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Methodenartikel

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

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DOI:

10.3791/52730

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24. Juni 2015

 ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Science, Stony Brook University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben ein gen-chimäres Präparat des ventralen Hippocampus-Accumbens-Schaltkreises in vitro entwickelt, das eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um präsynaptische Mechanismen der durch nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) vermittelten synaptischen Übertragung zu analysieren. Dieses Präparat bietet auch einen informativen Ansatz zur Untersuchung der prä- und postsynaptischen Mechanismen der synaptischen Plastizität.

Zusammenfassung

Anhaltende Verstärkung der axonalen Signalübertragung und erhöhte Neurotransmitterfreisetzung durch die Aktivierung präsynaptischer nikotinischer Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) ist ein wichtiger Mechanismus für die Neuromodulation durch Acetylcholin (ACh). Die Schwierigkeit des Zugangs zur Untersuchung der Signalmechanismen in intakten Axonen und an Nervenendigungen sowohl in vitro als auch in vivo hat die Fortschritte bei der Untersuchung der präsynaptischen Komponenten der synaptischen Plastizität begrenzt. Hier stellen wir eine gen-chimäre Präparation des ventralen Hippocampus (vHipp)-accumbens (nAcc) Schaltkreises in vitro vor, die eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um sowohl die prä- als auch die postsynaptischen Komponenten der Übertragung zu analysieren und gleichzeitig das genetische Profil der prä- und postsynaptischen Neuronen selektiv zu variieren. Wir zeigen, dass Projektionen von vHipp-Mikroschnitten als präsynaptischer axonaler Input mehrere, zuverlässige glutamaterge Synapsen mit postsynaptischen Zielen, den dispergierten Neuronen von nAcc, bilden. Die präsynaptische Lokalisation verschiedener Subtypen von nAChRs wird detektiert und die präsynaptische nikotinische Signalübertragung wird durch gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Live-Zell-Bildgebung überwacht. Dieses Präparat bietet auch einen informativen Ansatz zur Untersuchung der prä- und postsynaptischen Mechanismen der glutamatergen synaptischen Plastizität in vitro.

Einleitung

Cholinergen Modulation Schaltung Erregbarkeit trägt zur grundlegenden Aspekte des Erkennens und verändert cholinergen Modulation ist eine Funktion von neurodegenerativer und neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Schizophrenie und Sucht 1-4. Eine etablierte Mechanismus der cholinergen Erleichterung der synaptischen Übertragung im ZNS ist über eine direkte Aktivierung von nAChR in präsynaptischen Websites lokalisiert. Aktivierung dieser präsynaptischen Rezeptoren führt zur intrazellulären Ca 2+ ([Ca 2+] i) in präsynaptischen Terminals erhöht - sowohl direkt, aufgrund der relativ hohen Calcium Leitfähigkeit bestimmter nAChR-Subtypen, und indirekt über die intrazellulären Signalkaskaden 5, wodurch die Freisetzung von Neurotransmittern. In der Tat hat die Aktivierung der präsynaptischen nAChRs mit Veränderungen in der Freisetzung von einer Vielzahl von Neurotransmittern wie Glutamat, GABA, Acetylcholin, in Verbindung gebracht worden einnd Dopamin 6-10. Obwohl dieser Prozess wurde indirekt mit elektrophysiologischen Methoden an verschiedenen Synapsen untersucht, optische Reportern von [Ca 2+] i und synaptischen Vesikel-Recycling ermöglichen mehr direkte und zeitlich präzise Messung der präsynaptischen Phänomene.

