Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Масштабируемость 96-луночного планшета основании IPSC Культура и производства с помощью роботизированной системы наливных

Published: May 14, 2015 doi: 10.3791/52755
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1InvivoSciences, Inc., 2Gilson, Inc.

Abstract

Продолжение продвижение в плюрипотентных стволовых клеток культуры закрывает разрыв между скамейке и кровати для использования этих клеток в регенеративной медицине, лекарственных препаратов и тестирования безопасности. Для того, чтобы произвести стволовых клеток получены биофармации и клеток для тканевой инженерии и трансплантации, экономически эффективная технология производства клеток имеет важное значение. Обслуживание плюрипотентности и стабильной работы клеток в последующих применений (например, дифференциация клеток) в течение долгого времени имеет первостепенное значение для крупномасштабного производства клеток. Тем не менее, это может быть трудно достичь, особенно если клетки культивируют вручную, когда оператор может ввести значительные колебания, а также быть чрезмерно дорогим для расширения деятельности. Чтобы включить высокой пропускной, крупномасштабное производство стволовых клеток и удаления оператор влияния протоколы роман стволовых клеток культуры, используя настольный многоканальный были разработаны наливных робота, который требует минимального вмешательства техник или опыт. СЭти протоколы человека, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) культивировали в фидерных свободных условиях непосредственно из замороженных исходных и поддерживается в 96-луночных планшетах. В зависимости от клеточной линии и требуемой скорости масштабного вверх, оператор может легко определить, когда проход на основе серии изображений, показывающих оптимальные плотности колонии для расщепления. Затем необходимые реагенты готовы выполнить разделение колонии на новых пластин без стадии центрифугирования. После 20 пассажей (~ 3 месяца), две линии IPSC поддерживается стабильным кариотипом, выразил маркеры стволовых клеток, и дифференцируются в кардиомиоциты с высокой эффективностью. Система может выполнить последующую высокопроизводительного скрининга новых протоколов дифференцировки или генетических манипуляций, предназначенных для 96-луночных планшетах. Эта технология позволит снизить нагрузку труда и технического производить большое количество идентичных стволовых клеток для множества приложений.

Introduction

Использование человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) значительно увеличилось, так как их выводе в 2007 году 1 для соединения тестирования, восстановительной медицины и моделирования болезни 2 - 6. Это требование исходит из емкости Ipsc к получением большого количества плюрипотентных клеток, которые могут быть дифференцированы в соматических клетках при беспрецедентной величины. Как направленные методы дифференциации улучшить 7 - 10 и развитие человеческой клетки или ткани моделирования и клеточной терапии повышает 11 - 14, так что делает потребность в массовом производстве высоких ИПСК качества. Он широко цитируется, что среди других болезней, инфаркт миокарда или функциональная замена б-клеток потребует сотни миллионов до миллиардов IPSC получены соматические клетки 15 - 18. Кроме того, все более и более сложным 3D-моделирование ткани для лекарств и тherapy будет требовать большого числа клеток 9,13,19. Во всех этих примерах, определены, равномерное и воспроизводимые иПСК должен быть доступен и прост в изготовлении.

Для того, чтобы произвести стволовых клеток получены биофармации и клеток для тканевой инженерии и трансплантации, экономически эффективная технология производства клеток имеет важное значение. Чешуйчатый производство ИПСК была сосредоточена на суспензионной культуре 20 - 25 или суспензии с использованием микроносителей подложек 26 - 28 отчасти потому, что эти методы успешно развернуты для крупномасштабного, не-Ipsc, эукариотической продукции, основанной. Несколько групп продемонстрировали системы подвески культуры, которые дают плюрипотентных стволовых клеток 20,21,23,24,29. Тем не менее, эти подходы использовать дорогие и сложные системы не всегда доступны для исследователей развивающихся новых программ дифференцировки, вождение тканевой инженерии и делать Laboratрии масштабное исследование. Кроме того, подвеска и микроносителю IPSC культуры требуют адаптации и методы или химикаты, не найденные в традиционной культуре приверженцем IPSC, такие как непрерывное использование ингибитора Rho-киназы, пеногасители и фильтрацию, чтобы регулировать агрегацию. Физическое напряжение к клеткам является более распространенным в суспензионной культуре, введены путем механического перемешивания, а также при столкновении микроносителя. Эти проблемы ограничивают предсказуемость и скорость, с которой только что генерируется линий стволовых клеток можно культивировать в суспензии. Другие разработали роботизированные системы обработки пластин, которые имитируют пластины методы культуры 30,31, но эти платформы требуют значительных инвестиций на оборудование и опыт для работы в дополнение к основным проблемам, связанным с стволовых клеток культуры.

Следующая работа описывает развитие и практику масштабируемой системе культуры IPSC, который использует автономный, стандартный 8-канальный робота жидкостиОбработчик и 96-луночных планшетах. Этот метод был разработан для преодоления лабораторного масштаба, IPSC культуры и высокого объема производства IPSC (например, 10 7 - 1,5 х 10 9 клеток на неделю в технике), позволяющие тем разработке новых технологий IPSC легко масштабировать производство без крупных аппаратных или трудовых вложений. Этот метод является относительно недорогим, чтобы создать, практически не требует стволовых клеток культуры, программирования или инженерного опыта, имеет небольшой след оборудования без необходимости в выделенном капот культуре клеток, и использует стандартный для культивирования клеток оборудование, чтобы позволить средней до высокой пропускной автоматизированной Производство клеток. Цель в том, чтобы разработать систему, способную масштабируемой культуры стволовых клеток, которые могут быть использованы в лабораториях новых для стволовых клеток культуру, те, кто найти руководство Выращивание барьер для развития своих идей или тех, кто хочет экономичный способ получения большого количества стволовых клеток. Платформа, представленная здесь снимает техник влияния настволовых клеток культуры и нормализует процедуры кормления и прохождение включить последовательное производство стволовых клеток.

Protocol

Роботизированная система обработки жидкости, которая в течение следующих протоколов было pipetmaX Gilson, в облегчает автоматизированный, масштабируемую культуру и производство стволовых клеток при сохранении традиционных условий приверженцем культуры в формате 96-луночного планшета. Как традиционной культуры пластины 6-луночный, иПСК выращивают с этим протоколом, как монослой отдельных колоний, но в формате 96-луночного планшета. Каждый хорошо может быть изогенная или различны и либо конфигурации можно культивировать параллельно с робот может держать каждую лунку разделены. Типичный робот дня культура IPSC имеет две фазы: программа кормления, где культуры откормленных на настраиваемый график и программу месте, где пользователь выбирает метод диссоциации и, таким образом, соотношение расщепления контрольный плотности посева и масштаб сокращений. Следующие протоколы описывают, как новая культура начинается, как питание и проезд осуществляются и дополнительные программы, которые облегчают IPSC культуры.

