 & mgr; m-Spritzenfilter. Verändern die Zentrifugendrehzahl und die Zeit auf dem Nanopartikel abhängen, um sicherzustellen, das CuO-NPs werden kompakt in dem Zentrifugenröhrchen.

4. Elementaranalyse

  1. Vorbereitung unbehandelt (Kontrolle) und CuO-NP behandelt PBW Proben für die Elementaranalyse wie folgt.
  2. Anzusäuern Aliquots (40 ml) von CuO-NP-behandelten und unbehandelten PBW mit Spurenmetall Salpetersäure auf einen pH von 2,0. Analysieren angesäuerten Aliquots PBW für Kationen durch induktiv coupled Plasma-Massenspektroskopie (ICP-MS), wie in Reddy und Roth (2012) 13 beschrieben.
  3. Vorbereitung angesäuerten Aliquots (20 ml) von CuO-NP-behandelten und unbehandelten PBW und Analyse der nicht angesäuerten Aliquots Anionen durch Ionenchromatographie (IC), wie in Reddy und Roth (2012) 13 beschrieben.
    HINWEIS: Aliquots wurden vom Wyoming Department of Agriculture Analytical Services, Laramie WY 82070. Eine Beschreibung des IC und ICPMS Verfahren kann in Reddy und Roth, (2012) 13 gefunden werden analysiert.

5. Herstellung von Zellkulturmedien Mit PBW

  1. Verwenden Sie zwei Steuer (EMEM-1x und RO + Medien) und acht PBW Testmedienlösungen (vier Konzentrationen jedes der unbehandelten PBW und CuO-NP-behandelten Medien) in den Machbarkeitsstudien. Übersichten über die Lösungen sind wie folgt:
    1. Für EMEM-1x Steuerung erwerben essentiellem Eagle-Minimalmedium (EMEM-1x) mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat bereits hinzugefügt. Hinzuzufügen fötalem Rinderserum (FBS) Und Antibiotika, den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: EMEM-1x wird verdünnt, um die geeignete Konzentration für das Zellwachstum und die L-Glutamin und Natriumbicarbonat bezogen. EMEM-1x erfordert die Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) und einem Antibiotikum Mischung von Penicillin und Streptomycin (50 IU / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin). EMEM-1x als Steuermittel verwendet, da es vom Hersteller empfohlenen Wachstumsmedien für beide Zelltypen in dieser Studie verwendet. Konzentrierte EMEM-10x ist mit RO-Wasser aus der Anlage oder unbehandelt oder CuO-NP-behandelten PBW verdünnt, um die Testlösungen herzustellen. Konzentrierte EMEM-10x zum Zeitpunkt des Kaufs nicht L-Glutamin oder Natriumbicarbonat so dass diese zusätzlich zu dem fötales Rinderserum (FBS) und einem Antibiotikum Mischung aus Penicillin und Streptomycin zugesetzt enthalten.
