Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein

Zusammenfassung

Es wird ein ELISA beschrieben, der einen neuartigen quantitativen Ansatz bietet. Er erkennt spezifisch krankheitsassoziiertes α-Synuclein (αS^D) in einem transgenen Mausmodell (M83) der Synucleinopathie unter Verwendung mehrerer Antikörper entweder gegen die Serin129-phosphorylierte αS-Form oder den C-terminalen Teil des Proteins.

Zusammenfassung

Neben etablierten Verfahren wie Western Blot, werden neue Verfahren benötigt wird, um schnell und leicht in experimentellen Modellen der Synucleopathien quantifizieren Krankheit assoziierten α-Synuclein (aS ^D). Eine transgene Mauslinie (M83) Überexpression des menschlichen A53T aS und spontan die Entwicklung einer dramatischen klinischen Phänotyp zwischen acht und 22 Monate alt sind, gekennzeichnet durch Symptome wie Gewichtsverlust, Erschöpfung, und schwere motorische Einschränkungen, wurde in dieser Studie verwendet. Für die molekulare Analyse von & alpha; S ^D (krankheitsassoziierten aS) in diesen Mäusen ein ELISA wurde entwickelt, um spezifisch zu quantifizieren aS ^D in kranken Mäusen. Analyse des Zentralnervensystems in diesem Mausmodell zeigte die Anwesenheit von & alpha; S ^D hauptsächlich in den kaudalen Hirnregionen und des Rückenmarks. Es gab keine Unterschiede in der & alpha; S ^D Verteilung zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen, die zu einer klinischen Erkrankung, dh in uninoculATED und normal alternden transgenen Mäusen und bei Mäusen mit Gehirnextrakten von kranken Mäusen eingeimpft. Der spezifische Nachweis von & alpha; S ^D Immunreaktivität unter Verwendung eines Antikörpers gegen Ser129 phosphoryliert aS durch ELISA im wesentlichen mit der durch Western-Blot und Immunhistochemie erhalten korreliert. Unerwarteterweise wurden ähnliche Ergebnisse mit mehreren anderen Antikörpern gegen den C-terminalen Teil des & alpha; S beobachtet. Die Ausbreitung von aS ^D, was auf die Beteiligung eines "Prion-ähnlichen" -Mechanismus kann somit leicht überprüft und in diesem Mausmodell unter Verwendung eines ELISA-Ansatz quantifiziert werden.

Einleitung

Die meisten aktuellen Methoden zur Erkennung von erkrankungsassoziiertem α-Synuclein (αS^D) in experimentellen Modellen der Parkinson-Krankheit (PD), wie Immunhistochemie oder Western Blot, sind zeitaufwendig und nicht quantitativ. Diese neurodegenerative Erkrankung ist durch die Aggregation von Alpha-Synuclein, hauptsächlich in Form von Einschlüssen, die eine aggregierte Form des normalerweise löslichen präsynaptischen Proteins αS^1,2 enthalten (Lewy-Körperchen und Lewy-Neuriten), gekennzeichnet. Normalerweise nur marginal phosphoryliert, ist αS in diesen Einschlüssen an seiner Serin-129-Position hyperphosphoryliert³ und kann durch Antikörper überwacht werden, die spezifisch gegen phosphoryliertes αS auf Ser129 gerichtet sind, und bietet so einen zuverlässigen Marker für die Pathologie.