1. Подготовка внеклеточного матрикса гель планшетах, покрытых 96-луночных

  1. Снимите упаковку с шестью новыми, RT 96-луночных планшетах и разместить их на наливных робота кровать в положениях 2, 3, 5, 7, 8, 9 (рис 1А для постельного позиций).
  2. Поместите предварительно охлажденного 4 ° C 4-а корыто в положении кровать 6.
  3. Колонка нагрузки 12 наконечника стойки в положении слоем 1 с предварительно охлажденной, 4 ° С 200 мкл наконечниками пипетки.
  4. Заполните первый (самый левый) корыто а в положении кровать 6 с 25 мл 4 ° C DMEM / F12, поливая аликвоту с использованием стерильной техники. Кроме того, использование пипетки, чтобы завершить передачу.
  5. Снять крышки 96-луночного планшета и сдвиньте друг в специально разработана пластина крышки холдинга стойки (PLHR, рис 1А). Избегать контактас внутренней пластины крышки.
    Примечание: Обработка внутри пластины крышки или укладки плит крышки, где внутри одного крышкой прикасается за пределами другой отличный маршрут для загрязнения.
  6. Использование робота управления сенсорной панели, нажмите следующую серию кнопок, чтобы начать хорошо Предварительное смачивание процесс:
    1. Нажмите "Выполнить протокол".
    2. Выберите "внеклеточный матрикс геля Предварительно смочите» и нажмите рядом.
    3. Решение Пользователь: Нажмите "Тест", чтобы использовать мастер шаг за шагом, чтобы заранее проверить выбранную программу.
      Примечание: робота не работает, а программа проверяет протокол для программных проблем. С установленными протоколами, постукивая, "пропустить настройку" является приемлемым.
    4. Нажмите "Выполнить" Протокол.
  7. Во время предварительного смачивания процесса (шаг 1.6) перейдите к шагу 1.8.
  8. Оттепели на льду одного 4 мг аликвоты фактора роста снижается внеклеточного матрикса (гель GFRM), содержащихся в 50 млконическую трубку хранили при -80 ° С. Держите аликвоту на льду до использования.
    Примечание: GFRM укрепит, если позволили прийти к комнатной температуре и не будет полезным.
  9. Ресуспендируют 4 мг GFRM аликвоту в 24 мл 4 ° C DMEM / F12 с стеклянной пипетки 25 мл. При передаче DMEM / F12, пауза в течение 2-3 сек, чтобы пипетки, чтобы охладить до ресуспендированием GFRM аликвоту.
  10. Когда процесс предварительного увлажнения (шаг 1.6) является полным, перейдите к шагу 1.11.
  11. Перенесите 24 мл DMEM / F12 GFRM смеси четвертой скважины желоба в положении кровать 6.
  12. Использование робота управления сенсорной панели, нажмите следующую серию кнопок, чтобы начать процесс покрытия внеклеточной матрицы геля:
    1. Нажмите "Выполнить протокол".
    2. Выберите "внеклеточный матрикс геля аликвоту" и нажмите Далее.
    3. Решение Пользователь: Нажмите "Тест", чтобы использовать мастер шаг за шагом, чтобы заранее проверить выбранную программу.
      Примечание: робот не работать, но раннийг программное обеспечение проверяет протокол программных проблем. С установленными протоколами, постукивая, "пропустить настройку" является приемлемым.
    4. Нажмите "Выполнить" Протокол.
  13. Когда шаг 1.12 будет завершена, заменить пластину крышки.
  14. Перенесите гель покрытием 96-луночных внеклеточного матрикса в 37 ° C, 5% CO 2, увлажненной инкубатора и держать там в течение 24 ч, после чего указывают пластины будет готов к использованию или хранится.
    Примечание: В исключительных случаях и вновь покрытием внеклеточного матрикса гель пластины могут быть использованы после 15-30-минутной инкубации, но O / N до 24 часов инкубации рекомендуется.
  15. Повторите шаги 1.1 Протокол, 1.3, 1.5-1.6, 1.10 и 1.12-14, пока все в DMEM / F12 с GFRM используется.

2. Сохранение внеклеточного матрикса гель покрытием 96-луночных планшетах

  1. Удалить внеклеточные гель покрытием 96-луночных планшетах матричные от 37 ° C, 5% CO 2, увлажненном инкубаторе.
  2. Дополнительно:Llow внеклеточного матрикса гель покрытием 96-луночных планшетах прийти к комнатной температуре, прежде чем перейти к шагу 2.3.
    Примечание: Этот дополнительный шаг уменьшения образования конденсата, когда пластины размещены на 4 ° С.
  3. Место пластин на обработку робота кровати жидкости в положениях 2, 3, 5, 7, 8, 9 (рис 1А для постельного позиций).
  4. Колонка нагрузки 12 наконечника стойки в положении кровать 1 с РТ 200 мкл пипеткой советы.
  5. Поместите четыре корыто резервуар в положении кровать 6.
  6. Заполните хорошо 4 (правый) резервуара с РТ DMEM / F12.
  7. Снять крышки 96-луночного планшета и сдвиньте друг в PLHR.
  8. Использование робота управления сенсорной панели, нажмите следующую комбинацию кнопок:
    1. Нажмите "Выполнить протокол".
    2. Выберите "внеклеточный матрикс геля аликвоту" и нажмите Далее.
    3. Решение Пользователь: Нажмите "Тест", чтобы использовать мастер шаг за шагом, чтобы заранее проверить выбранную программу.
      Примечание: робот не работает, а программа проверяет протокол программных проблем. С установленными протоколами, постукивая, "пропустить настройку" является приемлемым.
    4. Нажмите "Выполнить" Протокол.
  9. После завершения замены пластины крышки и снимите пластины из станины.
  10. Обернуть вокруг всей стороне каждого внеклеточного матрикса геля покрытием 96-луночного планшета (где крышка отвечает пластину) с одного дюйма на 6 дюймов парафин кинопленки. Будьте уверены, чтобы растянуть парафиновой пленки, чтобы создать герметичное уплотнение.
  11. Дополнительно: Этикетка пластины с даты завершенного внеклеточный матрикс гелевого покрытия, количество внеклеточного матрикса геля много, имя пользователя и другую информацию.
  12. Храните пластины при 4 ° С, где они будут хорошо использовать в течение двух недель.
    Примечание: Пластины были успешно использованы за две недели предела, однако, это не рекомендуется.

