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Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von

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DOI:

10.3791/52742

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24. Juni 2015

 ,  , 
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Abbildung von Verhalten und neuronaler Aktivität über lange Zeitskalen ohne Immobilisierung des Tieres ist eine Voraussetzung, um Verhalten zu verstehen. Die mikrofluidische Kammerbildgebung (AMI) von Agarose kann verwendet werden, um die neuronale Aktivität und das Verhalten für alle Lebensstadien von Caenorhabditis elegans abzubilden.

Zusammenfassung

Verhalten wird durch das Nervensystem gesteuert. Calcium-Bildgebung ist ein einfaches Verfahren, bei dem transparenten Nematode Caenorhabditis elegans, die Aktivität von Neuronen bei verschiedenen Verhaltensweisen zu messen. Mit Verhalten korrelieren neuronale Aktivität, sollte das Tier nicht immobilisiert werden, sondern sollte in der Lage, sich zu bewegen. Viele Verhaltensänderungen während des langen Zeitskalen auftreten und erfordern über viele Stunden des Verhaltens der Aufnahme. Dies macht es auch notwendig, um die Würmer Kultur in Gegenwart von Nahrung. Wie kann Würmer gezüchtet werden und ihre neuronale Aktivität über lange Zeitskalen abgebildet? Agarose Mikrokammer Imaging (AMI) wurde zuvor die Kultur entwickelt und beobachten kleinen Larven und ist jetzt angepasst worden, um alle Lebensphasen von der frühen L1 bis zum Erwachsenenstadium C. studieren elegans. AMI kann auf verschiedenen Lebensphasen einer C durchgeführt werden elegans. Langfristige Kalzium-Imaging ohne Immobilisierung der Tiere durch kurze extern getriggert Belichtungen com erreichtmit einem Elektronenvervielfachungs charge-coupled device (EMCCD) Kameraaufnahme kombiniert. Verkleinern oder Scannen, um die Bild bis zu 40 Würmer in parallel skalieren diese Methode. Somit wird ein Verfahren zur Bildverhalten und die neuronale Aktivität über lange Zeiträume in allen Lebensstadien von C. beschrieben elegans.

Einleitung

Caenorhabditis elegans wurde als Modellsystem zur Untersuchung von Verhalten1 etabliert. Aufgrund seiner Zugänglichkeit für die Genetik können die molekularen und zellulären Mechanismen, die dem Verhalten zugrunde liegen, untersucht werden. Viele Verhaltensweisen treten auf langen Zeitskalen auf. Es gibt zwei prinzipielle Ansätze, um bewegliche Tiere über lange Zeiträume zu beobachten. Der erste Ansatz besteht darin, das Tier während der Bewegung mit einem automatisierten Tisch oder einer Kamera2-8 zu verfolgen, und der zweite besteht darin, die Bewegung auf einen Bereich zu beschränken, der mindestens so klein ist wie das Sichtfeld der Kamera9-14. Beide Methoden haben ihre Vorteile. Die Verfolgung ermöglicht es, ein Tier über große räumliche Entfernungen zu verfolgen, begrenzt jedoch die Anzahl der Tiere, die in einem Versuch erkannt werden können. Die Einschränkung der Bewegung der Tiere ermöglicht es, die Beobachtung auf viele Individuen gleichzeitig zu skalieren, indem Arrays von eingeschränkten Kompartimenten verwendet werden.

Da der Fadenwurm transparent ist, kann die Live-Fluoreszenzbildgebung nicht-invasiv durchgeführt werden15. Die Kalzium-Bildgebung liefert eine funktionelle Auslesung für die Aktivität erregbarer Zellen und ist für C. elegans16-20 etabliert. Kalzium gelangt über Kanäle in der Plasmamembran in die Zelle, die sich bei der Depolarisation öffnen. Somit fungiert Kalzium als Stellvertreter für die neuronale Aktivität. Calciumsensoren können in zwei Hauptklassen eingeteilt werden: ratiometrische und nicht-ratiometrische Sensoren. Beide Klassen verwenden Konformationsänderungen von Calcium-bindenden Proteinen, die bei der Bindung von Calcium induziert werden. Ratiometrische Sensoren enthalten zwei fluoreszierende Proteine. Wenn das Fluoreszenzprotein mit niedrigerer Wellenlänge angeregt wird, wird ein Teil der Lichtenergie in Abhängigkeit von deren Entfernung auf das Fluoreszenzprotein mit höherer Wellenlänge übertragen, und zwar in einem Prozess, der als Fluoreszenzresonanz-Energietransfer oder Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) bezeichnet wird21. Nicht-ratiometrische Sensoren basieren auf zirkulär permutiertem GFP und verwenden eine De-Quenchierung des Fluorophors, die durch Calciumbindungverursacht wird 22. Jede Klasse hat ihre Vorteile. Während ratiometrische Sensoren weniger empfindlich auf Bewegungs- oder Expressionsartefakte reagieren, haben nicht-ratiometrische Sensoren in der Regel einen höheren Dynamikbereich. Sowohl ratiometrische als auch nicht-ratiometrische Sensoren haben sich als nützlich erwiesen, um die Aktivität erregbarer Zellen in C. elegans16-20,23,24 zu untersuchen.