    2. Für die RO Kontrolllösung verwenden RO Wasser aus der ISR-Anlage gesammelt. Verwenden Sie das gleiche Protokoll wie die PBW Testmedien ersetzen, nur 100% RO water von der ISR-Anlage anstelle von PBW. Um den unbehandelten und CuO-NP-behandelten Lösung Gebrauch RO oder ultrareines Wasser aus dem Labor zu verdünnen.
    3. Verdünnter unbehandeltem PBW in vier Testkonzentrationen vor der Vermischung mit den Zellkulturmedienkomponenten. Bereiten Sie die vier verschiedenen Konzentrationen von unbehandelten PBW Lösungen durch Mischen von unbehandelten PBW mit RO (aus dem Labor) in den folgenden Kombinationen: 100% (reine PBW + nein RO Wasser), 75% (187,5 ml PBW + 62,5 ml RO-Wasser), 50% (125 ml PBW + 125 ml RO-Wasser) oder 25% (62,5 ml PBW + 187,5 ml RO-Wasser).
    4. Verdünnter CuO-NP behandelt PBW in vier Testkonzentrationen vor der Vermischung mit den Zellkulturmedienkomponenten. Bereiten Sie die vier verschiedenen Konzentrationen von CuO-NP behandelt PBW Lösungen durch Mischen PBW (vorbehandelt mit 1 mg / ml CuO-NP für 30 min) mit RO (aus dem Labor) in folgenden Kombinationen: 100% (reine CuO- NP-behandelten PBW + nein RO Wasser), 75% (187,5 ml CuO-NP-behandelten PBW + 62,5 ml RO-Wasser), 50% (125ml CuO-NP-behandelten PBW + 125 ml RO-Wasser) oder 25% (62,5 ml CuO-NP-behandelten PBW + 187,5 ml RO-Wasser).
  2. Vorbereitung 250 ml RO + Medien unbehandeltem PBW + Medien und CuO-NP behandelt PBW + Medienkonzentration durch Zugabe von 25 ml konzentrierter EMEM-10x bis 190 ml des 100% RO und 100%, 75%, 50% oder 25% der vorgefertigten unbehandeltem oder CuO-NP behandelt PBW-Konzentrationen in Schritt 6.1.3 und 6.1.4 erstellt.
  3. Der pH-Wert jeder Lösung auf 7,4 mit NaOH oder HCl.
  4. Ergänzen Konzentration von unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW sowie RO + Medien mit den folgenden Standardkomponenten: 25 ml (10%) fötales Rinderserum (FBS), 2,5 ml L-Glutamin, 0,55 g NaHCO 3 und 1,25 ml Pen / Strep (50 IU / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin).
  5. Stellen Sie die Osmolalität jede Konzentration der unbehandelten PBW + Medien, CuO-NP-behandelten PBW + Medien und RO + Medien auf 290-310 mOsm / kg durch Zugabe von RO Wasser und Maß mit einem Osmometer.
  6. Filtern sie jede Lösung mitein 0,22 um Vakuumfiltereinheit, und bei 4 ° C.
    HINWEIS: Aufgrund der leichten Schwankungen in der Menge an RO-Wasser verwendet, um die Osmolalität einzustellen, variieren endgültigen Medienkonzentrationen innerhalb von 5% liegen, mit unbehandeltem PBW + Medienkonzentrationen bei 56%, 44%, 29% und 16,5% und CuO-NP- behandelt PBW + Medienkonzentration auf 53%, 45%, 30% und 17%.