Präsynaptischen Lokalisation nAChRs überzeugend mit direktem Immunogold-Markierung von nAChR in der elektronenmikroskopische (EM) Ebene 11,12 demonstriert. Mehrere andere Verfahren wurden ebenfalls verwendet, um die Lokalisierung nAChR indirekt zu adressieren, einschließlich Erfassen Standorte nAChRs subunit- fluoreszierendes Protein-Chimären in kultivierten Neuronen 13,14, elektrophysiologischen Aufzeichnung von nAChR Ströme in synaptische Anschlüssen 15,16, Überwachung Nikotin induzierte Veränderungen von [Ca 2+] i in synaptischen Nervenendigungen durch Live Cell Imaging 17 und indirekte Überwachung der Freisetzung von Neurotransmittern im synaptischen Terminal durchLive Cell Imaging-Techniken mit Fluoreszenzindikatoren, einschließlich Exozytose synaptischer Vesikel durch styryl amphipathischen FM Farbstoffe (FM1-43 und FM4-64) und / oder synapto-pHluorin und durch spezifische fluoreszierende Neurotransmitter Reportern, wie CNiFERs für ACh und iGluSnFr für Glutamat angesehen 18-20. Insgesamt sind diese aktuelle Ansätze zur Identifizierung von präsynaptischen Lokalisierung nAChRs sind kompliziert und erfordern spezielle Systeme und Techniken, um eine zuverlässige Identifizierung und physiologische Überwachung der präsynaptischen Aktivität zu ermöglichen.

Hier beschreiben wir Protokolle und Ausrüstung für die in vitro Co-Kultursystem eines ventralen Hippocampus (vHipp) - Nucleus accumbens (NAKR) Schaltung, die einen direkten Zugang zu identifizieren und zu analysieren, sowohl vor als auch postsynaptischen Komponenten der synaptischen Übertragung bietet. Wir zeigen Beispiele von präsynaptischen Lokalisierung nAChRs und Live Cell Imaging von nAChR vermittelte Ca 2+ Signalisierung und die Freisetzung von Neurotransmittern along vHipp Axone. Eine natürliche (und unkompliziert) Erweiterung der hier vorgestellten Protokoll ist die Herstellung von Pre- und Post-synaptische Kontakte von Nervenzellen aus unterschiedlichen Genotypen besteht. Auf diese Weise wird der Beitrag eines bestimmten Genprodukts an der Vor- und / oder postsynaptische Mechanismen der Modulation kann direkt bewertet werden.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt (NIH Publications No. 80-23, überarbeitet 2012) und Studien wurden von Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden für Forschung Ausschüsse at Stony Brook University (# 1618 und # 1792).