Bei der Langzeit-Fluoreszenzbildgebung muss sich der Experimentator mit mehreren potenziellen Herausforderungen auseinandersetzen: 1. Störung des Verhaltens durch Anregungslicht: Würmer reagieren empfindlich auf kurzwelliges Fluoreszenz-Anregungslicht und meiden Licht aus dem violetten bis blauen Bereich, das für die Kalziumbildgebung verwendet wird25,26. Würmer reagieren entweder mit einer Rückwärts- oder einer Vorwärts-Fluchtreaktion25,26. Daher muss die Lichtmenge gesteuert werden. 2. Bleichen des fluoreszierenden Sensorproteins: Oft behindert das Bleichen des fluoreszierenden Proteins die Langzeitbildgebung. Typischerweise sind jedoch die Lichtintensitäten, die zur Beobachtung des Bleachings benötigt werden, höher als die Lichtintensitäten, die störende Auswirkungen auf das Verhalten der Tiere haben. Daher ist das Bleichen bei dieser Art der Kalziumbildgebung nur ein theoretisches Problem. 3. Würmer in den Mikrokammern sind nicht fixiert und bewegen sich während des Wachverhaltens ständig, und Bilder können verschwommen erscheinen, wenn der Wurm nicht immobilisiert ist. All diese Herausforderungen lassen sich durch extrem kurze Belichtungszeiten bei geringer Lichtintensität lösen. Dies kann durch den Einsatz einer hochempfindlichen EMCCD-Kamera mit kurzen Belichtungszeiten und externer Triggerung einer Leuchtdiode (LED) realisiert werden. Um die Würmer so kurz wie möglich (nur während der Belichtungszeit der Kamera) dem Beleuchtungslicht auszusetzen, wird die LED extern über ein Transistor-Transistor-Logik-Signal (TTL) getriggert, das die Kamera während der Belichtung aussendet, was zu einer Beleuchtung des Wurms genau für die Zeit führt, in der der Kamerachip belichtet wird. Dies bedeutet auch, dass der EMCCD-Chip beim Auslesen der Daten dunkel wird, was für die Ausleseleistung dieses Chips optimal ist.

Zuvor wurden Agarose-Mikrokammern für die Langzeit-Fluoreszenzbildgebung von C. elegans-Larven entwickelt9. Hier wird beschrieben, wie Agarose-Mikrokammern für die Langzeit-Calcium-Bildgebung für jedes Lebensstadium von C. elegans verwendet werden können, wie Calcium-Imaging durchgeführt werden kann und wie diese Methode hochskaliert werden kann, um viele einzelne Würmer parallel zu untersuchen.

Protokoll

1. Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte

  1. Verwenden Sie ein Mikroskop, das in der Lage, halten die Probe im Mittelpunkt steht und der mit einem automatischen Bühne ausgestattet. Erstellen Sie eine maßgeschneiderte Deckelheizung oder Kommerzielle Lösung. Einrichtung eines LED-EMCCD-Kamera-System, in dem die Belichtung der Kamera löst durch ein TTL-Signal LED-Beleuchtung mit den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Lesen Sie Diskussionen für Details.
  2. Polydimethylsiloxan (PDMS) Briefmarken:
    1. Herstellung PDMS-Stempel in einem Mikrofluidik-Anlage oder die von einem kommerziellen Gießerei produziert PDMS-Stempel. Um Kommerzielle Gießerei nutzen, senden Sie eine AutoCAD-Datei an das Unternehmen und geben Sie die Tiefe (15 & mgr; m, zum Beispiel) des Gerätes. Nach der Lieferung aus der Gießerei, schneiden Sie die PDMS-Chips in ihre 16 Marken mit einem Skalpell.
    2. Binden jeden einzelnen Stempel auf einem Glasobjektträger mit Luftplasma. Zum Kleben, aussetzen sowohl die PDMS-Stempel und die Objektträger an der Luft-Plasma für einRunde 1 min (mit den höchsten Plasma Einstellungen bei 0,5 mbar). Stellen Sie sicher, dass die Oberflächen für die Verklebung nach oben zeigen während der Plasmabehandlung. Dann legen Sie die PDMS-Stempel auf den Objektträger.
  3. Werfen Sie einen 3,5 cm Bodenschale und schneiden Sie eine quadratische Fläche von 18 x 18 mm von der Mitte der Boden der Schale mit einem Vertikal-Fräsmaschine und scharfe Schneidrollen. Verwenden niedrige Drehgeschwindigkeit des Schneiders und langsamen Vorschub um den Kunststoff vor dem Schmelzen aufgrund der Wärme durch Reibung erzeugt verhindern. Bereiten Sie verschiedene Gerichte auf einmal.
    Hinweis: Die Bodenschale kann viele Male nach dem Experiment wiederverwendet werden, wenn sie nach dem Einweichen in reinem Ethanol O / N wird gereinigt.
  4. Agarose:
    1. Man löst 3 g hochschmelzender Agarose in 100 ml S-Basal (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml Cholesterin (5 mg / ml in Ethanol), H 2 O auf 1 L, durch Autoklavieren sterilisieren) durch Kochen. Machen Sie Teilmengen der gelösten Agarose in 2 ml Eppendorf-Röhrchen und store. Auch bereiten eine Charge von niedrig schmelzender Agarose genau der gleichen Weise wie die hochschmelzender Agarose.
    2. Vor der Verwendung legen 3 Teilmengen von hochschmelzenden Agarose auf einen Heizblock bei 95 bis 98 ° C. Vor der Verwendung legen Sie eine aliquote Menge von niedrig schmelzender Agarose auf einem Heizblock bei 95 - 35 ° C - 98 ° C, bis es bei 30 auf einen Thermoblock geschmolzen und dann.