3. Выполнение стволовых клеток колонии Посев ПлотностьГрадиент в пластине 96-луночного формата от живого или замороженного культуры: Как начать или восстановление нормальных интервалов переход к стволовых клеток линии

  1. Если, начиная с замороженной культуры, перейдите к шагу 3.2. Если, начиная с живой культурой стволовых клеток уже на тарелке, начните с шага 3.5.
  2. Оттепель замороженной культуры, вращая трубку в водяной бане при 37 ° до только небольшой кусок льда не остается.
  3. Дополнительно: Развести размороженные клетки в 10 мл клеточного роста информации (SCGM), центрифугу RT стволовых в течение 2 мин при 300 х г, аспирата супернатант носители и ресуспендируют осадок клеток стволовых в 7 мл свежего SCGM содержащий 10 мкм Y27632.
    Примечание: Этот шаг исключает вынос морозильной СМИ.
  4. Перейдите к шагу 3.6.
  5. Если, начиная с живой, уже покрыл стволовых клеток: прохождение клетки, как обычно, используя ферментативную или неферментативное диссоциации. Попробуйте собрать в общей сложности 1,5-3 млн клеток; Обычно один и шести-луночный планшет. Центрифуга собранных клеток для2 мин при 300 мкг, аспирация супернатант СМИ и ресуспендируют стволовых клеток осадок в 7 мл свежего SCGM, содержащей 10 мкм Y27632. Перейдите к шагу 3.6.
  6. Убедитесь, что клетки, либо из замороженного или живой культуры, суспендируют в 7 мл РТ SCGM 10 мкМ Y27632.
  7. Колонка нагрузки 12 наконечника стойки в положении кровать с РТ 200 мкл пипеткой советы.
  8. Поместите четыре корыто резервуар в положении кровать 2.
  9. Поместите один новый внеклеточный матрикс геля покрытием 96-луночного планшета, предварительно нагревают до 37 ° С в положении кровать 5 и снять крышку помещая его в PLHR.
  10. Передача 7 мл ресуспендированных клеток скважины 3 резервуара по пипетки или стерильной залить.
    1. Использование робота управления сенсорной панели, нажмите следующую комбинацию кнопок:
    2. Нажмите "Выполнить протокол".
    3. Выберите "Посев градиент плотности" и нажмите Далее.
    4. Решение Пользователь: Нажмите "Тест", чтобы использовать мастер шаг за шагом, чтобы предварительно проверить выберитеПрограмма ред.
      Примечание: робота не работает, а программа проверяет протокол для программных проблем. С установленными протоколами, постукивая, "пропустить настройку" является приемлемым.
  11. Нажмите "Выполнить" Протокол.
  12. Когда серийные разведения завершена, повторно не покрывают пластину и место в 37 ° C, 5% CO 2, увлажненном инкубаторе до следующего кормления.
  13. Дополнительно: Этикетка пластины с датой, информации о деформации, имя пользователя, тип носителя и другой соответствующей информации.
  14. В течение следующих нескольких дней, кормить пластину 96-а по мере необходимости с помощью протокола 4 ниже.
    Примечание: типичный стволовых клеток пластина потребует полного изменения массовой информации каждые 24 ч и SCGM не содержит Y27632 для кормления; только во время первоначального посева после прохода. До кормления, проверьте пластину на наличие загрязнений и плотности поселения. См шаг 3.16 для более по мониторингу плотность колоний.
  15. В течение следующих нескольких дней, несколько столбцов рядом с Cвведите пластины (обычно 5-8) колонки подойдет идеальной плотности для прохода; чтобы определить эту плотность, сравнивают 96-луночного планшета в диапазоне плотности, показанной на фигуре 3В со следующей информацией в виду:
    1. Прохождение когда пространство между большинством колоний примерно на 25% от диаметра смежной колонии.
      Примечание: обоснование, чтобы определить время прохождения, что очередной цикл питания и роста приведет в колониях делает контакт, который следует избегать.
  16. Чтобы начать равномерно разбавленный пластины и начать регулярные культуру, выберите столбец, в идеальном плотности и прохождения. См протокол 5 прохождению.

4. Питание 96-а Колонии плиты стволовых клеток

Примечание: следующий протокол описывает подачу одной 96-а стволовых клеток колонии пластины. Методика может быть расширена до размещения 6 Всего пластины параллельно.

  1. Удалить 96-луночного STEM колонии клеток из пластины 37 ° С, 5% СО 2, увлажненном инкубаторе.
  2. Проверьте пластины для загрязнения и плотности клеток. Для того, чтобы кормить, убедитесь, что плотность поселения ниже идеального плотности прохода. Смотрите рисунок 3B для получения информации о плотности.
    Примечание: Загрязнение может проявляться как мутные СМИ и сопровождаться неприятным запахом. Маленькие, очевидно, не-IPSC агрегаты могут также быть видны под микроскопом инспекции. Чтобы оценить плотность клеток, см шаг 3.16.1 выше.
  3. Поместите 96-луночный стволовых клеток колонии пластины в положении 3 кровати на наклонной, 37 ° C рампы.
  4. Колонка нагрузки 12 наконечника стойки в положении кровать 1 с РТ 200 мкл пипеткой советы.
  5. Поместите желоб 4-а в положении кровать 2.
  6. Заполните хорошо 3 желоба в положении кровать 2 с 8 мл свежего, РТ SCGM без Y27632 либо стерильной пипетки влить или передачи.
  7. Снимите крышку пластины 96-а стволовые клетки колонии помещая его в PLHR.
  8. Используяроботизированная управления сенсорная панель, нажмите следующую комбинацию кнопок:
    1. Нажмите "Выполнить протокол".
    2. Выберите "Колония поток одной пластины" и нажмите Далее.
    3. Решение Пользователь: нажмите "Тест", чтобы использовать мастер шаг за шагом, чтобы заранее проверить выбранную программу.
      Обратите внимание, что робот не работает, а программа проверяет протокол программных проблем. С установленными протоколами, постукивая, "пропустить настройку" является приемлемым.
    4. Нажмите "Выполнить" Протокол.
  9. Когда протокол подачи завершена, повторно покрывают колонии 96-луночного планшета стволовых клеток и вернуться к 37 ° С, 5% СО 2, увлажненном инкубаторе до следующего кормления или прохода требуется. Это обычно требуется после 24 часов.
    Примечание: Рекомендуется записать событие подачи на пластины крышки с даты, тип носителя, имя пользователя и другую нужную информацию.