Jüngste Forschungen legen nahe, dass ein "prionenartiger" Mechanismus an der Ausbreitung der αS-Aggregation innerhalb des Nervensystems eines betroffenen Patienten^4,5 beteiligt sein könnte. Diese Studien berichteten über die Beschleunigung einer Synucleinopathie durch die Inokulation von Hirnextrakten, die αS^D enthielten, in ein transgenes Mausmodell (M83), das ein A53T mutiertes humanes αS-Protein exprimiert, das mit einer schweren motorischen Beeinträchtigung verbunden ist, die bei den Mäusen im Alter auftritt⁶. In gleicher Weise bestätigte die intrazerebrale Inokulation von aggregiertem rekombinant αS im selben M83-Mausmodell die Beschleunigung der Aggregation⁵. Die Induktion von Ablagerungen von phosphoryliertem αS wurde auch nach der Inokulation von C57Bl/6 Wildtyp-Mäusen mit entweder fibrillärem rekombinantem αS oder Hirnextrakten von menschlichen DLB-Patienten^7,8 berichtet. Sacino et al.⁹ zeigten kürzlich, dass nach Injektion von fibrillärem humanem αS eine weit verbreitete und progressive zerebrale αS-Einschlussbildung in M83-Mäusen, aber nicht in E46K-transgenen Mäusen oder nicht-transgenen Mäusen induziert werden konnte, bei denen die induzierten αS-Einschlüsse vorübergehend waren und hauptsächlich auf die Injektionsstelle beschränkt blieben. Jüngste Studien an Affen bestätigten die Ausbreitung von αS-Aggregaten nach Inokulation von PD-abgeleiteten Extrakten in Arten, die näher an Menschen stehen¹⁰.

Die Verbindung zwischen αS-Veränderungen und der Parkinson-Krankheit legt nahe, dass αS^D ein potenzieller Biomarker für die Parkinson-Krankheit ist¹¹. Eine aktuelle Studie zeigte die Erkennung von oligomeren löslichen Aggregaten von α-Synuclein in menschlichem zerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) und Plasma als potenziellen Biomarker für die Parkinson-Krankheit basierend auf einem konventionellen Sandwich-ELISA-System mit demselben Antikörper zur Erfassung und zum Nachweis von αS¹². Basierend auf derselben Methode wurden multimere Proteine in biologischen Proben, einschließlich des Gehirns, erkannt, da es mehrere Kopien von Epitopen in den zusammengesetzten Formen gibt¹³. Sehr kürzlich wurde pathologisches αS im CSF von Patienten mit einer nachgewiesenen Lewy-Körperchen-Pathologie mittels eines ELISA-Kits mit einem hochspezifischen Antikörper gegen αS^D (5G4) und einem Immunpräzipitations-Assay nachgewiesen¹⁴. Diese Methoden könnten Patienten mit PD/DLB von anderen Arten der Demenz unterscheiden.

Die "prionenartige" Ausbreitung der αS-Aggregation wurde in dem transgenen Mausmodell M83 mit einem ELISA-Ansatz weiter untersucht, der speziell entwickelt wurde, um αS^D15 zu identifizieren. In dieser Studie berichten wir über das detaillierte ELISA-Protokoll, das verwendet wurde, um αS^D quantitativ in kranken Mäusen (ob inokuliert mit αS^D von kranken M83-Mäusen oder nicht) und insbesondere in den Hirnregionen nachzuweisen, die speziell von dem pathologischen Prozess in diesem transgenen M83-Mausmodell betroffen sind⁴.

Protokoll

Alle Verfahren und Protokolle mit Tieren waren nach EG-Richtlinie 86/609 / EWG und nach kommt, der Französisch Nationalkomitee für die Prüfung der Ethik in der Tierversuche (Protokoll 11-0043) ratifiziert. Die Tiere wurden untergebracht und versorgt in ANSES genehmigt Versuchsanlagen in Lyon (Genehmigung B 69387 0801).

1. Herstellung der Mäuse

1. Euthanize Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital.
2. Rufen Sie die gesamte Gehirn aus dem Schädel der Maus und legen Sie sie in einem 35 mm Kunststoff-Petrischale auf Eis bis zur Extraktion.
3. Extrahieren Sie das Halsmark.
   HINWEIS: Extract aS entweder von einem der Gehirnhälften nach sagittalen Schnitte oder seziert Gehirn der Maus, erhältlich nach den in Tabelle 1 aufgeführten Experimente.