2. Auswahl der Tiere

  1. Würmer wachsen auf einem niedrigen Dichte auf NGM-Platten ausgesät, um saubere Tiere zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass es reichlich zu essen und nur wenige Tiere auf dem Teller.
  2. Für die Bildgebung L1-Larven, Transfer ca. 30 Eier enthält Embryonen im Stadium Brezel auf eine frische ausgesät NGM Platte. Für die Übertragung von späteren Larvenstadien oder Erwachsener C. elegans, Transfer ca. 30 Würmern auf eine frische ausgesät NGM Platte.

3. Herstellung von Agarose Mikrokammern

  1. Vorbereitung der Schale:
    1. Nehmen Sie eine Plastikschale mit einer quadratischen Öffnung von 18 x 18 mm am Boden und legen Sie sie auf den Kopf mit der Öffnung nach oben. Schließen Sie die Öffnung, indem Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband von 20 x 20 mm auf die Öffnung. Drehen Sie den Teller um, so dass das Klebeband auf der Unterseite und die Schale auf eine harte Oberfläche. Schneiden Sie die Öffnung frei mit einem Skalpell.
    2. Unter Verwendung einer Pipette P1000, füllen 2 ml 3% hochschmelzender Agarose in S-Basal in die Schüssel. Legen Sie die Agarose auf den Bereich, der die Öffnung umgibt, und lassen Sie festigen. Warten Sie, bis die Agarose fest.
    3. Drehen Sie sich um die Schüssel und ziehen Sie die Schutzfolie, die die doppelseitige Klebeband umfasst, so dass die Klebeseite wird auf dem Teller bleiben und ausgesetzt werden.
      Hinweis: Dadurch wird ein feiner Ring aus Klebeband der Außenseite der Öffnung zu umgeben. Die Agarose dient als Feuchtigkeitsspeicher, der später zu umgeben die Probe.
  2. Casting von Mikrokammern:
    1. Expose the PDMS Oberfläche zum Formen mit Luft-Plasma für 20-60 sec.
      Hinweis: Diese Plasmabehandlung macht die PDMS Oberfläche hydrophil, was das Einfangen von Luftblasen verhindert und schärfere Ausdrucke.
    2. Konstruieren Sie zwei Abstandshalter von gleicher Höhe durch Stapeln 5-9 Objektträger aus Glas. Findet, die parallel zu ihren Längsseiten, die erste Abstandsstapel hat, kann eine Glasplatte, dann wieder einen Spacer Stack. Setzen Sie den Glasobjektträger, die die PDMS-Stempel orthogonal über den Abstandshaltern enthält. Einstellen der Höhe der Abstandshalter, so dass es einen Abstand von ungefähr 1,5 mm zwischen der Formoberfläche der PDMS-Stempel und dem einzigen Glasträger.
    3. Geben Sie einen Tropfen heißen Flüssigkeit mit hohem Schmelzpunkt Agarose auf die einzelnen Objektträger in der Nähe der PDMS-Stempel und schnell schieben Sie die PDMS-Stempel vertikal in die Flüssigkeit Agarose. Lassen Sie die Agarose fest werden. Überprüfen Sie, ob es ein opakes Aussehen, die in der Regel dauert ca. 2 min bekommt. Ziehen Sie den Stempel vertikal mit einem Zug.
      Hinweis: Es ist bequem, glue der Abstandshalter gleitet zusammen mit doppelseitigen Klebeband. Die Vertikalbewegung des Stempels verhindert Luftblasen am Anfang in der Agarose gefangen.
  3. Übertragen Sie die Eier oder Würmer zusammen mit OP50 Bakterien auf der Agarose mit einem feinen Platindraht Pick. Verteilen Sie ein Ei oder ein Wurm pro Kammer zusammen mit Lebensmitteln mit der Wimper. Füllen Sie etwa 30 Eier auf einem Agarose-Pad.
  4. Schneiden Sie die Agarose-Platte, die die gefüllten Mikrokammern in ein Quadrat von etwa 15 x 15 mm, so dass es schön in die Öffnung der Schale passt. Nehmen Sie den Platz Agarose-Platte mit einer Pinzette und legen Sie sie auf den Kopf auf einem Deckglas von 20 x 20 mm. Einmal fiel, nicht heben Sie sie wieder oder schieben Sie es um, da dies kann dazu führen, die Bakterien und Würmer aus ihren Kammern geschoben werden.
  5. Montage der Schale:
    1. Legen Sie das Deckglas auf die Öffnung des Kunststoffschale. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas auf den Ring von doppelseitigen Klebeband hergestellt.Achten Sie darauf, das Glas zu brechen.
    2. Drehen Sie die Schüssel auf den Kopf und verwenden Sie eine P1000 Pipette, die Lücke zwischen dem Agar Platte mit den Mikrokammern und der Agarose Reservoir mit Flüssigkeit mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose auf etwa 30 ° C gekühlt zu füllen. Warten Sie, bis die Agarose erstarrt ist.
    3. Verschließen Sie die Schüssel mit Deckel. Für inverse Mikroskope mit einem beheizten Deckel. Für aufrechte Mikroskope mit einem normalen Deckel und verschließen Sie die Schale mit Parafilm.
  6. Nach Beendigung der Herstellung von Mikrokammern, überprüfen Sie sie unter einem Stereomikroskop. Die richtige Füllung ist von entscheidender Bedeutung. Siehe die Diskussion für Details.