5. Пассирование 96-а Plели стволовых клеточных колоний

  1. После нескольких циклов кормления колонии 96-луночный планшет стволовых клеток будет готов к прохождению. Этот протокол описывает прохождение одного столбца в одном 96-луночного планшета, представляющий соотношение 1:12 разделения. Пользователь может определить соотношение разделения и выбрать любое количество скважин или столбцов разделить, в том числе выбора скважин, которые не могут быть смежными.
  2. Сравните 96-а стволовых клеток плотность колонии пластины Рисунок 3B, чтобы определить, следует ли прохождение. Идеальная плотность проход, когда пространство между большинством колоний примерно на 25% от диаметра смежной колонии или последующее кормление приведет колоний, растущих в друг друга.
  3. Осмотрите стволовых клеток колонии 96-луночного планшета под микроскопом, чтобы убедиться, нет загрязнения.
  4. Поместите 96-луночный стволовых клеток колонии пластины в положении 3 кровати на наклонной, 37 ° C рампы.
  5. Нагрузка колонки 8-12 в наконечник эстакады в положении кровать 1 с RT 200 мкл пипеткисоветы.
  6. Поместите желоб 4-а в положении кровать 2.
  7. Оставить корыто хорошо 1 пуст, поместите в 8,5 мл SCGM + 10 мкМ Y27632 в скважине 2, положить 3,5 мл 30% протеолитической и коллагенолитический диссоциации реагента (или на основе ЭДТА диссоциации реагента) в скважине 3, положить 4,5 мл PBS в лунку 4.
    Примечание: Все реагенты могут быть при комнатной температуре или 37 ° С. Был использован РТ протеолитической и коллагенолитической диссоциации реагента на 30% разбавленного PBS для жировой и фибробластов происходит IPSC культура описано здесь.
  8. Поместите один новый, предварительно нагревают при 37 ° С внеклеточный матрикс геля с покрытием 96-луночного планшета в положении слоем 5.
  9. Снимите крышку колонии 96-луночного планшета стволовых клеток, а также новую крышку 96-луночного планшета и поместите их как в PLHR.
  10. Использование робота управления сенсорной панели, нажмите следующую комбинацию кнопок:
    1. Нажмите "Выполнить протокол".
    2. Выберите "Колония Split 1:12 Колонка 1" и нажмите Далее.
    3. Решение Пользователь: Нажмите "пробный пуск", чтобы использоватьМастер шаг за шагом, чтобы заранее проверить выбранную программу.
      Примечание: робота не работает, а программа проверяет протокол для программных проблем. С установленными протоколами, постукивая, "пропустить настройку" является приемлемым.
    4. Нажмите "Выполнить" Протокол.
  11. После того, как протокол проход закончил, повторно покрыть обе пластины.
  12. Дополнительно: Добавьте новые пластины с необходимой информацией (т.е., дата, клеточная линия, номер прохода, тип носителя, имя пользователя и т.д.).
  13. Возврат обе пластины к 37 ° С, 5% СО 2, увлажненном инкубаторе до следующего кормления или прохода требуется. Примечание: В следующем подачи, как правило, после 24 часов.
    Примечание: Клетки и колонии должны приложить к пластине в течение 2-3 ч расщепления и выглядят очень распространено. Это связано с наличием ингибитора Rho-киназы и клетки конденсируется и проявляют морфологию характеристика стволовых клеток (т.е. булыжником упакованы колонии Wiго небольшой объем клеток к большой коэффициент ядра) после первого Ро-киназы свободного кормления.

6. Сбор 96-луночного планшета Стволовые клетки для производства

Примечание: стволовых клеток колонии может быть собран для использования в любой момент во время культуры. Обычно это происходит, когда клетки готовы к прохождению (см протокол 5). Этот протокол описывает, как собирать одиннадцать столбцы из колонии 96-луночного планшета стволовых клеток.

  1. Осмотрите стволовых клеток колонии 96-луночного планшета под микроскопом, чтобы убедиться, нет загрязнения.
  2. Поместите 96-луночный стволовых клеток колонии пластины в положении 3 кровати на наклонной, 37 ° C рампы.
  3. Колонны нагрузки 11 и 12 в наконечник эстакады в положении кровать 1 с РТ 200 мкл пипеткой советы.
  4. Поместите желоб 4-а в положении кровать 2.
  5. Оставить корыто также 1 пуст, поместите в 8,5 мл SCGM в скважине 2, положить 3,5 мл 30% протеолитической и коллагенолитической диссоциации реагента (или ЭДТА на основе диссоциации реагента) в хорошо3, положить 4,5 мл PBS в лунку 4.
    Примечание: Все реагенты могут быть при комнатной температуре или 37 ° С.
  6. Снимите крышку 96-луночного планшета стволовых клеток колонии и место в PLHR.
  7. Использование робота управления сенсорной панели, нажмите следующую комбинацию кнопок:
    1. Нажмите "Выполнить протокол".
    2. Выберите "Колония Урожай Колонны 2-12" и нажмите Далее.
    3. Решение Пользователь: Нажмите "Тест", чтобы использовать мастер шаг за шагом, чтобы заранее проверить выбранную программу.
      Примечание: робота не работает, а программа проверяет протокол для программных проблем. С установленными протоколами, постукивая, "пропустить настройку" является приемлемым.
    4. Нажмите "Выполнить" Протокол.
      Примечание: После того, как процедура сбора завершена, клетки будут в корыто скважины 2 и готовы для сбора.

Representative Results

Разработка пластины на основе культуры клеток платформы роботов штока.

Спрос на ИПСК растет в связи с их полезности в развитии наркотиков и регенеративной медицины. Тем не менее, масштабируемое производство сосредоточено на суспензионной культуре 32 в относительно сложного оборудования, что исключает многие исследователи и отклоняется от установленных прилипшие методов культивирования. Вместо радикально изменить проверенным пластины на основе стволовых клеток методы культивирования, такие как переключение на суспензионной культуре или с помощью микроносителю, мы сосредоточились на миниатюризации и автоматизации наших существующих методов прилипшие IPSC культуры. Первая цель была, чтобы автоматизировать кормление и пассажей, чтобы нормализовать весь процесс культуры. Платформа способна быстрого расширения с существующей технологии также требуется. Для достижения этих целей метод был разработан, чтобы культура стволовых клеток в 96-луночного планшета, использующие автоматизированную систему обработки жидкости (рисунок 1). Протocols разработанные здесь с наливных робота для кормления и прохождения не требуют шаг центрифугирования или непрерывный мониторинг техником. Эти протоколы были разработаны с двумя фидерными линиями свободных IPSC; один полученный из фибробластов, а другой из жировых клеток на 33.

Управляется компьютером системы обработки жидкости (1А) состоит из платформы, которая движется спереди и сзади. Кровать имеет девять, примерно 5 х 3,3 дюйма пронумерованные углублений зажимы, чтобы использовать стандартные пластины культуры клеток, хранилища жидких и других пользовательских аппаратных давления. Головка движется пипетки слева направо (перпендикулярно движению постели), а также вверх и вниз. Вместе с постели, пипетка головка может быть запрограммирован, чтобы удалить или поставить носитель в любом месте на кровати после получения наконечники из многоразового стойки. При необходимости каждая из 96 скважин может храниться отдельно, чтобы исключить перекрестное загрязнение. В настоящей конфигурации, от 0 до200 мкл сред могут быть перемещены с помощью каждого наконечника пипетки головы, но и другие диапазоны объема возможны в зависимости от размера наконечника.

При пассажей стволовых клеток в стандартных плит, ферментативного или химического разложения, как правило, требуется инкубации при 37 ° С. Первоначальное тестирование подтвердили диссоциации с протеолитической и коллагенолитического диссоциации реагента или реагента на основе EDTA, выполняемой лучше при 37 ° С, чем РТ как в момент диссоциации и однородности размера колоний, производимого для наших двух 96-луночных линий Ipsc (данные не показаны). Для автоматизации процесса разделения и избежать перемещения плиты и из инкубаторов, наклонных, температура контролируется пандусы, которые принимают и воспроизводимо положение стандартные культуральные планшеты были построены (рис 1А). Когда пандусы нагревали до 37 ° С, протеолитической и коллагенолитического диссоциации реагента или ЭДТК диссоциации ИПСК из 96-луночных планшетах была сравнима с пластин, помещенных в 37 ° С в инкубаторе (п данныхOT показано). Наклонные пандусы также используется для того, чтобы советы пипетки, чтобы собрать содержимое всей скважины (менее 5 мкл остаточного объема), достигнув нижней точки в скважине, тогда как стремление от плоской пластины оставил остаточный объем примерно 10-15 мкл, в результате в гибели клеток. Наклонный скат также позволило скважины для стирки (растирают) с извлечением носители в верхней части наклонной хорошо и собрать его в нижней части.