6. Zelllebensfähigkeit

HINWEIS: Da die Nieren und Leber sind die Zielorgane der Toxizität von Schwermetallen, beschäftigen kultivierten menschlichen embryonalen Nieren (HEK293) Zellen (HEK) und die menschliche Leberzellkarzinom (HepG2) Zellen (HEP) Prüfverfahren 24-26.

  1. Bereiten Sie eine Kultur der HEK und HEP-Zellen 2-3 Tage vor dem Beschichten der Platten mit 96 Vertiefungen in dem Experiment den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
  2. Messen der Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der 3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay.
    HINWEIS: Der MTT-Assay-Protokoll wurde von Mee modifizierterloo et al. (2011) 27.
    1. Erhalten MTT in Pulverform. Hinzufügen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um eine Stammkonzentration von 50 mg / ml. Man schüttelt die Lösung für 2 Stunden und dann mit einer 0,45 um Spritzenfilter und Aliquots in 1,5 ml Gefrier sichere Rohre filtern. Schützen Rohre von Licht und bei 4 ° C.
  3. Entfernen HEK und HEP-Zellen aus ihren Kulturschalen mit Trypsin, Zentrifuge bei 1.000 xg für 5 min und dekantiert die Trypsin. 5 ml PBS und mischen Zellen, um eine Einzelzelllösung zu erhalten. Dann gelten 20 ul der einzelnen Zelllösung zu einem Hämocytometer, um eine Zellzahl pro Milliliter der Lösung zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 1.000 xg für 5 min und dekantieren die PBS verwendet, um die Zellen zu spülen. Fügen Sie die entsprechende Menge an EMEM-1x um die Konzentration der Zellen auf 500 Zellen einstellen / 100 ul (100 ul / Vertiefung).
  4. Füllen Sie die Perimeter Vertiefungen der Platte mit 200 ul PBS, um für die Verdampfung zu steuern.
  5. Seed-Zelles bei einer Dichte von 500 Zellen / Well die Zugabe von 100 & mgr; l zu jeder Vertiefung, mit Ausnahme der Umfangsvertiefungen (die nicht mit Zellen plattiert sind).
    HINWEIS: Beimpfungsdichte für HEK und HEP-Zellen basiert auf experimentellen Wachstumskurven, die die Spitze des Wachstums auf etwa 4-5 Tage auftreten erlauben. Bereiten Wachstumskurven für alle Zelllinien zu Aussaatdichte zu schätzen.
  6. Zellen einer Inkubationszeit von 24 h bei 37 ° C so dass sie (Form durch straffe Verwachsungen an der Platte), bevor Basis MTT Lesungen Zelldichte zu erholen.
  7. Zuführen Basis MTT Ablesungen Zelldichte durch Entfernen der Aussaat Medien aus der ersten Kolonne (ohne den Umfang), und die Zugabe von 100 ul MTT (5 mg / ml in Medium) zu den Vertiefungen für 1 Stunde.
  8. Nach einer Stunde, entfernen Sie das MTT und fügen Sie 100 ul Dimethylsulfoxid (DMSO), um die MTT-Formazan von lebensfähigen Zellen (20 min) hergestellt aufzulösen.
  9. Optische Dichte (OD) der ersten Kolonne bei einer Absorptionswellenlänge von 570 nm, um eine Basis zu erhalten,Linie Lese.
    1. Verwenden Basismesswerte, um sicherzustellen, alle Platten wurden korrekt und ausgesät, dass Zellen stetig wachsende zwischen den Platten. Entfernen Sie das DMSO aus der Säule ist vor Inkubation der nächsten 24 Stunden geprüft.
      HINWEIS: Wenn DMSO ist in der Platte über Nacht stehen gelassen zieht Feuchtigkeit von der benachbarten Spalte, was zu einer Verringerung des Medienvolumens.
  10. Wärmen Sie die Testlösungen (dh die EMEM-1x, RO, unbehandelte PBW und CuO-NP-behandelten PBW-Media-Lösungen) auf 37 ° C im Wasserbad.
  11. Entfernen der Aussaat Medien aus dem Rest der Platte (ohne den Umfang oder die erste Spalte, die für die Basislese verwendet wurde) und mit 100 & mgr; l EMEM-1x, RO + Medien, unbehandeltem PBW + Medienkonzentrationen oder CuO-NP ersetzt behandelten PBW + Medienkonzentration (eine Lösung pro Platte). Zellen in ihrem Testkonzentrationen oder Kontrolllösungen Inkubation für insgesamt sieben Tage (Tage 2-8).
    HINWEIS: Es gibt 10 Platten insgesamt: 1 EMEM-1x, 1 RO + Medien, 1 jedes unbehandelten PBW + Medienkonzentration (56%, 44%, 29% und 16,5%) und eine Platte jedes CuO-NP-behandelten PBW + Medienkonzentration (53%, 45% , 30% und 17%) pro Experiment pro Zelllinie.
  12. Jeder Tag nach Baseline-MTT Lesen, entfernen Sie die Kontroll- und Testlösungen (in der Note unter 6.11 aufgeführten) von der nächsten Spalte der jeweiligen Platte (zB Tag 2 Test- und Kontrollmedien von Zeile 3 entfernt, Brunnen BG, Tag 3: Zeile 4. Brunnen BG etc.) und wiederholen die MTT-Protokoll wie in den Schritten 6,7-6,9 oben beschrieben.
  13. Wiederholen Sie die Protokoll täglich für sieben Tage. Der Mittelwert der OD Ergebnisse für jede Zeile (6 wells) und gegen die Zeit berichtet, dass eine Sieben-Tage-Wachstumskurve zu erzeugen.
  14. Um die Wirkung von Kupfer Chelat auf die Lebensfähigkeit der Zellen in beurteilen CuO-NP behandelt PBW + Medien nach dem gleichen Verfahren wie oben, mit der Ausnahme, werden 100 & mgr; M D-Penicillamin zu steuern und Testlösungen vor der Zugabe der Lösungen zu ihren jeweiligen Platten. Führen Sie die Daten anallyse mit wissenschaftlichen Grafik-Software.