1. vHipp-NACC Synaptic Co-Kulturen

  1. Sacrifice Mäuse (postnatalen Tag 0-3, aus Wildtyp (WT) oder α7 nAChR transgene Mauslinie) mit CO 2. Enthaupten jeder Welpe und speichern Sie das Heck in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für post facto Genotypisierung. Führen Sie folgende Schritte in einem sterilisierten Kapuze.
  2. Entfernen Sie die Oberseite des Schädels mit Schere und Pinzette, um das gesamte Gehirn aus. Beginnend an der Verbindungsstelle, wo die zerebralen Kortex Teil voneinander kaudal, erhalten einen Frontalschnitt, der die hinteren Kortex einschließlich der vHipp 5,21 unter einem Binokular enthält.
  3. Sezieren vHipp Gewebestreifen, die die CA1-Region subiculum gemäß einem entwickelnden Mausgehirnatlas 22 (Figur 1A). Übertragung auf eine 35 mm Kulturschale mit kaltem Kulturmedien (4 ° C), in kleine dünne Scheiben (ca. 100 & mgr; m × 100 & mgr; m microslices) geschnitten.
  4. Pre-inkubiere 12 mm Poly-D-Lysin / Laminin beschichteten Deckgläschen Inneren 24-Well-Gewebekulturplatten mit Kulturmedien (~ 500 & mgr; l) für mindestens 30 min im Brutschrank bei 37 ° C. Entfernen Sie das Medium vor dem Ausplattieren microslices.
  5. Platte mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette in der Mitte des Deckglases mit einer minimalen Menge an Medium (~ 50 & mgr; l, enthaltend ~ 20 Stücke microslices), um die Befestigung der Explantate erleichtern. Platte vHipp microslices aus einer tierischen Ursprung (entweder der + / + oder - / - Genotyp der transgenen α7 Linie) für jedes Deckglas.
  6. Nachdem die Explantate auf das Deckglas absetzen, sanft fügen Sie zusätzliche Medien (~ 100 & mgr; l) von the Wand, so dass der Pegel des Mediums hoch genug ist, um die Explantate am Umfang vollständig abdecken, nicht aber die in der Mitte des Deckglases.
  7. Nach einer O / N Inkubation in 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator, zerstreuen NACC Neuronen von embryonalen Tagen 18 bis postnatalen Tag 1 WT-Mäusen und zu den Explantaten.
    1. Sezieren NACC Gewebe gemäß einer entwickelnden Mausgehirnatlas 20 (1B).
    2. In kleine Stücke geschnitten (ca. 500 & mgr; m × 500 & mgr; m microslices) aufnehmen und in einem 15-ml-Tube.
    3. Behandlung mit 0,25% Trypsin (2 ml) für 15 min bei 37 ° C. Dreimal mit kaltem Waschmedien (5 ml, 4 ° C), gefolgt von einer Wäsche in kaltem Kulturmedium (5 ml, 4 ° C) Waschgewebebrocken. Erlauben Suspension für 5 Minuten in jedem Waschschritt ausruhen und dann abgießen Stand vorsichtig.
    4. Dissoziieren Zellen durch vorsichtiges Zerreiben in 2 ml Kulturmedium mit einem leicht feuerpolierten Pasteur-Pipette.
    5. Transfer Zellsuspension in einen anderen 15 ml-Tube und Zentrifugation bei 2.000 x rpm für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in Kulturmedium bei 1 ml pro 6 Welpen. Zerstreuen Zellen durch vorsichtiges Pipettieren in Medien mehrmals mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette.
    6. Zugabe von 0,25 ml dispergiert NACC-Zellen zu jedem Deckglas mit vHipp Explantate.
    7. Aufrechtzuerhalten, die Kulturen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Zeigen Kulturplatten auf gedämpft steriler Gaze-Pads, um mechanisch zu stabilisieren und zu pflegen Feuchtigkeit, Synapsenbildung zu erleichtern.

2. Immunocytochemistry

  1. Fix Kulturen (5 - 7 Tage die in vitro) in 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose / PBS (~ 500 & mgr; l pro Deckglas, 20 min, RT).
  2. Permeabilisieren Kulturen mit 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 & mgr; l pro Deckglas, 5 min, RT).
  3. Block Kulturen mit 10% normalem Eselserum in PBS (~ 500 & mgr; l pro Deckglas, 30 min, RT) vor Antibody Färbung. Inkubieren mit primären Antikörpern O / N bei 4 ° C. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörpern: anti nAChRs (α 4 -ECD 1: 500; anti-α-Untereinheiten 5, 1: 500), anti-vesikulären Glutamattransporter 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
  4. Waschen Sie primäre Antikörper mit PBS (3 mal / ~ 500 ul pro Deckglas, 5 min) und dann inkubieren Kulturen in Sekundärantikörper Alexa 488 konjugierten (~ 500 & mgr; l pro Deckglas, 1: 500) oder Alexa 594 (~ 500 & mgr; l pro Deckglas , 1: 500) für 1 h bei 37 ° C.
  5. Vor der Fixierung für Etikettieroberfläche α7 * nAChRs für 45 min bei 37 ° C: Kulturen in αBgTx Alexa 594 konjugiert inkubieren (1000 in Kulturmedien ~ 500 ul pro Deckglas 1).
  6. Halterung und Dichtung Deckgläser.
  7. Machen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Plan-Apochromat Objektive (20x mit 0,8 NA oder 63X Öl mit 1,4 NA) ausgestattet und einer CCD-Kamera.