Роботизированная культивирование стволовых клеток в формате 96-луночного планшета; кормления и пассажи.

Культура ИПСК с помощью роботизированной системы обработки жидкости состоит из двух фаз; проход и кормление. При колонии готов прохода, она разделяется в заданном соотношении, чтобы отобрать новый пластину, которая затем подается через регулярные промежутки времени, пока он не будет готов к прохождению раз (Фигура 1В). Замороженные или не 96-а культуры могут быть запущены в формате 96-луночного и сразу ввести проход / каналЦикл. Клетки, которые не используются для поддержания колонии, которое большинство из пластины, собирают для других целей и представляют собой производственную составляющую этой системы.

Кормление 96-луночных культивируемых ИПСК осуществляется, когда некоторые или все среду удаляют после периода культуры и хранение в резервуар с отходами. Затем свежий СМИ аликвоты в одной тарелке. Робот может использовать новые советы и медиа корыта, чтобы отделить каждую лунку для полностью настраиваемый кормления, в том числе смешивания кондиционированной среды с новыми медиа.

Типичный проход стволовых клеток требует метод диссоциации и часто стадии центрифугирования. Протоколы, описанные здесь, стремится к нормализации диссоциации и устранить центрифугирования. Протокол проход начинается, когда робот обеспечивает диссоциации реагента в 96-луночных планшетах, установленный на 37 ° C наклонных скатов. После установленного времени, диссоциированные клетки собирают со стиральной действия, где пользователь имеет CONTROл на позиции, повторение, объема и скорости растиранием. Фермент время, скорость растирание и количество повторений Растирание было достаточно, чтобы варьировать размер диссоциирует колонии и однородность (рисунок 2), но каждый параметр регулируется, чтобы соответствовать требованиям данной ячейки линии. Этот контроль удаляет изменчивость введенную техников, которые пипеткой с различной скоростью, позиций и повторений. После диссоциированные клетки собирают и объедин ют в резервуаре свежей средой, они распределены на новый пластины. Чтобы избежать центрифугирования и посева проблемы с деградацией субстрата или гибели клеток из-за ферментов действие, диссоциация реагента разбавляют до точки минимума приемлемого диссоциации, в результате надежной посева. Эта методика была эффективна для протеолитических и коллагенолитического диссоциации реагента в mTeSR1 среды 34, которая имеет относительно высокое содержание белка, но также эффективны в малых средах белка, как основные виды 8 35

Управление плотность посева стволовых клеток после прохождения имеет первостепенное значение для повседневной и успешной культуры стволовых клеток. Сеялки слишком низко или высоко может привести к внематочной дифференциации и потери плюрипотентности в дополнение к вызывая нерегулярные интервалы проход. Типичный культура стволовых клеток зависит от соотношения расщепления, где одну лунку 6-луночного планшета в используется для семян весь новый 6-луночный планшет (1: 6) разделения. С наливных робота это соотношение можно регулировать, чтобы удовлетворить потребности пользователя (например, 1: 6, 1: 9, 1:12 и т.д.), и это имеет наибольшее влияние на отрезке прохождения. Робот может собрать меньше, чем один столбец, один весь столбец (8 лунок), или более чем одну колонку в зависимости от потребностей пользователя, которые должны быть определены опытным путем. Жировой и фибробластов, полученных иПСК поддерживается регулярный три дня кормления график с переходом на четвертый день, когда раскол 1:12, В этом случае одна колонка была собрана и использована, чтобы отобрать одну новую 96-луночного планшета, создавая 1:12 раскол с каждым циклом (фиг.3А). Остальные 11 скважин были тогда доступны для последующих применений. Для сбора этих 11 эксплуатационных скважин, протокол проход, за исключением клетки на хранение в корыто для коллекции. Альтернативно, клетки можно оставить на пластине и использовали непосредственно.

Для достижения устойчивого плотность посева пассажа к пассажу, не считая, и поддерживать обычный распорядок дня расщепления, наши протоколы требуют разделения же заданное число столбцов при колонии в идеальном плотности для прохождения. Чтобы помочь пользователю определить надлежащую плотность для прохода, ряд изображений был сгенерирован, показывающий диапазон плотностей с идеальной плотности выделенного канала (фиг.3В). Чтобы определить, когда проход, техник осматривает их пластину и сравнивает его с масштабом плотности изображения. Идеял Плотность чтобы проход был определен из культуры фибробластов жировой и полученные ИПСК и обнаружили, что, когда пространство между большинстве колоний было около 25% от диаметра смежной колонии. Важно, что колонии быть равномерно распределены. Это количество разделения колоний коррелирует с максимальной желательной плотности, так как один дополнительный цикл подачи приведет колоний прикосновения, которая является триггером для эктопической дифференцировке.

Необходимо протокол, разработанный здесь обращается, как начать культуру в формате 96-луночного и как сбросить культуры после проблемы плотности. Когда новая культура начинается, лучше плотность посева и количество циклов вскармливания перед пассирования неизвестны. Чтобы обеспечить полезную плотность после посева, робот распределяет существующие или размороженные клетки через 96-луночный планшет в серийное разведение (фиг.4А). Пример результатов такого градиента показано на рисунке 4В-E. После нескольких кормленияциклы, некоторые столбцы подойти к идеальной плотности разделить, после чего техник использует робота, чтобы отобрать равномерно разбавленный пластины, чтобы начать регулярные культуры. Этот протокол градиент плотности был также использован для восстановления регулярные интервалы прохождения и колонии однородность неправильной пластины. Если проход с задержкой или пропустил, плотность поселения и размер стать слишком высокой, в то время как, если проход слишком рано, плотность поселения является слишком низким и отдельные колонии может стать слишком большой, не будучи равномерно распределены по хорошо. Протокол градиент плотности решает эти проблемы и позволяет пользователю перезагрузить, выбирая идеально посеянных набор скважин.

Два IPSC линии остались плюрипотентные после 3 месяцев роботизированной культуры.

Обслуживание стволовых клеток плюрипотентности может оказать негативное воздействие на условия культивирования 36,37. Чтобы оценить полученный ли жировой и фибробластов IPSC линий (IPSC-F-IPSC, соответственно) поддерживается pluripotency при культивировании робота в 96-луночных планшетах в течение длительного периода времени, эти две линии культивировали на наливных робота, как описано выше, в течение 3 месяцев и затем маркеров плюрипотентности были исследованы. За этот период обе линии пассируют с протеолитическим и коллагенолитического диссоциации реагента больше, чем в 20 раз без центрифугирования. Фиксированные 96-луночные планшеты из-IPSC и F-IPSC линий, окрашенных в Oct4 и Nanog выставлены ядерной накопление этих маркеров, а SSEA-4 был замечен на поверхности клетки (рис 5А-L). Это согласуется с предыдущими сообщениями для плюрипотентных ИПСК 38 - 41. Counterstaining с DAPI не выявили каких-либо дополнительных клеток, которые не были и положительные для трех маркеров плюрипотентности. Хромосомные аномалии, как правило, наблюдается в течение стволовых клеток культуры 42,43, но не может влиять на распределение маркеров плюрипотентности, показанными на фиг.5А-L. КАнализ показал, aryotype оба робота пассировать линии IPSC было 46 хромосомы нормальные, предлагая метод роботизированная культура не ввести хромосомной нестабильности за пределы того, что может произойти, как правило (рис 5M-N).

