Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.
Methodenartikel
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Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.
Der Zebrafisch ist zu einem sehr wichtigen Modellorganismus für die Erforschung der Entwicklung, Physiologie, Krankheit und Geweberegeneration von Wirbeltieren geworden. Ein umfassendes Verständnis der beteiligten molekularen und zellulären Mechanismen erfordert experimentelle Werkzeuge, die eine induzierbare, gewebespezifische Manipulation der Genexpression oder der Signalwege ermöglichen. Daher haben wir und andere das TetON-System kürzlich für den Einsatz im Zebrafisch angepasst. Das TetON-System ermöglicht die zeitlich und räumlich kontrollierte Genexpression, und wir haben dieses Werkzeug kürzlich verwendet, um gewebespezifische Funktionen des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs während der Regeneration der Schwanzflossen von Zebrafischen zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine induzierbare, gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen. Dazu gehören die Generierung stabiler transgener TetActivator- und TetResponder-Linien, die Transgen-Induktion und Techniken zur Verifizierung der gewebespezifischen Genexpression im Flossenregenerat. Somit dient dieses Protokoll als Blaupause für den Aufbau eines funktionsfähigen TetON-Systems im Zebrafisch und dessen anschließende Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Flossenregeneration.
Der Zebrafisch ist ein gut etabliertes Wirbelmodellorganismus, um viele Aspekte der Entwicklung, der Physiologie, Krankheiten und Regeneration zu studieren. Mit der wachsenden Annahme der Zebrafisch als Modell für die post-embryonale biologische Prozesse, experimenteller Werkzeuge zur induzierbaren, gewebsspezifischen Manipulation der Genexpression oder Signalwege immer wichtiger geworden. Besonders haben Studien in Orgel und Anhängsel Regeneration im erwachsenen Zebrafisch aus einem Mangel an Tools für die Präparation der raum-zeitlichen Anforderungen von Signalwegen in diesen Regenerationsprozesse erlitten.
Derzeit sind drei verschieden....
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1. Herstellung transgener TetActivator Fisch-Linien
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Um eine Funktions Teton System für gewebespezifische induzierbaren Genexpression, transgene TetActivator und TetResponder Linien etablieren müssen generiert werden (Abbildung 1A). Dies wird durch Mikroinjektion TetActivator (1B - C) erreicht oder TetResponder (1E) Konstrukte in frühen Zebrafischembryonen und anschließender Keimbahn-Integration. Funktions TetActivator Konstrukte können entweder durch Klonen von kurzen Regulationssequenzen (Enhancer-Eleme.......
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Die erwachsenen Zebrafisch hat eine erstaunliche Fähigkeit, viele der inneren Organe und Anhänge erfolgreich zu regenerieren. Ein gründliches Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen erfordert gewebespezifische Analyse von Gen-Funktionen und Signalwege. Auf dem Weg zu diesem bietet die Teton-System ein effizientes Werkzeug für die raumzeitlich gesteuerte Genexpression in embryonalen und erwachsenen Zebrafisch. Die Teton System Konstrukte und Methoden in dieser Handschrift beschrieben wurden erfolgreich in .......
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Die Autoren danken Christa Haase, Doris Weber und Brigitte Korte für die technische Unterstützung. Arbeit im Labor Weidinger durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1 unterstützt, WE 4223 / 4-1 und von der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie über eine Oskar-Lapp-Stipendium und ein Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zuchtboxen | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Zusammengesetztes Fluoreszenzmikroskop | z.B. Leica, Zeiss | variiert je nach Hersteller | zur Abbildung von fluoreszierenden Gewebeschnitten |
| Konfokales Mikroskop | z.B. Leica, Zeiss | variiert je nach Hersteller | zur Abbildung von fluoreszierenden Gewebeschnitten |
| Kryostat | z.B. Leica, Thermo-Scientific | variiert mit dem Hersteller | für Kryosektionen |
| 4', 6-Diamidino-2-phenylinodol (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | verwenden 1/5.000 in PBS zur Visualisierung von Zellkernen |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | bereiten Brühen in 50% EtOH bei 50 mg/ml (97 mM) für TetResponder-Induktion |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | vor4% (w/v) Paraformaldehyd in PBS, pH 7,5 zur Fixierung |
| 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) | 1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 | ||
| 1x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung + Tween 20 (PBT) | 1x PBS mit 0,1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus Adhäsionsmikroskop-Objektträger | Thermo Scientific | 1014356190 | für die Entnahme von Gewebeschnitten |
| Stereo-Fluoreszenzmikroskop | z. B. Leica, Zeiss, | variiert mit dem Hersteller | für die fluoreszenzbasierte Genotypisierung |
| Thermocycler | , z. B. Biorad, Applied Biosystems | variiert mit dem Hersteller | für PCR-basierte Genotypisierung |
| Tissue Freezing Medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | für die Einbettung von Gewebe Proben |
| Tricain (L-Ethyl-m-amino-benzoat-methansulfonat/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | zur Anästhesie Anwendung bei 1 mg/ml im E3-Embryomedium |
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