3. FM1-43 Based Vesicular Fusion

  1. Pflegen Kulturen (5 - 7 Tage die in vitro) in einem bildgebenden Kammer, montieren Sie die Kammer auf Spinning Platten konfokalen Mikroskop. Kontinuierlich durchströmen (1 ml / min) mit HBS-Cocktail bei RT.
  2. Stoppen Perfusion und Last Kulturen mit 10 & mgr; M in 56 mM FM1-43 K + ACSF (~ 500 & mgr; l) für 90 sec (Färbung), waschen externen Farbstoff entfernt 15 Minuten mit Ca 2+ frei HBS, enthaltend ADVASEP-7 (0,1 mm) membrangebundene FM1-43 abzufangen.
  3. Stimulieren die Kulturen mit 56 mM K + ACSF (~ 500 & mgr; l) ohne FM1-43 für 120 sec (Entfärben), laden Kulturen mit FM1-43 unter den gleichen Bedingungen und nachwaschen mit Ca 2+ frei HBS, enthaltend ADVASEP-7 15 min.
  4. Erwerben FM1-43 Fluoreszenzbilder mit sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop mit einem Plan-Apochromat Objektiv (60X Wasser mit 1,4 NA, Anregung 488 nm, Emission 530 nm) und die Aufnahmen mit einer CCD-Kamera ausgestattet.
  5. Sammeln Basis FM1-43 Fluoreszenzbilder (alle 2 s 1 min) Als Pre-Nikotin-Steuerung; gelten Nikotin (1 uM) durch schnelle Durchblutung (2 ml / min) für 1 min, und dann waschen Nikotin mit HBS-Cocktail. Halten Sie Capture-Zeitraffer-Bilder vor, während und nach dem Nikotin-Anwendung alle 2 Sek 5 Min.
  6. Quantifizieren FM1-43 Fluoreszenzintensität vor (F-Färbung) und nach (F Entfärben) Nikotin-Anwendung an jedem synaptischen bouton.
  7. Berechnen Gesamtmenge an freisetzbarem FM1-43 Fluoreszenz entlang vHipp Axone durch Quantifizierung der Differenz FM1-43 Fluoreszenzintensität vor und nach dem Nikotin-Anwendung (& Dgr; F = F Färbung -F Entfärbung). Analyse Fraktion von Fluoreszenzintensitätsabnahme nach Nikotin mit der folgenden Gleichung: F = & Dgr; F% Abnahme / F-Färbung.

4. Calcium Imaging

  1. (- 7 Tage in vitro 5) schnell mit normalen HBS, dann laden Kulturen mit 5 & mgr; M Fluo-4 Ca 2+ Anzeige (Kulturen SpülenAM-Ester) und 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. Waschen Sie Fluo-4-Lösung mit HBS (3-mal / 5 min). Zurück Kulturen Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) für mindestens 30 min.
  3. Aufrechtzuerhalten Kulturen in derselben Abbildungskammer und gleichen Bedingungen wie in FM1-43 basierend Vesikelfusion Abschnitt beschrieben (siehe Schritt 3.1).
  4. Sammeln Fluo-4 Fluoreszenzbilder der axonalen Projektionen von den vHipp Mikro-Scheiben mit einem Plan-Apochromat Objektiv (60X Wasser mit 1,4 NA, Anregung 488 nm, Emission 530 nm) und einer CCD-Kamera.
  5. Sammeln Basis Fluo-4 Fluoreszenzbilder (alle 10 s für 2 min) als vorge Nikotin Steuer gelten Nikotin (1 uM) durch rasche Perfusion (2 ml / min) für 1 min, und dann waschen Nikotin mit HBS-Cocktail. Halten Sie Capture-Zeitraffer-Bilder vor, während und nach dem Nikotin-Anwendung alle 10 Sek 30 Min.
  6. Speichern Sie alle Bilder der Ausgangs Fluo-4 Fluoreszenz-Aufnahmen, Export als eine Reihe vonTIFF-Format Bilder für die weitere Analyse.
  7. Sammeln Sie die integrierte Intensität der Fluo-4 Fluoreszenz entlang vHipp Axone vor und nach Nikotin-Anwendung.
  8. Normalisieren integrierten Fluoreszenzintensität mit der folgenden Gleichung: & Dgr; F / F 0 = (FF 0) / F 0 ist, wobei F 0 die hintergrundkorrigierten vorge Nikotin integrierten Fluoreszenzintensität und F ist die integrierte Fluoreszenzintensität entlang vHipp Axone zu jedem Zeitpunkt nach Nikotin-Anwendung. Zu analysieren und zu plotten normalisierte integrierte Fluoreszenzintensität.