Чтобы исследовать экспрессию гена установлено стволовыми клетками маркеров 1,41,44,45 в робота культивируемых линий Ipsc, тотальную РНК собирали параллельно окрашивания и анализа кариотипа. Оба 96-луночного планшета IPSC линии были подобные выражения плюрипотентности маркеров NANOG, POU5F1 и Rex1 тогда кардиомиоциты, дифференцированные из каждой строки не сделал, и не отдельный линию фибробластов кожи человека (HDFS) (Рисунок 6). Кардиомиоциты, полученные из обеих линий были MYL7 положительным в то время как HDFS и стволовых клеток не выражают MYL7. Обе линии IPSC были дифференцированы в кардиомиоциты с малой молекулы, Wnt техника путь манипуляции описаны недавно 46 (рис 7). Дифференцировка в кардиомиоциты в формате 96-луночного был успешным в более чем 80% скважин (данные не показаны). Вместе эти данные показывают, 3 месяца и более 20 пассажей роботизированной культуры привело к хромосомным нормальные клетки, проявляющие программу транскрипции в соответствии с плюрипотентности, которые были также способны дифференцироваться в кардиомиоциты.

Фигура 1
Рисунок 1. Обзор робота стволовых клеток культуры оборудования и типичной рутины культуры IPSC. () Роботизированная система обработки жидкости показан с типичной планировкой кровать для 96-и стволовых клеток культуру. Новые стерильные наконечники пипетки (Советы), съемный контейнер наконечник отходов (отходов), мульти-а автоклавируемый лоток для держать необходимые жидкие реагенты (Жидкости), 96-луночные планшеты позиционируются д поддерживается на контролируемой температурой, наклонный пандус (96-луночные планшеты), 8-канальный роботов пипетки голову, что движется влево / вправо и вверх / вниз (пипеткой головой). Пластина крышки проведения стойку (PLHR). Кровать номера позиции, показанные ниже в таблице. (Б) Роботизированная IPSC культура имеет две фазы: подачу и прохождение. Цикл производства клеток начинается, когда колония пластина готова к прохождению. Пользователь выбирает нужный коэффициент для прохода на семена и робот новая группа 96-луночных планшетах затем снова подается через регулярные промежутки времени, пока готовый к проходу. Когда пластины готовы к прохождению, большинство из каждой пластины не использовали для засева последующие колонии пластины и для других целей, таким образом, представляя фазу производства системы. Замороженные или существующие клеточные линии могут быть введены в любое время и сохранить в цикле подачи / прохода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

e_content "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 2
Рисунок 2. Robotic жидкие параметры обработки могут быть использованы для управления Ipsc колонии диссоциации характеристики. Каждый представитель изображение показывает фибробластов происходит иПСК диссоциируют после указанной обработки, все еще суспендируют в 96-луночных. (Верхний ряд, - С) Фермент Время, нет растирание. Фибробластов, полученных иПСК, выращенные в 96-луночных планшетах были подвергнуты увеличения времени протеолитического и коллагенолитического диссоциации диссоциации реагента и не роботизированной растиранием проводили. (Средний ряд, D - F) Скорость Растирание, в 3 минутах фермент. Клетки подвергали воздействию трех минут протеолитических и коллагенолитического лечения диссоциации реагента, а затем ростовую среду 175 мкл наносили в каждую лунку и пипеткой вверх и вниз один раз в указанном размере. мкл / сек = мкл рэ секунду. (Нижний ряд, G - I) Растирание Повторения, 3-й фермент, 160 мкл / сек. Клетки подвергаются протеолитической и коллагенолитической диссоциации реагента в течение 3 минут, 175 мкл среды для выращивания применялась, затем растирали в 160 мкл / сек для указанного количества повторений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Типичные жировой и фибробластов IPSC схема обслуживания колонии и ряд изображений плотности колонии, чтобы определить, когда отрывок поддерживать регулярный цикл загрузки / проход. () Начиная с жировой или фибробластов 96-а колония IPSC готов к прохождению, один столбец клеток пассируют на роботе, без центрифугированием и разбавляют12 новых столбцов, которые кормили через определенные промежутки времени после этого до плиты не был готов к прохождению снова. Для производства клеток, столбцы, не используемые для поддержания колонии пересевали и собирают для последующего использования. Любое количество столбцов может быть пассировать контролировать скорость расширения. (B), чтобы определить, когда проход, серия снимков плотности захватили каждые 24 ч была предоставлена ​​пользователям. В верхней красной коробке (в пределах 72 ч после первоначального посева) колония не достаточно плотной, чтобы проход и должны быть накормлены. Когда плотность соответствует показанному на зеленом поле (при ~ 96 часов), колония находится на идеальном плотности для прохождения. 120 ч колонии слишком плотное, чтобы прохода и этот сценарий следует избегать. Последнее может быть решена с плотностью посева градиента, но рутинной культуры в этой плотности не рекомендуется. Белый бар равен 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большие VERSIна этой фигуре.

Рисунок 4
Рисунок 4. 96-а Система роботизированной культуры позволяет начать культур из замороженных или активных клеточных линий и выполнить посева градиент. (А) Раствор элемента изготавливают пользователем из замороженного клеточного складе или после уборки активное культуру и помещают на роботе. Затем роботизированная система выполняет последовательный протокол разбавления для распределения исходного раствора ячейки вдоль 96-луночного планшета с градиентом плотности распределенной по столбцам. (В - Е) Примеры плотности клеток от четырех из двенадцати колонн от А, 48 ч после посева протокола градиента плотности. Белые линии составит 225 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этогофигура.

Рисунок 5
Рисунок 5. Плюрипотентность сохраняется в течение жировой и фибробластов, полученных IPSC линий в течение 96-и роботизированной культуры на 22 (жировой) или 23 (фибробластов) проходы (~ 3 месяца). (- Л) Жировая и фибробластов происходит IPSC клеточные линии с помощью робота кормят и пассируют, как описано в тексте без центрифугирования в 96-луночных планшетах в течение 22 или 23 пассажей затем фиксировали и окрашивали для маркеров плюрипотентности Oct4, Nanog, или Ssea4 с DAPI контрастирующая. Белый бар равен 100 мкм. (М - Н). Параллельные культур, которые описаны в А были представлены для анализа кариотипа который показал нормальное дополнение из 46 хромосом Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное вариант ое этой фигуры.