7. Geochemische Modellierung

  1. Download Visual MINTEQ Version 3.0 / 3.1 eine Freeware von der folgenden Website http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
    Hinweis: Visual MINTEQ ist ein Freeware chemischen Gleichgewichtsmodell für die Berechnung von Metall Speziation, Löslichkeitsgleichgewichte, Sorption usw. für natürliche Wässer. Darüber hinaus ist es verwendet wird, um die Speziation, Ionenaktivitäten, Ionenkomplexe und Sättigung Indizes, die zu der Konzentration der Elemente vor und nach der Behandlung (Massenspektroskopie ergibt) verglichen wird, um die möglichen Mechanismen der Elemententfernung 28 zu untersuchen zusagen.
  2. Das Programm zu öffnen und geben die Massenspektroskopiedaten aus Schritt 4, einschließlich pH, ​​Alkalinität und die Konzentrationen von verschiedenen Elementen in das Programm.
    HINWEIS: Da das Grundwasser während der in situ oxidiert uranium Extraktionsverfahren verwenden oxidierten Spezies von Arsen, Vanadium und Uran für die Eingabe.

8. Hemmkonzentration 50 (IC 50)

  1. Berechnen Sie die IC 50 für die unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW + Medienkonzentration durch Mittelung des ersten Lebensfähigkeit (OD-Mittelwerte) am Tag 5 der drei Läufe.
  2. Subtract Tag fünf Lebensfähigkeit Mittelwerte der unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW + Medienkonzentrationen von Tag fünf Lebensfähigkeit Durchschnittswerte von EMEM-1x Rentabilität Unterschiede zu berechnen. Dann teilen Sie die Lebensfähigkeit Unterschiede durch die durchschnittliche Rentabilität an Tag 5 in EMEM, und mit 100 multipliziert, um die prozentuale Hemmung zu erhalten.
  3. Subtrahieren Sie die prozentuale Hemmung von 100 (EMEM-1x Lebensfähigkeit), um die prozentuale Lebensfähigkeit für jede unbehandelte und CuO-NP-behandelten PBW + Medienkonzentration zu erhalten.
  4. Eingang in die wissenschaftliche Grafik-Software, indem Sie EMEM-1x in einer Konzentration von einem Prozent und einer Tragfähigkeit von 100; verwandeln alle Konzentrationen in logSkala (X = Log (X)) und durchzuführen, nichtlineare Regression mit kleinsten Quadrate-Analyse.

9. Datenanalyse

  1. Konzentrationen der Elemente in unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW Vergleichen Sie mit einem zweiseitig, paarweise, Student T-Test.
  2. Berechnen Sie die Flächen unter der Kurve (AUC) mit Hilfe der Wachstumskurve Daten über sieben Tage gesammelt und analysiert die Varianz mit wiederholten Messungen Varianzanalyse (ANOVA), durch Tukey post hoc Vergleich zwischen allen Gruppen gefolgt (n = 3).
  3. Berechnen Sie die IC 50 unter Verwendung von Daten von Tag fünf der Wachstumskurve sowohl für unbehandelte und CuO-NP-behandelten PBW + Media-Lösungen (oben beschrieben). P-Werte <0,05 als signifikant angesehen werden.
    HINWEIS: Für die Zwecke der statistischen Analyse wurde Massenspektroskopie Werte der Hälfte der Nachweisgrenze, um Ionen-Konzentrationen Ebenen unterhalb dieser Grenze 29 zugeordnet.