4. Calcium Imaging

  1. Verwenden transgenen Stämmen, genetisch kodierte Calciumsensoren wie HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]) 27.
  2. Verwenden Sie einen zusammengesetzten Mikroskop für Weitfeld-Epifluoreszenz ausgestattet. Schließen Sie die TTL Ausgang des EMCCD KameraDie TTL-Eingang des LED, so dass jedes Mal, wenn die Kamera ein Rahmen die Probe beleuchtet wird. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von etwa 5 ms. Verwenden Sie EM Gewinn im Bereich von 50 bis 300.
  3. Geben Sie eine Burst-Film läuft 24 Stunden lang mit jeder Wurm ist alle 15 abgebildet - 30 min ersten 20 Sekunden mit DIC, dann für 20 Sekunden mit einem GFP-Fluoreszenz zu erfassen GCaMP, und dann eine endgültige Bild des mKate2 Signal wird aufgenommen Steuerung für Expressionsniveaus. Verwenden Sie eine Bildrate von 2 / sec bei jedem Burst.
  4. Für die visuelle Datenprüfung, verwenden Sie ein Falschfarbenkarte, die Sichtbarkeit von kleinen Änderungen der Fluoreszenzintensität zu erhöhen. Plot Fluoreszenzdaten & Delta; F / F, wobei F die durchschnittliche Ausgangswert der Fluoreszenz. Eine detaillierte Beschreibung der Calciumdatenanalyse sind in der Literatur 20 gefunden werden.

5. Parallel AMI von Multiple Worms

  1. Die Schale mit den Mikrokammern auf das Mikroskop, den Schwerpunkt auf die Probe und die Fest autofocus. Einrichten eines Software-Protokoll, so dass die Kamera nimmt einen Ausbruch von 40 Bildrahmen in 20 sec jede halbe Stunde für 24 Stunden, die in 1.920 Bildern pro Wurm, eine angemessene Menge von Daten führt. Einrichten der Scan, so dass es besucht jeden Wurm mit der Bühne. Ziel ist es, etwa 30 Würmer Film in einem Durchlauf.
  2. Bild mehrere Würmer durch Verkleinern, dh mit einer niedrigeren Vergrößerung. Verwenden Sie eine niedrigere Vergrößerung auf mehrere Mikrokammern mit dem Kamerachip zu decken und zu filmen mehrere benachbarte Mikrokammern gleichzeitig. Nach dem Ende der Bildaufnahme, trennen die Daten für jede einzelne Kammer, die durch Zuschneiden eines Bereichs von Interesse abdeckt einem Tier.
  3. Um die Mobilität Daten schnell zu beurteilen, verwenden Rahmen Subtraktion 28-32.

6. Imaging verschiedenen Lebensphasen von C. elegans

  1. Verwenden Agarose Mikrokammern für alle Lebensphasen von C. elegans von L1 zu Erwachsenen und einschließlich dauers. Verwenden Sie die entsprechenden Kammer Abmessungen für difschiedlichen Lebensphasen, die in Tabelle 1 gezeigt werden.
Lebensstadium Kammergröße Kammertiefe Normaler Aufnahme Vergrößerung
L1 190 x 190 um 10-15 & mgr; m Ei - Mitte L2 400X
L2 370 x 370 & mgr; m 15 & mgr; Ei - L3 200X
Dauer-Larve 370 x 370 & mgr; m 25 um 4 Tage 200X
L3 700 x 700 um 45 um L2 - L4 200X
L4 700 x 700 um 45 um junge L4 - junge Erwachsene 100X
Junge Erwachsene 700 x 700 um 45 um 12-24 h 100X

Tabelle 1 Chamber Größen für unterschiedliche Lebensphasen. Es zeigen Kammerabmessungen und Vergrößerungen, die für verschiedene Stufen für einen 8 x 8 mm-Kamerachip optimiert sind.

Ergebnisse

Agarose Mikrokammern können zu jeder Lebensphase von C angewendet werden elegans. Wie in 1A zu sehen ist, können Larvenentwicklung und Schlafverhalten während L1 lethargus beachten. Dargestellt sind die Kammergrößen 190 x 190 um, 10 um tief sind. Wenn längeren Zeitskalen erforderlich sind, können größere Kammern verwendet werden. Wie in Figur 1B zu sehen ist, mit einer Kammer mit größeren Abmessungen (370 x 370 um, 25 um tief) erlaubt die Entwicklung von C. elegans vom Ei bis zum erwachsenen. 1C zeigt eine Analyse des Langzeitverhaltensänderungen in Frame Subtraktion einer Schnecke vom Ei bis zum erwachsenen in einer Kammer aufgewachsen. Dargestellt sind mittleren Intensitäten nach Subtraktion Rahmen für ausgewählte Bursts während Gefolge und lethargus. Desto geringer ist die Durchschnittsintensität nach Rahmen Subtraktionswerte ist, desto niedriger die Mobilität des Wurms. Gezeigt, werden von einem Gefolge Zustand und einem Zustand lethargus pro Larvenstadium ausgewählt Burst-Spuren. Diebeobachteten Anstieg der Durchschnittsintensität während der Entwicklung ist vor allem auf einen erhöhten Kontrast und Größe des Tieres. 1D zeigt eine dauer Larve, eine alternative Lebensphase, die bei widrigen Umgebungsbedingungen 33 tätig ist. Kammergröße ist 370 x 370 & mgr; m, 15 & mgr; m tief. Beachten Sie, dass die dauer Larve wurde ohne bakterielle Nahrung in die Kammer eingebracht, die Ausfahrt von der dauer Larvenstadium verursachen würde. 1E zeigt einen erwachsenen Wurm, der bereits viele Eier gelegt hat, in die Kammer. Kammer Abmessungen für den Erwachsenen verwendet wurden, waren 700 x 700 um, 45 um tief. Schließlich zeigt 1F einen erwachsenen Hermaphroditen und ein männliches Gegen Inneren eines Erwachsenen Kammer.

Kalzium-Imaging in motile Würmer ist mit GCaMP Calcium-Sensoren möglich. 2A, B zeigen Kalzium-Imaging des Befehls Intern AVA für einen L1-Larve 27. 2C, D Calcium-Aktivität für die sa zeigenme Art von Neuron in einem erwachsenen Tier.

Aufstockung der langfristige Bildgebung ist durch Abtasten und durch Zoomen out möglich. 3A zeigt die Bildqualität der gleichzeitigen Darstellung von 30 Würmer auf einem Kamera-Chip mit einer 5-Megapixel-Kamera. 3B zeigt die Bildqualität von 4 Würmer Calcium gleichzeitig abgebildet.

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Abbildung 1. Die Anpassung der AMI auf alle Lebensphasen von C. elegans. (A) Larve von früh bis früh L1 L2 Phase in 190 x 190 um Kammern abgebildet. (B) Entwicklung vom Ei bis zum erwachsenen in einem 370 x 370 um Kammer. (C) Mobility eines Schnecken bewertet mit Rahmen Subtraktion. Dargestellt ist die mittlere Intensität aller Bilder von der Bildrahmen nach Subtraktion für eine ausgewählte Burst-Film für jeden Larven stage zur Folge und lethargus Verhalten. (D) A dauer Larve in der Abwesenheit von Nahrung in einem 370 x 370 um Kammer. (E) Erwachsene Zwitter mit vielen Eier in eine 700 x 700 um Kammer gelegt. (F) Mating eines Mannes und ein Zwitter in einem 700 x 700 um Kammer. YA bedeutet, jungen Erwachsenen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Calcium-Bildgebung mit AMI. (A) Calcium-Bildgebung mit GCaMP3 in der Befehlsintern AVA von L1-Larven mit Hilfe der NMR-1-Promotor. Dargestellt sind zwei Falschfarbenbilder. Im linken Bild ist die Aktivität der AVA niedrig und der Wurm nicht einen Rückwärtsbewegung. Im rechten Bild die Aktivität der AVA ist hoch ist, und die Schnecke rückwärts bewegt. (B) Calcium-Transienten über die Zeit für einen L1-Wurm. (C, D) Calcium Transienten bei einem erwachsenen Tier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Imaging mehrere Würmer parallel durch Verkleinern. (A) Einzigartige Bilder aus 30 L1 Würmer pro Bild mit 190 x 190 um Kammern und ein 100-facher Vergrößerung (unter Verwendung eines 10X-Objektiv) und eine 16,6 x 14 mm Kamerachip. (B) Gleichzeitiges Abbilden vier L3 Würmer pro Rahmen mit 370 x 370 um Kammern und 100-facher Vergrößerung und einem interessierenden Bereich eines 16,6 x 14 mm Kamera-Chip.et = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Hardware

Der Fokus des Mikroskops wird typischerweise während einer Langzeitbildaufnahme driften. Für Durchlichtmikroskope, konzentrieren Buchführung Systeme können von den großen Mikroskophersteller erworben werden. Im Falle einer Verbindung, Mikroskop mit Fokussteuerung ist zu teuer, wäre eine einfache Alternative zu einem Stereomikroskop zu verwenden. Durchlichtmikroskope ermöglichen die Verwendung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur (NA) und kann leicht automatisiert werden. 40X Öl Ziele sind gut geeignet. Wasserimmersionslinsen sind nicht ideal, da der Verdampfung während der Langzeit-Bildgebung. Differentialinterferenzkontrast (DIC) erzeugt einen schönen Kontrast, die morphologische und Verhaltensänderungen zu folgen hilft, aber einfache Hellfeldabbildung kann auch verwendet werden. Für DIC oder Hellfeldabbildung, benutzen rotes Licht, indem Sie einen Rotlichtfilter in die dia-Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops. Für das Scannen von mehreren Mikrokammern ist ein automatisiertes Stufe erforderlich. Die beste Leistung ist achieved, wenn eine Stufe verwendet wird, das nicht-lineare Beschleunigung und Verzögerung hat und kann zu geringen Scan-Geschwindigkeit eingestellt, die Tiere während des Scannens zu stören, um zu verhindern. Wir haben beobachtet, Verhaltensreaktionen oder Calcium Erhöhung mechanosensitive Neuronen (ALM und PLM) während der Abtastung, was darauf hindeutet, dass eine langsame Abtastung in der Tat nicht die mechanosensitive System der Schnecke aktiviert (Daten nicht gezeigt). Kommerzielle LED-Systemen verwendet werden. Mehrere Firmen bieten ready-to-use-Lösungen, die die LEDs mit unterschiedlichen Wellenlängen enthalten. Die LED sollte die Möglichkeit haben, von außen die Auslösung der LED mit einem TTL-Signal. Eine hochempfindliche Kamera ist für Calcium Imaging von bewegten Tieren notwendig. EMCCD- Kameras sind die empfindlichsten Kameras auf dem Markt. Die Kamera braucht, um eine TTL-Ausgang während der Exposition (auch als "Feuer" output) haben. Ein Deckelheizung erforderlich ist, um eine Kondensation auf dem Deckel zu verhindern, wenn unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Auf einem aufrechten Mikroskop, wird die Schale gelegt werden, so dass der Deckel will am Boden und somit Kondensation verhindert und kein Deckel Heizung benötigt wird. Der Deckel muss fest schließen Sie das Gericht um die Verdampfung von Wasser während der langfristige Bildgebung zu verhindern.

PDMS-Stempel

Die Oberfläche des PDMS-Stempels, der die Struktur zum Formen der Agarose enthält, wird von der Glasplatte, die die PDMS-Stempel unterstützt konfrontiert. Eine Liste mit Unternehmen, die kundenspezifische Mikrofluidik-Chips bieten auf Wikipedia gefunden werden ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Füllen der Nematoden in ihre Kammern

Dies ist der wichtigste Schritt im Protokoll und die folgenden Punkte zu beachten: a) Die Feuchtigkeit der Agarose ist von entscheidender Bedeutung für die Übertragung der Würmer und für die Bildgebung. Wenn die Agarose zu feucht ist, dh es ist eine Flüssigkeit covERING eine Fläche von mehreren Mikrokammern, wird es nicht möglich sein, bakterielle Lebens und Würmer in einer gesteuerten Weise zu verteilen, weil die Flüssigkeit macht die Bakterien wegfließen. Wenn die Agarose zu trocken ist, dann die Bakterien und Würmer nicht bekommen können aus dem Pick einfach was bedeutet, dass erhöhter Kraft muss verwendet werden, um die Würmer und Bakterien, die leicht verursacht Schäden an der Agarose fallen werden. Beim Füllen in eine Menge von Würmern die Agarose kann austrocknen. Im schlimmsten Fall wird die Agarose so trocken in dem Ende, das die Kammern zusammenbrechen können. Wenn die Agarose zu trocken ist, kann es durch Anordnen eines kleinen Tropfen (etwa 2 & mgr; l) des S-Basal auf die Seite des Chips, wo es keine Würmer rehydratisiert werden. Dann tauchen Sie den Platindraht holen in die Flüssigkeit zu ziehen und sogar ein Teil der Flüssigkeit in den Bereich, in dem die Kammern mit Würmern gefüllt. B) Die Menge der Nahrung ist entscheidend für die erfolgreiche langfristige Bildgebung. Wenn es nicht genügend Nahrung, können die Würmer aus der sie auszuführen. Bei übermäßigem Essen der Hohlraum der Kammernicht wie eine Flüssigkeit, sondern wie eine feste verhalten und ermöglicht Würmer aus der Kammer, indem die Bakterien zu entkommen. Ziel ist es, eine Bakteriensuspension, die die gesamte Kammer ausfüllt erhalten. Die Würmer sind während des Experiments konstant physischen Kontakt mit dem Agar und Glasoberfläche über den größten Teil ihrer Länge und der kriechenden Verhalten scheint ähnlich wie die Bewegung auf einen Teller und unähnlich in flüssiger Prügel zu sein. C) Mechanische Beschädigung der Agarose kann das Experiment ruinieren. Eine feine Wahl ist wichtig. Es sollte keine scharfen Kanten. Ein weiches Augenwimper an einem Pipettenspitze befestigt werden verwendet, um Bakterien oder Würmer in die Kammern anstelle der Verwendung eines Platin-Pick bewegen. In den meisten Fällen ist jedoch übertrocknete Agarose der Grund für Beschädigungen. Die Pick oder Wimpern sollte im Idealfall nur kaum berühren Sie die Agarose selbst und den Wasserfilm auf der Agarose-Oberfläche sollte Würmer und Bakterien abziehen. Beim Abdichten der Kammern, ist wieder die Feuchtigkeit der Agarose wesentlich. Es sollte nichtwerden jegliche freie Flüssigkeit auf der Agarose-Oberfläche, da dies Bakterien und Würmer während der Versiegelung abzuwaschen. Große Blasen können durch leichtes Anheben an einer Ecke des Agar-Platte entfernt werden. Kleine Blasen, die kleiner als die Kammer erhalten häufig innerhalb der Kammern eingeschlossen sind. Diese Blasen sind kein Problem und wird durch Absorption verschwinden. Nach der Montage der Schale, klicken Sie hier, dass die Agarose ist nicht zu trocken oder zu nass. Die Kammern sollten gut verschlossen sein und es sollte keine Strömung der Flüssigkeit zwischen den Kammern sein. Wenn die Agarose zu nass ist, werden die Kammern nicht richtig abdichten. Worms kann fliehen oder ihre Nahrung weg gewaschen werden. Wenn die Probe zu feucht, einfach öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Agarose trocken für eine Minute oder zwei. Wenn die Agarose zu trocken ist, können die Kammern zusammenbrechen und die Würmer zu entkommen.

Aufstockung durch Verkleinern

Für Fluoreszenz-Bildgebung, Verkleinern wird durch die geringe Lichtmenge bei niedrigeren Vergrößerungen erhalten begrenzt. Auch EMCCD Kameras sind für die Empfindlichkeit optimiert und haben oft eine relativ geringe Auflösung. , Die Aufstockung der bildgebenden Vierfache ist jedoch ebenfalls möglich. Beispielsweise können vier Kammern von 190 um x 190 um auf einem Frame bei der Verwendung von 140X Vergrößerung (unter Verwendung eines 20x-Objektiv und eine 0,7X Kamerahalterung erreicht) und einem 512 x 512 Pixel, 8 x 8 mm Kamera passen. Eine hochauflösende Kamera mit einem großen Chip (wie sCMOS Kameras, 16,6 mm x 14 mm-Chip, 2560 x 2560 Punkte = 5,5 Megapixel) optimiert die Aufstockung von DIC und Hellfeldabbildung. Zum Beispiel bis zu 30 L1 Würmer in 190 um x 190 um Kammern auf jeder Rahmen dieser Kamera zu passen, wenn unter Verwendung eines 100-facher Vergrößerung (siehe Abbildung 3). Im Prinzip herauszoomen und Scannen kann auch kombiniert werden, um noch größere Zahl von Tieren zu erhalten. Die meisten Neuronen bleiben ganz gut im Fokus, so dass nur eine Brennebene muss abgebildet werden. Wenn Nervenzellen gefunden werden, um aus dem Fokus zu bewegen, AZ-Scan mit einem Piezoantrieb kann zu jedem Zeitpunkt p genommen werdenoint.

Anpassung an unterschiedliche Verhaltensweisen

Dieses Protokoll gibt eine gute Vorstellung über das Verhalten auf langen Zeitskalen. Offensichtlich ist das Timing der Bursts muss auf unterschiedliche Verhaltensweisen und Lebensabschnitte angepasst werden.

EINSCHRÄNKUNGEN DER TECHNIK

Verschiedene Faktoren beschränken die Dauer der Bildgebung. Die wichtigste ist die Menge der Nahrung. Sobald die Nahrung konsumiert wird, zu stoppen Larven entwickeln. So wird in kleinen Kammern (190 x 190 um) Würmer zu entwickeln, bis die Phase L3 und dann verhaften. Wenn längere Belichtungszeit erforderlich ist, grßere Kammern verwendet werden. Die maximale Laufzeit der langfristigen Bildgebung ist in dem Bereich von 2,5 - 3 Werktagen. Wenn mehr Bildgebung erforderlich ist, müssen die Würmer zurückgewonnen und in neue Kammern platziert werden. Bei der Abbildung erwachsenen Würmer, wird eine weitere Begrenzung durch die Nachkommen dieser Würmer verursacht. Erwachsenen Würmer legen Eier, aus denen Larven schlüpfen. Diese Larven werden auch in der Kammer bleibenVerbrauchen Nahrung, und kann die Bildanalyse zu stören. Wenn Nachwuchs ein Problem ist, ist eine Lösung, um entweder sterile Erwachsene oder wiederholt setzen die Würmer an die frische Kammern. Würmer zu erholen, wird die Agarose-Platte in die Kammer, das freie mit einem Skalpell geschnitten wird, wird das Deckglas gezogen wird, und wird auf einer NGM Platte, aus der die Schnecken gewonnen werden können platziert. Eine weitere Beschränkung ist die Beschränkung der Schnecken auf relativ kleine Bereiche. Dies kann ein Problem sein, wenn Langstreckenbewegung muss analysiert werden. Während die Tiere in den Kammern mechanisch und optogenetically 21,27,34,35 stimuliert werden, wird die Art des abgedichteten Kammer machen es schwierig, lösliche oder flüchtige Stimulanzien anzuwenden. Biologisch wichtige Gase wie Sauerstoff oder Kohlendioxid, kann frei in den Agar diffundieren. Die große Luftbehälter in die Schale sollte die Gaskonzentrationen in den Kammern im Laufe der Zeit für Experimente benötigt konstant zu halten. Es ist jedoch zu beachten, dass der lokale Sauerstoff concentratio gehalten werdenn in der Kammer kann mehr ähneln die Bedingungen in flüssiger Kultur als Kultur auf der Platte gefunden.

Bedeutung in Bezug auf bestehenden Verfahren

Mikrofluidischen Bauteilen haben stark fortgeschritten Verhaltens- und Entwicklungs studierte in C. elegans. Oft werden mikrofluidischen Strukturen aus PDMS 12 hergestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung von mikrofluidischen Kulturkammern aus Agarose hergestellt. Die Stärke dieser Technik ist die Kombination von hoher Bildqualität, Korrelation Verhalten physiologische Messungen, Langzeit-Bildgebung und einer angemessen hohen Durchsatz. Hohe Bildqualität wird durch die Abbildung durch das Deckglas mit hoher NA Ziele erreicht. Als Ergebnis kann Fluoreszenzabbildung, wie Calcium-Bildgebung und die konfokale Abbildung subzellulären Strukturen durchgeführt werden. Da die Tiere nicht wie bei anderen Systemen immobilisiert, erlaubt es eine Korrelation Verhalten physiologische Messungen. Because die Tiere haben genügend Nahrung, sie weiter zu entwickeln ermöglicht langfristige Bildgebung. Dieses System kann Bild viele Würmer in einem Durchgang, weil die Tiere, ihre definierte Kammern beschränkt. Somit kann dieses Verfahren leicht bis 9,27,34-36 skaliert werden.

Zukünftige Anwendungen

Bisher hat dieses System wurde hauptsächlich verwendet, um das Schlafverhalten in C. studieren elegans L1-Larven. Allerdings wird die Anpassung an alle Stufen es ermöglichen, eine Vielzahl von Verhaltensweisen auch dauers und Erwachsene zu studieren. Eine breite Palette von Verhaltensweisen können mit dieser Technik von Paarung Eiablage untersucht werden.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Die Max-Planck-Gesellschaft und eine Göttinger Graduiertenschule Junior Gruppe Stipendium für HB finanziert diese Arbeit.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Agarose mit hohem SchmelzpunktFisher BioreagentsBP(E)164-1000
Top Vision Agarose mit niedrigem SchmelzpunktThermo ScientificR0801
LED-SystemCoolLEDpE-2
VerbundmikroskopNikonTiE
StereomikroskopLeicaM5
EMCCD-KameraAndoriXon 897jetzt auch als iXon Ultra 897
sCMOS-Kameraverkauft AndorNeo
PlasmareinigerHarrickPDC-23G2
DeckelheizungMPI-WerkstattSonderanfertigung
KunststoffschaleFalcon08-757-100A
Z-Tisch für das MikroskopPriorNano Scan Z
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PDMS StempelAbbott LaboratoriesSonderanfertigung
RotlichtfilterChromaET660/50m
35 mm PetrischaleFalconFalcon Einweg-Petrischale, steril, Corning Doppelseitiges
KlebebandSellotape/Henkeldoppelseitig 25 mm x 33 mAlternativ kann auch das doppelseitige Klebeband von Rubance Adhesives verwendet werden.

Referenzen

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