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Ergebnisse

Die eingesetzte Zubereitung umfasst chimäre Gen Kokulturen vHipp-NACC Schaltungen in vitro. Projektionen aus vHipp microslices ausgeht, als präsynaptischen Axon Eingang können synaptische Kontakte mit postsynaptischen Ziele, die verteilt Neuronen aus NACC machen. Nikotin induzierte eine anhaltende (≥ 30 min) Erleichterung der glutamatergen Übertragung von NACC Neuronen durch vHipp innerviert Axone 21 und verlängert Calcium-Signal entlang vHipp Axone 5 über präsynaptischen α7 nAChR *.

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Diskussion

Das Co-Kulturpräparat beschrieben re-capitulates ventralen Hippocampus-accumbens-Schaltungen in vitro. Diese Zubereitung ermöglicht relativ einfache und sichere Überprüfung der räumlichen und zeitlichen Verläufe von denen die Aktivierung des präsynaptischen nAChRs ELICIT verbesserte glutamaterge Transmission 5, 21.

Co-Kulturen werden als das Wachstum der verschiedenen spezifischen Zelltypen in eine Schüssel, die physiologischen Bedingungen in vitro zur Verfügung ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken Yehui Qin und Mallory Myers für die technische Unterstützung. Wir danken auch Dr. Sigismund Huck für die Bereitstellung des Anti-α4-ECD-Antikörpers. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt, die an L. W. R. NS22061 wurden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1. Nährmedien (50 ml)
Neurobasal GIBCO1088802248 ml
B-27 NahrungsergänzungsmittelGIBCO0080085-SA1 ml
Penicillin-StreptomycinGIBCO10908-0100,5 ml
GlutaMAX NahrungsergänzungsmittelGIBCO35050-0610,5 ml
Neurotropher Faktor des Gehirns (BDNF)GIBCO15140-12220 ng/ml
2. Waschmedien (HBSS, 100 ml)
HBSS, kein Calcium, kein Magnesium, kein PhenolrotGIBCO14175-09599 ml
HEPES ( 1M)GIBCO15630-1301 ml
3. HEPES gepufferte Kochsalzlösung  (HBS)    pH=7,3
NaClSigmaS9888 ca. 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl2SigmaM8266 1 mM
CaCl2,SigmaC1016 ca. 2 mM
HEPESSigmaH3375 ca. 10 mM
GlukoseSigmaG0350500 ca. 10 mM
4. HBS Cocktail für Live-Bildgebung pH=7,3
NaClSigmaS9888 ca. 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl2SigmaM8266 1 mM
CaCl2,SigmaC1016 ca. 2 mM
HEPESSigmaH3375 ca. 10 mM
GlukoseSigmaG0350500 ca. 10 mM
Tetrodotoxin Tocris10782 µ M
bicucullineTocris13110 µ M
D-AP-5Tocris10550 µ M
CNQXTocris104520 & Mikro M
LY341495Tocris120910 µ M
5. Frei von Kalzium  HBS    pH=7,3
NaClSigmaS9888 ca. 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl2SigmaM8266 1 mM
HEPESSigmaH3375 ca. 10 mM
GlukoseSigmaG0350500 ca. 10 mM
6. 56 mM Kalium ACSF pH=7,4
NaClSigmaS9888119 mM
KClSigmaP933356 mM
MgSO4,7HSigmaM18801,3 mM
CaCl2SigmaC10162,5 mM
NaH2PO4SigmaS82821 mM
NaHCO3SigmaS576126,2 mM
GlukoseSigmaG0350500 ca. 10 mM

Referenzen

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