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Ergebnisse

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PBW Komponentenkonzentrationen und pH-Wert in unbehandelten und CuO-NP behandelt PBW sind in Tabelle 1 angegeben. Martinson und Reddy (2009), berichtet, dass der Ladungsnullpunkt der CuO-NP wird bei 9,4 ± 0,4 geschätzt. Da der pH-Wert der PBW war 7,2-7,4, unter diesen Bedingungen Wasser spendet Protonen auf CuO-NPs, wodurch die Oberfläche der Nanopartikel, um positiv geladene dauern, um die Adsorption von negativ geladenen Spezies. CuO-NP Behandlung entfernt Verunreinigungen aus Priorität PBW einschließ...

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Diskussion

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Frühere Studien berichteten, dass CuO-Nanopartikel entfernt Arsen aus Grundwasser 11,13,30,31. Diese Studie unterstützt diese früheren Ergebnisse und berichtet, dass CuO-Nanopartikel zu entfernen zusätzliche Verunreinigungen von PBW auch. Diese Studie bestätigt auch früheren Berichten, dass CuO-NPs sind wirksam bei der Entfernung von Arsen, trotz der Anwesenheit von anderen Verunreinigungen und mögliche Konkurrenzionen 11. Speziation Modellierung vorhergesagt, dass 97% der Vanadiumspezies in PBW ne...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Roger Hopper und dem Wyoming Department of Agriculture, Analytical Services Lab für die massenspektroskopie Analyse unserer Proben. Wir möchten uns bei der School of Pharmacy der University of Wyoming dafür bedanken, dass sie uns erlaubt hat, dieses Protokoll in ihren Labors zu filmen. Wir möchten uns auch bei der Theodore O. und Dorothy S. King Stiftungsprofessur für ihre Graduiertenassistenz (SC), der University of Wyoming für die Unterstützung der Graduiertenassistenz (JRS) und der Science Posse (NSF GK-12 Project # 084129) für das Lehrstipendium (JRS) bedanken. Wir möchten uns auch bei Uranium One dafür bedanken, dass sie uns die Möglichkeit gegeben haben, Proben zu entnehmen und uns bei Fragen zur Seite standen. Diese Arbeit wurde von der School of Energy Resources der University of Wyoming unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CuCl2Sigma203149
BorosilikatglaskugelnVWR26396-6396 mm
SalpetersäureFisherA509-P500Spurenmetall Güteklasse
0,45 μ m SpritzenfilterFisherSLHA 033S S
10x EMEMFisherBW12-684F
Fötales RinderserumATCC30-2020
L-GlutaminFisherBP379-100
NaHCO3SigmaS5761
Penicillin/StreptomycinATCC30-2300
0,22 μ m VakuumfiltereinheitFisher09-740-28C
HEK293ATCCCRL-1573
HEPG2ATCCHB-8065
TrypsinSigmaSV3003101
MTTSigmaM2128
D-PenicillaminFisherICN15180680
96-Well-PlattenFisher07-200-92
DMSOFisherD12814
Spectra Max 190Molecular Devices
Visual MINTEQ Version 3.0KTH Royal Institute of Technology
ICP-MSAgilentDetails zu Instrumenten, Modellen und Nachweisgrenzen wurden in Reddy et al., 2013 veröffentlicht.
IC DIONEX DX 500DionexDetails zu Instrumenten, Modellen und Nachweisgrenzen wurden in Reddy et al., 2013 veröffentlicht.
VWR InkubatorVWR

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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