Experiment	Mice Inokulum (Hirn-Äquivalent)	Überlebenszeit (Dpi)	Median / maximale Überlebens (Tage alt)	aS d Nachweis durch ELISA / WB / IHC
1	Ungeimpften Mäusen	441 ± 166	419/736	8/8
2	Inokulierten Mäusen (0,2 mg)	150 ± 52	140/241	9/9

Tabelle 1. Liste der Experimente an M83 Mäusen durchgeführt. Die Impfungen wurden nach 6 Wochen bei Versuch 2 im striato kortikalen Bereich mit 20 ul eines Gehirnhomogenisat eines kranken Maus (1% G / V in 5% Glucose) nach durchgeführt wird, Anästhesie von 6 Wochen alt homozygote Mäuse M83 um 3% Isofluran Einatmen. dpi: Tage nach inoculation.

2. aS Extraktion von Gehirnhälften

1. Sagittal geschnitten das Gehirn zwei Hälften zu erhalten. Wiegen Sie jede Hälfte in einem ribolysis Röhrchen mit Mahlkugeln.
2. Vorbereitung High Salt (HS) Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Phosphatase und Protease-Inhibitor-Cocktails. Hinzuzufügen Hochsalzpuffer zu den Gehirnhälften bis 20% (Gewicht / Volumen) Homogenate erhalten.
3. Vorbereitung der Proben aus den Gehirnhälften unter Verwendung eines mechanischen Homogenisators bei 6,0 m / s für 23 s zweimal. Nach der ersten 23 sec Homogenisierung, legen Sie die Röhrchen mit den Homogenaten auf Eis für 2 min vor der zweiten 23-sec-Zyklus.
4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 × g für 5 min auf ungeschliffenen Gehirnteilen zu beseitigen. Wiederherstellen der Überstände, teilen sich in 200 ul Aliquots und halten sie bei -80 ° C für die anschließende ELISA-Analyse.