Рисунок 6
Фигура 6. Жировая (96-а) и фибробластов (96-F), полученный иПСК культивировали в течение более 20 пассажей в 96-луночный формат поддерживается робота экспрессию генов плюрипотентности и дифференцироваться в кардиомиоциты. Общее мРНК экстрагировали из обоих робота культивируемых линий Ipsc а также кардиомиоциты отличаются от обеих линий (CM-A = жировой IPSC, полученных кардиомиоцитов, СМ-F фибробластов IPSC получены кардиомиоциты, собранные через 14 дней после индукции дифференциации) и используется для RT-PCR, чтобы исследовать маркеров плюрипотентности NANOG, POU5F1, Rex1, кардиомиоцитов маркера MYL7 и контроль загрузки GAPDH. Человека кожные фибробласты (HDF) были также собраны и использованы в качестве, некардиомиоцитов контроля без IPSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. фибробластов и жировой получены иПСК поддерживается способностью дифференцироваться в кардиомиоциты после длительного 96-луночного культурального роботов (- Н). Жировая и фибробластов иПСК культивировали в 96-луночных робота формате более 20 пассажей дифференцировались в кардиомиоциты , 14 дней после индукции дифференциации, 96-луночного планшета связан кардиомиоциты диссоциируют и повторно наносят на низкой плотности на стеклах для иммунной окраски тропонина Т (красный), F-актин (зеленый) и ядер (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть крупная версия этой фигуры.

p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/>
Рисунок 8. Расширение пластины культуру 96-луночного стволовых клеток. Масштабирование производства стволовых клеток зависит от количества пластин, используемых на семена последующего группу пластин. Пользователь может либо сохранить один уровень производства путем пересева такое же количество пластин в каждой разделенной или возможность расширения производства путем посева больше пластин. Например, в цикле 0, один 96-луночный планшет пассируют до двенадцати новых пластин (цикл 1), создавая 12 кратное увеличение. Эта скорость может быть сохранена, если один из двенадцати пластин пассируют на новый набор из двенадцати пластин (цикл 1 до 2), или расширяется пассажей несколько пластин (цикл 2 до 3). Во время прохождения, либо пластины не используются для поддержания колонии доступны для последующих применений. Таким образом, пассажей 12 пластин обычно может дать больше, чем 144 пластин в двух местах: 12 для обслуживания колонии и 132 для других целей."> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9
9. Эффективность 96-луночные культуральные пластины, основанного на производство клеток значительно превышает ручной культивирование. Как показано на рисунке 8, одна пластина может быть пассируют, чтобы отобрать двенадцать пластины, которые затем могут быть пассировать до 144 пластин. Это скорость расширения может быть достигнуто двумя сплит возможностей. Техник требуется около 3,5 минут, чтобы прокормить одного 6-луночный планшет в то время как они проводят около 30 сек с одним 96-луночного планшета для изучения его на микроскоп и поместить его на роботе. Если техник проведения 144 пластин, они будут тратить около 1,2 HR обработки пластин при кормлении с роботом, тогда как ручной культуры потребуется специальный 8 ч, чтобы накормить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы противМЭН большую версию этой фигуры.

Discussion

В настоящем исследовании мы разработали метод роботизированной культуры для IPSC производства, miniaturizes и автоматизирует подачу и прохождение в формате пластины 96-а, а также позволяет эффективно масштаба вверх. Наливных робот был использован в плановом порядке кормить IPSC колонии и прохождение их через регулярные промежутки времени путем ферментативного разложения. Робот также запрограммированы, чтобы произвести планшетах, покрытых внеклеточный матрикс геля и выполнить градиент плотности посева. Когда фибробластов и жировой получены иПСК культивировали в этой системе в течение более чем 20 пассажей, около 3 месяцев, плюрипотентности поддерживали, как и стабильные кариотипы. Обе клеточные линии были способны дифференцироваться в кардиомиоциты. Вместе коллекция протоколов описано здесь позволяет пользователям с очень небольшим опытом культуры стволовых клеток, или ограниченный доступ к специализированным оборудованием культуры, культуры стволовых клеток и достичь высоких производственных клеток или мульти-линии обработки с минимальным труда и стоимости.

44,47 - 49 для поддержания плюрипотентности. В то время как другие форматы масштабируемых урожая стволовых клеток культуры плюрипотентных клеток 20,23,29 эта пластинка основе метод не требует никаких изменений по существу в формате культуры, как адаптации к суспензии, использование химических веществ или противопенные длительное использование Ро-киназы ингибитор 20. Этот метод основан пластина может поэтому быстро и предсказуемо, размещения новых линий, так как условия культивирования схожи. Как использование ИПСК для моделирования заболевания увеличивается 4,6,19,50, новые линии IPSC генерируются непрерывно. Методы, описанные здесь, лучше всего подходят для культивирования новых линий в среде с большим объемом и пропускной потому препятствием для перехода на формате лвл. Это также верно для труда и оборудования, необходимого для поддержания колонии. Наконец, потому, что формат и обработки похожи на окружающую среду, используемого для получения и проверки IPSC линий, производительность культуры, такие, как направленной дифференцировки, вероятно, будет более предсказуемым.

8 иллюстрирует одну стратегию для увеличение масштаба производства стволовых клеток в 96-луночных планшетах. Одна пластина (цикл 0) используется для робота семян 12 новых пластин, увеличение в 12 раз (цикл от 0 до 1). После нескольких дней кормления, один из двенадцати пластин пассируют на семена другой набор из двенадцати пластин (цикл 1 с циклом 2). Остальные одиннадцать пластины теперь доступны для других целей и представляют собой производственную компонент системы. В этом случае, прохождение одной пластины обеспечит 11 пластин каждый цикл или каждые 3-4 дня. Эта методика может быть расширена более, когда несколько пластин пассируют, как показано на переходе от цикла к циклу 2 3. В цикле 3, две пластинывсегда используется для поддержания колонии и семян 24 новых пластин. Остальные 22 пластины будут доступны для использования после каждого цикла прохода. В любой момент в цикле обслуживания пользователь может отобрать больше пластин, чтобы увеличить производство. Одним из примеров может быть проход каждый столбец в течение двух циклов роста. Первый проход преобразует одну пластину на двенадцать пластин, и каждый из двенадцати пластин используется для семян 144 пластин. В этом случае пользователь начинает с одной пластиной и после двух проходов, или около 1,5-2 недель культуры, 144 пластин. Например, фибробластов и жировой Ipsc линии дают примерно 25-75 миллионов клеток на 96-луночный планшет при прохождении готов. Поэтому 144 пластины могут представлять около 4-7 х 10 9 клеток.

Что труд бременем для проведения 144 96-луночных робота? Одна из целей для этой работы было масштабируемое производство стволовых клеток, что сокращение рабочей силы по сравнению с традиционным (т.е. 6-луночного планшета) культуры клеток стволовых клеток. Робот Точностьomplishes это путем уменьшения необходимости физически справиться каждой пластины во время кормления и пассажей. В то время как 96-а производство плиты весы линейно, как это было в традиционных пластин 6-а, раз техник проводит работы с пластинами значительно меньше помощью робота культуры. Эффективность производства роботизированной культуры происходит от этой разности (рисунок 9). Было обнаружено техники смогли удалить 6-луночного планшета из инкубатора, проверить его на микроскопе, то аспирации и кормить пластину в приблизительно 3,5 минут. Для сравнения, технические провести приблизительно 30 сек удаление 96-луночного планшета из инкубатора и проверки его на микроскоп для плотности и загрязнения перед установкой ее на робота. С расширенного протокола подачи аналогично описанному выше, шесть 96-луночных планшетов могут быть загружены и кормили, который занимает приблизительно 21 мин, или 3,5 мин на пластины. Общее время кормить тарелку сопоставима между роботомIC и ручные методы, но в руки корма 6 тарелок техник требуется для всех 21 мин, тогда как техник проводит только 3 мин обработки шесть пластин для робота (30 сек инспекции на чашку). Как показано на рисунке 9, время техник проводит обработку 144 пластин с помощью робота составляет около 1,2 ч, в отличие от 8 часов вручную и робот никогда не будет делать обработку ошибка пластин или перекачки жидкостей.