3. aS Extraktion aus Dissected Hirnregionen

1. Sezieren eingesamte Gehirn in einem 35 mm Kunststoff-Petrischale auf Eis mit einem geringen Stromlupe (8-fache Vergrößerung) mit Hilfe von zwei forcipes deren Enden zusammen, außer wenn der Zerlegung des Hippocampus gehalten. 10 Minuten dürfen nicht überschritten werden, um Gehirn Integrität zu bewahren. Legen Sie das Gehirn wieder richtig herum und rufen Sie die folgende Gehirnregionen in dieser Reihenfolge:
   1. Getrennten der zwei Riechkolben mit einer Pinzette gerade hinter der Lampe angeordnet. Nehmen Sie es aus dem Gehirn durch eine Abwärtsbewegung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Lampe.
   2. Gently Keil in die Zange zwischen den beiden Cortex und verschieben Sie es nach vorne, um die Dissoziation der beiden Cortex erleichtern. Halten das Gehirn in Platz mit einer Pinzette, verwenden Sie eine andere, um die Rinde aus dem Hippocampus zu trennen.
   3. Positionieren Sie die Pinzette 2 mm unterhalb der Hirnrinde. Aufrechterhaltung eines leichten Druck an der Zange, bis die Oberseite des Hippokampus sichtbar ist. Ziehen Sie weg der erste Teil des Kortex, und wiederholen Sie mit dem zweiten Teil. Verwenden Sie die Pinzette, um die beiden zu trennen Cortexab Hippocampus und Bewegung in Richtung der Vorderseite des Gehirns.
   4. Positionieren Sie die offene Zange um einen der hippocampi. Schließen Sie die Zange an der Unterseite des Hippocampus dann nehmen Sie es vorsichtig, Wiederherstellung so weit wie möglich. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Hippocampus.
   5. Positionieren Sie die offene Zange unterhalb einer der striata und sanft trennen sie vom Gehirn. Verwenden Sie die Pinzette, um alle verbleibenden Kortex aus dem Striatum zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Striatum.
   6. Mithilfe der Pinzette vorsichtig betätigen um 2 mm die Kontur des Kleinhirns, um eine Trennung des Kleinhirns aus dem Gehirn zu erleichtern. Legen Sie die Pinzette gerade hinter dem Kleinhirn und entfernen Sie sie, indem Sie die Pinzette nach vorn.
   7. Verwenden Sie den breiten Teil der Zange, um das Mittelhirn, um zu erhöhen, klar zu sehen, wo es den Hirnstamm verbindet. Stellen Sie eine vertikale Inzision an der Kreuzung entfernen Sie dann die Hirnstamm.
   8. Positionieren Sie die Zange hinter dem Mittelhirn, die ichs von vier abgerundeten Strukturen. Einzuschneiden vertikal, bis der Mittelhirn wurde vollständig vom übrigen Gehirn abgetrennt.
2. Vorbereitung Homogenaten variable% (Gewicht / Volumen) in HS Puffer, abhängig von der Menge des verfügbaren Geweben, also 5% Homogenat für ein Gewicht zwischen 10 und 30 mg, 10% für ein Gewicht zwischen 30 und 80 mg, 20% für ein Gewicht von über 80 mg.
   1. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen von HS-Puffer zu den seziert Hirnregionen, um die erwartete% Homogenat zu erhalten.
   2. Vortex und überprüfen Sie, dass die Gewebe sind vollständig in der HS-Puffer eingetaucht.
   3. Homogenisieren Proben aus den seziert Hirnregionen oder Halsmark mit einer Gewebemühle aus einem Borosilikatglas Rohr und zwei Stößel, A und B zusammengesetzt ist vorbereitet
   4. Pour jede Gehirnregion, direkt in das Rohr gequetscht werden. Legen Stößel A in das Rohr und zurückgezogen werden. Wiederholen Sie diese Bewegung etwa zehnmal, um das Gewebe zu distanzieren. Dann nutzen Stößel B um continue Mahlen des Gewebes mit weiteren 20 Bewegungen. Übertragen Sie die Homogenate in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml Transferpipette.
3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 × g für 5 min bei 4 ° C, um alle ungemahlenen Gehirnteilen zu beseitigen. Rufen Sie die Überstände, unterteilen Sie diese in 200 ul Aliquots und halten sie bei -80 ° C für die anschließende ELISA-Analyse.

4. Erkennung von aS durch ELISA

1. Verdünnt den Beschichtungsantikörper zu 0,01 ng / ml. Entweder anti-aS Kaninchen polyklonale oder monoklonale Antikörper Klon 42 in 50 mM Na ₂ CO ₃ / NaHCO ₃ (pH 9,6).
2. Bestreichen Sie die 96-Well-Mikroplatten mit 100 ul pro Vertiefung dieser Beschichtungslösung, und lassen Sie bei 4 ° CO / N. Verwenden Sie die Anti-aS polyklonalen Kaninchen-Antikörper, der in der Beschichtungslösung für ELISAs mit Detektionsantikörper syn514, Klon 42, LB509, AS11, 4D6 oder 8A5. Verwenden des Anti aS monoklonale Antikörper Klon 42 als Beschichtungslösungin Kombination mit der anti-pSer129 aS Nachweisantikörper.
   HINWEIS: Wenn nötig, können die Platten bei 4 ° C für eine Woche vor dem ELISA aufbewahrt werden ausgeführt.
3. Verwenden Sie einen Plattenwäscher, um die Platten fünfmal mit 300 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 (PBST) pro Vertiefung waschen. Von diesem Schritt an ist Inkubation bei RT.
4. Fügen Sie 200 ul PBS T20 Blockierungspuffer pro Vertiefung. Es wird 1 h bei 150 Upm. Fünfmal mit PBST, waschen.
5. Verdünnen Sie die Hirnhomogenaten (Verdünnung 1: 100 der 20% Homogenate, 1.50 der 10% Homogenate und 1.25 der 5% Homogenate in PBST BSA 1%), und fügen Sie 100 ul in jede Vertiefung. Dann inkubieren für 2 Stunden unter Schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute. Fünfmal mit PBST, waschen.
6. Fügen Sie die verschiedenen aS Nachweis-Antikörper in PBST mit BSA 1% an den in der Materialliste genannten Verdünnungen. Inkubieren für 1 h bei 150 Upm. Fünfmal mit PBST, waschen.
7. Fügen Sie entweder Anti-Maus oder Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugate, verdünnt 1: 8.000 in PBST mit 1% BSA für 1 h ergänzt unter Schütteln bei 150 UpM. Fünfmal mit PBST, waschen.
8. 100 l 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min im Dunkeln unter Schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute.
9. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 ul 1 N HCl pro Vertiefung messen Sie dann die Absorption bei 450 nm mit der Mikroplatten-Reader.
10. Für die Datenanalyse, subtrahieren Sie die in einem gut mit allen Reagenzien, außer irgend Maus Hirnproben (leere well) aus den für jede der untersuchten Proben gemessenen OD-Werte erhaltenen OD-Wert.

5. Epitopkartierung

1. Zuführen Epitopkartierung nach der von Osman ¹⁶ beschriebenen Verfahrens. Kurz gesagt, spot Peptide des menschlichen α-Synuclein-Sequenz mit 12 Aminosäuren auf Nitrocellulose mit 10 überlappenden Aminosäuren.
2. Blockieren mit 50 mM Tris / 150 mM NaCl-Puffer pH 10, das 0,05% Tween 20 und 5% Milchpulver. Inkubieren des Antikörpers in der Blockierungslösung bei einer Konzentration von 2 ug Antikörper pro ml bei 2-10 ° CO / N.
3. Dreimal mit 50 mM Tris / 150 mM NaCl-Puffer, pH 10, enthaltend 0,05% Tween 20 Inkubation mit Ziege-Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat Waschen der Membran. Die Membran noch fünf Mal mit dem gleichen Puffer dann Fleck mit einem Western-Blot-TMB Färbekit waschen.

6. Statistische Analyse

1. Verwenden Sie die R-Software und nlme Paket zu Mixed-Effects-Regressionen durchführen, um OD modellieren. Für jeden Vergleich, führen Sie eine gemischte Wirkung Regressionsmodell. Verwenden Sie eine feste Wirkung auf eine symptomatische von asymptomatischen Gruppen zu unterscheiden.
2. Verwenden Sie ein Zufallseffekt, um die Variabilität der Wiederholungen für eine bestimmte Maus anzupassen. Überprüfen homoscedasticity durch die Untersuchung der Residuen und, wenn nötig, verwenden Sie die Varianz Funktionen, um die Varianz Struktur innerhalb der Gruppe von Fehlern in Einklang mit Pinheiro und Bates ¹ zu modellieren7. Legen Sie 0,05 als Signifikanzschwelle von P.

Ergebnisse

In dieser Studie verwendeten ELISAs spezifisch identifizierten Krankheit assoziierten & alpha; S (& alpha; S ^D) in Hirnhomogenaten in einem Hochsalzpuffer von kranken M83 Mäusen hergestellt. Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch pSer129 aS (p = 0,0074), der ELISA leicht unterscheidet alte, kranke Mäuse (> 8 Monate alt) von jungen (2-5 Monate), M83 gesunden Mäusen (Abbildung 1). Mehrere andere Antikörper zeigten ähnlich hohe Signale (> 0,6 OD) nur in Hirnhomogenaten von kr...

Diskussion

Die Verwendung eines ELISA wurde gezeigt, spezifisch nachzuweisen aS ^D direkt von Maushirn-Homogenaten bei der Krankheit in den M83 transgenes Mausmodell. In der Tat, könnte dies ohne weiteres zu unterscheiden ELISA kranken Mäusen M83 M83 von gesunden Mäusen mit nur ganze Hirnhomogenaten in Hochsalzpuffer.

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Ergebnisse mit diesen ELISA sind: richtig sezieren die verschiedenen Regionen der Maus-Gehirne von der Entwicklung der notwendigen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Gefertigt bei Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Zugehörig von Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290