В 96-а IPSC способы культивирования, описанные здесь, обеспечивают послушное платформу для сложных задач скрининга. Из каждой лунки генетически идентичны и высевали при одинаковой плотности с той же начальной бассейн, переменные могут быть распределены по пластине и поддерживается робота с коммерчески доступных резервуаров для разделения условий. Это было бы полезно для экспериментов, таких как рост стволовых клеток развития средств массовой информации 34,35,47, подложки или состояние культуры испытаний и исследований токсичности с использованием стволовых клеток51. Поскольку каждый стволовых клеток линии является уникальным с точки зрения оптимального размера колонии и прохождения требований, можно использовать эту систему, чтобы модулировать посева плотность, кормление частоты и обработку проход, манипулируя столбцы собирают, механическое перемешивание во время прохождения и частоту кормления. Перебор этих переменных позволит пользователю быстро найти набор условий, пригодных для культуры новой линии или разработать новые методы культуры. Роботизированная система также способна поддерживать 96 параллельных, но независимых колоний стволовых клеток. Когда IPSC получены из соматических клеток или клонировать после генетической манипуляции, многие параллельные клонов скрининг для получения потенциальных линий IPSC. После отдельные клетки высевают в 96-луночные планшеты, эта система может питать и прохождение в 96-луночных планшетах хранения каждой колонии отделены. Это позволяет очень высокую пропускную способность при выборе потенциальных клонов и устраняет трудности в физическом культивирования 96 параллельных линий. Этот метод такжеllows масштабируется до производства каждого клона, чтобы материал легко доступен для параллельного анализа. Наконец, мы предполагаем интеграции этих методов культуры с роботизированной системой торговли пластины, что обеспечивает пластины и из инкубатора, позволяющей полностью автоматизированный культуру. Это может быть достигнуто с более сложных роботов, которые позволяют большему расширению поскольку основные протоколы, описанные здесь, могут быть перенесены на другие системы на основе пластины.

Первые важные шаги по решению в протоколах являются те, которые предотвращают и проверить на наличие загрязнений, таких как шаги 1,5 и 4,2. Загрязнение, как обсуждалось выше, может быть с успехом избежать, если хорошо стерильных и здравый смысл используются. Это важно, независимо от формата стволовых клеток культуры, что проверка оператор загрязнения и делает так в этом протоколе в указанных шагов позволит значительно снизить риск заражения. Правильное применение внеклеточного матрикса гель второй ESSференциальное шаг к общему успеху этого протокола. Без правильно покрытия 96-луночных на стволовые клетки не будут расти. Один распространенной проблемой является неполным покрытием хорошо. Опыт показал, что пузырьки воздуха, электростатическое притяжение и капиллярное действие помешать полное покрытие хорошо. Шаг предварительного увлажнения (1.6) была разработана с целью значительно улучшить призабойной покрытие и не должны быть пропущены. Это появляется Предварительное смачивание шаг, чтобы уменьшить видимую гидрофобность пластиковой 96-луночного планшета, так что, когда внеклеточный матрикс геля покрытие наносится она равномерно распределена по всей также снизу и по бокам. Рекомендуется также, чтобы мягко нажмите 96-луночных на против чистой стороны сразу покрытием, чтобы гарантировать даже внеклеточного матрикса геля распределение решение. Параметры диссоциации также важны для оптимизации. Расширенный инкубации с ферментом или на основе ЭДТА диссоциации реагента приведет в одиночных камерах, которые могут или не могут быть целью во время прохождения. Таким образом, операторследует обратить особое внимание на то, как время диссоциации, растирание сила, и мыть повторений повлиять морфологии колоний и здоровье и настроить соответствующим образом.

Понимание ограничений методикам, описанным здесь первостепенное значение для успешной работы. Как и в любом другом установки для культивирования клеток, использование 96-луночных планшетах представляет собой относительно высокий риск загрязнения. Как описано выше, техник обработки каждого пластину во время кормления и пассирования; например, при открытии крышки, помещая пластину на кровати робота, и проверка пластину на микроскопе. Поэтому, как отметил после шага 1.5, необходимо, чтобы не касаться внутренней любой пластины крышки и не подвергайте эту часть к любой потенциально загрязненной поверхности, например, наклонных нагревательных блоков или вертикальных штифтов на кровати. Во время разработки протокола это ограничение было обнаружено и стало толчком для развития стойку для хранения пластин крышки для поддержания стерильности. Аналогично, корыто резервуары, пипетки советы и оþér поставляет на жидком кровати обращение робота являются потенциальными источниками загрязнения, потому что они открыты для окружающей среды и обрабатывается специалистом. Таким образом, хороший метод стерилизации следует применять такие, как сокращение движения на открытых культуры материалов или открытых жидкостей. Еще одно ограничение, что когда протокол масштабируется до визуально проверять каждый колодец> 100 96-луночных планшетах является громоздким. Это может рассматриваться визуально осматривает целую тарелку признаков загрязнения, таких как мутных средах, для выявления подозрительных скважин. Для дальнейшего расширения мер, использование автоматизированной микроскопом и индикатором роста клеток и возможного загрязнения будут включены.

Таким образом, с высокой пропускной способностью 96-луночный платформа описано здесь предлагает воспроизводимый метод, высокой точностью воспроизведения для культуры и производства стволовых клеток в формате пластины. Этот метод уменьшает необходимый опыт, оборудование, необходимое и рабочее время, посвященное стволовых клеток культуру,поддержание преимущества традиционной культуры прикрепленных.

Disclosures

Авторы МКС, MJG, ЕЭБ, NJD и RO или были в то время сотрудников развития InvivoSciences, INC, которые задумал и разработал роботов протоколов, описанных здесь. TW является ОГО для InvivoSciences INC. SH является сотрудником Gilson INC.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана NIH гранты, R44 GM087784 и R01 HL109505. Авторы благодарят техническую и OEM команду на Gilson, INC течение длительного технической поддержки.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34 (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111 (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4 (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5 (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11 (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8 (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6 (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18 (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16 (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6 (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77 (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451 (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113 (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3 (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30 (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105 (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. , (2014).

Tags

Биология развития выпуск 99 IPSC высокая пропускная способность роботизированная жидкости обработки масштабируемая стволовые клетки автоматизированное культуру стволовых клеток 96-а
Масштабируемость 96-луночного планшета основании IPSC Культура и производства с помощью роботизированной системы наливных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, … More

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter