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Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

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DOI:

10.3791/52756

⸱

25. Juni 2015

 ,  , 
1Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Ulm University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch ist zu einem sehr wichtigen Modellorganismus für die Erforschung der Entwicklung, Physiologie, Krankheit und Geweberegeneration von Wirbeltieren geworden. Ein umfassendes Verständnis der beteiligten molekularen und zellulären Mechanismen erfordert experimentelle Werkzeuge, die eine induzierbare, gewebespezifische Manipulation der Genexpression oder der Signalwege ermöglichen. Daher haben wir und andere das TetON-System kürzlich für den Einsatz im Zebrafisch angepasst. Das TetON-System ermöglicht die zeitlich und räumlich kontrollierte Genexpression, und wir haben dieses Werkzeug kürzlich verwendet, um gewebespezifische Funktionen des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs während der Regeneration der Schwanzflossen von Zebrafischen zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine induzierbare, gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen. Dazu gehören die Generierung stabiler transgener TetActivator- und TetResponder-Linien, die Transgen-Induktion und Techniken zur Verifizierung der gewebespezifischen Genexpression im Flossenregenerat. Somit dient dieses Protokoll als Blaupause für den Aufbau eines funktionsfähigen TetON-Systems im Zebrafisch und dessen anschließende Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Flossenregeneration.

Einleitung

Der Zebrafisch ist ein gut etabliertes Wirbelmodellorganismus, um viele Aspekte der Entwicklung, der Physiologie, Krankheiten und Regeneration zu studieren. Mit der wachsenden Annahme der Zebrafisch als Modell für die post-embryonale biologische Prozesse, experimenteller Werkzeuge zur induzierbaren, gewebsspezifischen Manipulation der Genexpression oder Signalwege immer wichtiger geworden. Besonders haben Studien in Orgel und Anhängsel Regeneration im erwachsenen Zebrafisch aus einem Mangel an Tools für die Präparation der raum-zeitlichen Anforderungen von Signalwegen in diesen Regenerationsprozesse erlitten.

Derzeit sind drei verschiedene Systeme verwendet worden, um bedingte, gewebespezifische Genexpression in regenerierenden Organen erwachsenen Zebrafisch zu erzielen: das Cre-lox-System, Mosaik Expression von Hitzeschock induzierbares Transposon-Transgenen mit vermittelte somatischen Transgenität und die TetOn System 1 -3. TetOn bezieht sich auf eine Variante eines Tetracyclin-contgewalzten Transkriptionsaktivierungssystems, wobei die Expression in Gegenwart des Antibiotikums Tetracyclin oder einem Derivat, beispielsweise Doxycyclin aktiviert. Die Cre-lox-System, wie es bisher in ausgewachsene Fische verwendet wurde, stützt sich auf eine Tamoxifen-gesteuert Cre-Rekombinase (CreERT2), deren Expression räumlich durch gewebespezifische regulatorische Elemente beschränkt. Cre gesteuerte Entnahme einer Stop-Kassette ermöglicht die Expression des Gens von Interesse von einem Promotor, der in allen Zelltypen 1 aktiv sein soll angetrieben. Transposon-vermittelte Erzeugung von mosaik ausgedrückt somatischen Transgenen stellt ein System für die induzierbare Expression des Transgens in den einzelnen Zelllinien. Die Injektion von Zebrafischembryonen mit einem Tol2 Transposon trägt ein Gen von Interesse unter der Transkriptionskontrolle eines Hitzeschockpromotor Ergebnisse in chimären Individuen in der Regel trägt das Transgen nur in diskreten Zelllinien aus einer regenerierenden Orgel 2. Während beide Systeme ermöglichen bedingte Gewebe spesche Genexpression ist das Cre-lox-System nicht reversibel, und die Strategie mit einem Transposon-beruhenden klonalen Kennzeichnung leidet ihre stochastische Natur. So haben wir und andere kürzlich transgenen Teton Systeme für den Einsatz in Zebrafisch, der zeitlich und räumlich gesteuerte Genexpression, die zusätzlich abstimmbaren und reversible 3-5 ist zu erleichtern angepasst.

Die Teton System besteht hier aus einem transgenen Fahrer (TetActivator), in dem ein Doxycyclin (DOX) -induzierbaren Transkriptionsaktivator (verbesserte Umkehr Tetracyclin-Transaktivator, irtTA, kurze TETA) ist unter Kontrolle von gewebespezifischen genomischen regulatorischen Sequenzen. Zweitens bedarf es einer transgenen Responderlinie (TetResponder), die ein Gen von Interesse unter der Transkriptionskontrolle des Tetracyclin-Operator Häfen (Tet-Response-Element; Tetre) (Abbildung 1A). Somit ermöglicht die Verwendung von spezifischen Kombinationen von TetActivator und TetResponder Leitungen für bedingten gewebespezifischenFIC Manipulation der Genexpression.

Wir haben vor kurzem nutzte die Teton-System für gewebespezifische Funktionen des Wnt / beta-Catenin-Signalweg in der erwachsenen Zebrafisch Regenerieren Schwanzflosse 3 zu untersuchen. In dem Protokoll hier skizzierten beschreiben wir einen Workflow für Aufbau und Nutzung der Teton-System in Zebrafisch, insbesondere für Studien der fin Regeneration. Dieses enthält detaillierte Anweisungen zum stabilen transgenen TetActivator und TetResponder Linien zu erzeugen, und ein Protokoll für die Induktion Transgen in Embryonen und erwachsenen Zebrafisch. Ferner beschreiben wir Verfahren zur Überprüfung der gewebespezifischen Genexpression in der Rippe Regenerat, einschließlich eines Protokolls zur Herstellung von Gefrierschnitten von adulten Zebrafischflossen. Zusätzlich diskutieren wir Überlegungen für den Entwurf des TetActivator Transgen, die Wahl eines Transgeneseverfahren und Nachweis von TetResponder Ausdruck. Daher ist das übergeordnete Ziel dieses Protokolls als Blaupause dienenfür den Aufbau einer funktionellen Teton Systems im Zebrafisch zu bedingten gewebespezifische Genexpression, die zu jedem Gewebe von Interesse angewendet werden kann, zu erreichen.

Wir haben eine TetActivator der Vektor ermöglicht für I-SceI oder Tol2 vermittelte Erzeugung stabiler TetActivator Linien mit kurzen genomischen regulatorischen Sequenzen erzeugt (Enhancer Fragmente; Weidinger lab Plasmid Datenbank nicht 1247;. 1B). Dieses Konstrukt enthält eine TetActivator Kassette, bestehend aus dem M2 mutierten Variante der reversen Tet-Repressor-Domäne mit dem Herpes simplex-Virus VP16-Transaktivierungsdomäne-Derivat 3F [irtTAM2 (3F)] fusioniert. Expression des TetActivator (TETA) kann leicht überwacht werden, da es coexprimiert mit dem Fluorophor AmCyan aus demselben offenen Leserahmen; a p2a Peptid vermittelt ribosomalen Skipping, die bei der Herstellung von TETA und AmCyan als separate Proteine ​​bei einer 1 führen sollte: 1-Verhältnis 5,6. Das Konstrukt enthält auch eine poylinker 5 'der TetActivator Kassette, um die Einführung der genomischen regulatorischen Sequenzen von Interesse unter Verwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren zu erleichtern.

, Der in ein bakterielles künstliches Chromosom rekombiniert werden können (BAC), die eine große genomische Region (; Zusätzlich haben wir ein Konstrukt, bestehend aus dem oben beschriebenen Kassetten TetActivator plus Kanamycin-Selektionskassette (. 1C Weidinger lab Plasmid Datenbank nicht 1180) erstellt in der Regel in dem Startcodon eines Gens, dessen Expressionsmuster ist durch das Transgen nachgeahmt werden). Beide Konstrukte sind von der Weidinger Labor auf Anfrage erhältlich.

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Protokoll

1. Herstellung transgener TetActivator Fisch-Linien

  1. Generation TetActivator Konstrukt
    1. Clone regulatorischen Sequenzen von Interesse vor dem TetActivator Kassette in vector # 1247 Verwendung von Standardtechniken. Alternativ können Rekombinationstechniken, um eine BAC, wobei die TetActivator Kassette (Vektor # 1180) wird in das erste Exon des Zielgens eingesetzt erzeugen, und wobei die Tol2 invertierten Wiederholungen werden in den BAC Rückgrat eingeführt (eine detaillierte Rekombinationstechnologie Protokoll siehe 7,8).
    2. Vorbereitung giftfreies Plasmid-DNA oder BAC-DNA-Präparationen unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits.
  2. Erzeugung transgener TetActivator Fischlinien
    1. Zuführen Mikroinjektion der TetActivator Konstrukt nach Standardverfahren 9.
      1. Injizieren 25-50 pg der Plasmid-DNA oder bis zu 250 pg BAC-DNA in einem zell Embryonen zusammen mit verkappten sense RNA codiert, TOL2 transposase für Transposon-vermittelte Transgenese oder mit I-SceI Protein für I-SceI-vermittelte Transgenese.
        HINWEIS: Überlegungen zur Wahl der Transgenese Methode kann in der Diskussion Abschnitt.
        HINWEIS: vorzugsweise Injizieren in das Zytoplasma, das Eigelb nicht, da die Effizienz der Transgenese könnte verringern, wenn die DNA nicht in das Zytoplasma geliefert.
    2. Heben injiziert G0 Embryonen bis zum Erwachsenenalter. Optional Bildschirm G0 Embryonen für AmCyan Fluoreszenz und bevorzugt wachsen Embryonen, die die gewünschte Expressionsmuster. Dies kann die Geschwindigkeit der Keimbahn-Getriebe, insbesondere für Tol2-vermittelte Transgenese zu erhöhen.
    3. Beurteilen erfolgreiche Keimbahn-Integration durch Auskreuzen einzelnen G0 Fisch zu Wildtyp-Fisch und Aussehen AmCyan Fluoreszenz in der erwarteten Expressionsmuster in F1 Embryonen oder Larven unter Verwendung eines Fluoreszenz-Stereomikroskop (beispielsweise wird in 1D gezeigt).
    4. Heben Fluoreszenz-positivenF1 Embryonen bis zum Erwachsenenalter und paaren sie mit Wildtyp-Fisch, stabile F2 transgenen Fischen zu erhalten.
    5. Zu erhöhen und zu charakterisieren mindestens 3 verschiedene Unterlinien aus verschiedenen G0-Gründer Fischen stammen, da einzelne Zeilen könnte in Expressionsniveaus, Expressionsmuster, die Fähigkeit, TetResponder Linien, Undichtigkeit zu induzieren, und ihre Anfälligkeit für Silencing abweichen.
      Hinweis: Für viele Transgene, die robust in Embryonen exprimiert werden, sind ganz oder teilweise in der späten Phase Larven oder Erwachsener Fisch zum Schweigen gebracht. Wenn also Linien sollen in ausgewachsene Fische verwendet werden, kennzeichnen mehrere unabhängige Linien für ihre TetActivator Expression und Funktion im Erwachsenenalter.
      Anmerkung: Wir haben eine Gruppe von TetActivator Linien für gewebespezifische Expression des TetActivator sowohl Embryonen und erwachsenen Fischen, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, erzeugt Diese Linien sind von der Weidinger Labor auf Anfrage erhältlich..

2. Erzeugung von transgenen TetResponder Fisch-Linien

HINWEIS: Wir haben eine TetResponder Konstrukt so dass für I-SceI oder Tol2-vermittelte Erzeugung von stabilen TetResponder Linien, die auf Anfrage bei der Weidinger Labor ist (. 1E Weidinger lab Plasmid-Datenbank nicht 1444) generiert. Dieses Konstrukt enthält ein Tetracyclin-Operator, gefolgt von einer Polylinker-Region, die das Einführen des kodierenden Sequenzen (CDS) eines Gens von Interesse und des YFP-Derivat YPet kodierenden Sequenz. Somit wird das Konstrukt zur TetA vermittelte Expression einer C-terminalen Fusion des Proteins von Interesse mit YPet gestaltet. Wenn die Expression eines tagged Fusionsprotein vermieden werden soll, kann eine oder p2a t2a Peptids mit dem Gen von Interesse CDS, die Co-Expression des Proteins von Interesse und YPet als separate Polypeptide 6,10 erleichtert eingeführt werden.

  1. Generation TetResponder Konstrukt
    1. Clone CDS von dem interessierenden Gen 3 'des Tetracyclinoperatorund 5 'der YPet CDS nach Standardverfahren. Sicherzustellen, dass das Stopp-Codon wurde von dem interessierenden Gen CDS entfernt.
    2. Vorbereitung giftfreies Plasmid-DNA-Präparationen unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits.
  2. Erzeugung transgener TetResponder Fischlinien
    1. Zuführen Mikroinjektion von TetResponder Konstrukt nach Standardverfahren 9.
      1. Injizieren 25-50 pg der Plasmid-DNA in das Cytoplasma eines zell Embryonen zusammen mit verkappten sense RNA codiert, TOL2 Transposase für Transposon-vermittelte Transgenese oder mit I-SceI Enzym für Meganuclease gestützten Transgenese.
        HINWEIS: Überlegungen zur Wahl der Transgenese Methode kann in der Diskussion Abschnitt.
        HINWEIS: vorzugsweise Injizieren in das Zytoplasma, das Eigelb nicht, da die Effizienz der Transgenese könnte verringern, wenn die DNA nicht in das Zytoplasma geliefert.
    2. Heben injiziert G0 Embryonen eindulthood.
    3. Beurteilen erfolgreiche Keimbahn-Integration und Induzierbarkeit des Transgens durch Paarung einzelnen G0 Fisch mit einem vorher festgelegten TetActivator Linie gefolgt von Doxycyclin Behandlung von Embryonen oder F1 F1-Larven.
      HINWEIS: Normalerweise verwenden wir eine Ubiquitin-Promotor-driven TetActivator Linie (Ubiquitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, kurze Ubiquitin: TetA AmCyan 3), die für Funktionsträger TetResponder Bildschirm, da diese Linie fährt ziemlich ubiquitäre Expression in Embryos und Erwachsenen Fisch und somit gut geeignet, um TetResponder Induzierbarkeit in allen Geweben von Interesse zu bewerten. Diese Zeile ist von der Weidinger Labor auf Anfrage.
    4. Sammeln Embryonen jeder Kupplung in einem separaten 10 cm Petrischale mit E3 Embryo Medium (siehe Materialien Tabelle) und Inkubation Gerichte bei 28,5 ° C.
    5. Platz G0 Fische, die Embryonen in einzelne nummerierte Panzer gab (Brutkästen, siehe Werkstofftabelle), bis Embryonen Bildschirm gewesened. Dies ermöglicht die Rückgewinnung von G0 Fische, die Keimbahntransmission des Transgens zeigen.
    6. Wenn nur die Hälfte der Embryonen werden erwartet, die TetActivator Transgen (falls eine heterozygote TetActivator Träger wurde auf eine TetResponder Gründer Fisch gekreuzt) durchführen, wählen Sie für Embryonen, die das Transgen durch TetActivator Aussehen AmCyan Fluoreszenz an der entsprechenden Entwicklungsstadium.
    7. Induzieren TetActivator Transkriptionsaktivität durch Behandlung Embryonen mit Doxycyclin (DOX), wie in Abschnitt 2.3 beschrieben.
    8. Bildschirm F1 Embryonen für Entstehung YPet Fluoreszenz. Bevorzugen Linien (G0 Fisch), die homogene YPet Ausdruck erzeugen, dh Embryonen in der Kupplung sollte wenig Mosaik im erwarteten Expressionsdomäne und wenig Variation zwischen einzelnen Embryonen anzuzeigen. Siehe Pfeilspitzen in 1F und 1G für repräsentative Beispiele.
    9. Mate-G0 Fisch Übertragung eines induzierbaren TetResponder Transgen in identifiziertSchritt 2.2.8 mit Wildtyp-Fisch und heben alle F1 Embryonen bis zum Erwachsenenalter.
    10. Identifizieren Erwachsenen F1 transgene Fische entweder durch PCR-basierte Genotypisierung (siehe Abschnitt oder durch Kreuzung einzelnen F1 Fisch zu einem TetActivator Linie gefolgt von DOX Behandlung von F2 Embryonen und Entstehung YPet Fluoreszenz (siehe Abschnitt 2.5).
    11. Herzustellen und zu charakterisieren, mindestens 3 verschiedene TetResponder Unterlinien aus verschiedenen G0-Gründer Fischen stammen, da Induzierbarkeit könnte in einzelnen Zeilen unterscheiden. Insbesondere erreichbaren Expressionsniveaus und ob kann der Responder in allen Zelltypen aktiviert könnte variieren. Darüber hinaus wird die Anfälligkeit für silencing zwischen Zeilen unterscheiden. Schließlich können in einigen Fällen bevorzugt, um Linien, die nur moderate Expression von dem Protein von Interesse zu vermitteln, insbesondere wenn leaky-Expression in Kombination mit einer TetActivator Linie in Abwesenheit von Doxycyclin erzeugt wird erwartet, dass Entwicklungsfehler oder Toxizität verursachen wählen könnte.
      HINWEIS: TetResponder Linien, die in Embryonen robust induzierbaren sind entweder teilweise oder vollständig in der späten Phase Larven oder Erwachsener Fisch zum Schweigen gebracht werden. Wenn also Linien sollen in ausgewachsene Fische verwendet werden, mehrere unabhängige Zeilen sollten für Induzierbarkeit bei Erwachsenen charakterisiert werden. Wenn Induktion des Gens von Interesse ist mit der weiteren Entwicklung vereinbar ist, hat es sich als sinnvoll erwiesen, doppelt transgenen Embryonen (TetActivator x TetResponder) zu erstellen, zu GOI Ausdruck in Embryonen zu induzieren und wählen Sie und heben nur die Personen, die die robustesten und am wenigsten Mosaik Induktion.
    12. Zu erhalten und zu verbreiten gegründet TetResponder Linien, Genotyp wachsene Fische, wie in Abschnitt 2.5 beschrieben).
  3. Doxycyclin Behandlung von Embryonen
    1. Bereiten 2,000x Doxycyclin (DOX) Aktien. Lösen DOX in 50% EtOH, um eine Konzentration von 50 mg / ml (97 mM) zu erreichen. Shop DOX Aktien von Licht bei -20 ° C geschützt.
    2. Man dekantiert die Mehrheit der E3 Medium von Embryonen und ersetzen Sie es mitE3 Embryo enthaltenden Medium DOX in einer Endkonzentration von 25 ug / ml DOX (2,5 ul 2,000x DOX Stock je 50 ml E3). Dechorionation ist nicht erforderlich.
    3. Zurück Embryonen auf 28,5 ° C für mindestens 6 Stunden vor der Bewertung der Expression des Gens von Interesse tagged durch Erscheinungsbild YPet Fluoreszenz.
    4. Beurteilen Sie Undichtigkeit der TetActivator / TetResponder Kombination durch die Behandlung mit Embryonen nur EtOH Lösungsmittel.
      HINWEIS: In situ-Hybridisierung (ISH) oder RT-PCR, um die TetResponder mRNA detektieren kann als empfindlicher Maßnahmen leakiness als Fluoreszenz des markierten Gen von Interesse verwendet werden. Das Ausmaß der Undichtigkeit hängt von der speziellen TetActivator / TetResponder line-Kombination abhängen und es kann auch zwischen Geweben und Entwicklungsstadien unterschiedlich sein.
  4. Anästhesie der erwachsenen Zebrafisch
    1. Herstellung von 10 cm Durchmesser Petrischale oder ein kleines Becherglas mit Fischsystem Wasser mit 1 mg / ml Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoat methanesu gefülltenlfonate, MS-222).
    2. Übertragen Fisch Behälter, Anästhesie und warten, bis es Stufe 4 der Anästhesie reicht von kompletten Verlust des Gleichgewichts (Fisch liegt auf ihrer Seite), keine Bewegung und keine Reaktion auf Berührung 11 angegeben.
    3. Fisch vorsichtig zu übertragen mit einer Pinzette oder einem Löffel auf einen Objektträger, Deckel einer Petrischale aus Kunststoff, oder Agarose-beschichteten Petrischale und führen fin Amputation oder Bildgebung (siehe Abschnitt 3.2).
    4. Rückgabe Fisch an einen Behälter, der eine große Menge an frischem Fisch System Wasser und zu überwachen. Wenn Kiemenbewegungen nicht innerhalb von 3 Minuten wieder aufzunehmen, unterstützen durch Einblasen von Wasser über die Kiemen mit einem Kunststofftransferpipette.
  5. PCR-basierte Genotypisierung TetResponder Fisch
    1. Führen partielle Amputation der Schwanzflosse 12. Zeigen Fisch in einzelne, nummerierte Behälter (Brutkästen, siehe Werkstofftabelle). Dies ermöglicht die Rückgewinnung von transgenen Fischen nach erfolgreicher Genotypisierung.
    2. Transfer fin Gewebe, einzelne Vertiefungen einer 96-Well-PCR-Platte mit 20 & mgr; l DNase-freiem Wasser vorgefüllt für die Isolierung genomischer DNA 13.
      1. Zugabe von 120 ul 1 M NaOH zu jeder Vertiefung und Inkubation Proben für 20 min bei 95 ° C unter Verwendung eines Thermocyclers.
      2. Chill Proben auf 4 ° C, fügen Sie 14 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0) in jede Vertiefung und kurz Wirbel Proben. Zentrifuge Proben für 5 min bei 16.000 xg, um Zelltrümmer zu pelletieren. Speichern genomischen DNA bei 4 ° C, bis es benötigt.
    3. Design von Primern zum spezifischen Amplifizieren eines Fragments des TetResponder Transgen. Ein 2-ul isolierte DNA in einem Standard-PCR-Reaktion und die PCR-Produkt analysiert auf einem Agarosegel.

3. Gewebespezifische Induktion der Transgen-Expression in der Erotik-Regenerations Zebrafisch Schwanzflosse

  1. Errichtung TetActivator; TetResponder Doppel transgene Fische
    1. Kamerad TetActivator Träger mit TetResponder carriInnen.
    2. Wählen Sie die Embryonen mit den TetActivator Transgen in einem Entwicklungsstadium, wenn die regulatorischen Elemente Antrieb des TetActivator Kassette aktiv sind. Transgenen Embryos kann leicht durch Aussehen AmCyan Fluoreszenz unter Verwendung eines Stereo-Fluoreszenzmikroskop identifiziert werden.
      HINWEIS: TetActivator Transgen-positive Fisch kann alternativ im Erwachsenenalter durch Abbildung von betäubten Fische, beispielsweise identifiziert werden. nach Amputation der Schwanzflosse und Entstehung AmCyan Fluoreszenz in den Wiedergeborenen.
    3. Heben ausgewählten Embryonen bis zum Erwachsenenalter.
    4. Identifizieren doppelt transgenen erwachsenen Fischen (Fische, die TetResponder zusätzlich zum TetActivator tragen) durch PCR-basierte Genotypisierung oder (vorzugsweise) durch ihre Fähigkeit, die Expression des TetResponder in dem Gewebe von Interesse zu induzieren. Ein Protokoll für TetResponder Induktion und Nachweis in der regenerierenden Schwanzflosse ist in Abschnitt 2.3 und Abschnitt 4 beschrieben.
      HINWEIS: Wenn vorübergehende TetResponder Ausdruck ist kompatibelmit weiteren embryonalen oder Larvenentwicklung, ist es nützlich, doppelt transgenen Embryonen mit TetActivator und TetResponder Transgene folgenden DOX-Behandlung während der embryonalen Entwicklung zu identifizieren, wie oben beschrieben (Abschnitt 2.3, Abbildung 1H). Doppel positive Embryonen AmCyan und YPet Fluoreszenz zeigen. Heben positive Embryonen bis zum Erwachsenenalter.
  2. Amputation des Zebrafisch-Heckflossen und Induktion der Expression des Transgens in der regenerierenden fin
    1. Führen partielle Amputation der Schwanzflosse auf narkotisierten Fisch (siehe Abschnitt 2.4) 12. Gönnen Fische entweder sofort mit DOX oder bringt sie zu den Fischen Gehäusesystem.
    2. Bereiten Brutkasten (2A; siehe Materialien Tabelle) mit 1 l Fischsystem Wasser mit 25 ug / ml DOX gefüllt (add 500 ul 2,000x 50 mg / ml Stamm zu 1 l Fischsystem Wasser).
      HINWEIS: Die Induktion der Expression des Transgens unmittelbar nach der Amputation ermöglicht alsschätzung der Auswirkungen auf die frühen Ereignisse bei der Regeneration, während Induktion bei 3 Tage nach der Amputation (3 dpa) sollte verwendet werden, um transgene Expression oder Funktion während regenerative Wachstum zu bewerten.
    3. Übertragen Sie bis zu 10 zuvor amputiert, doppelt transgenen Fischen auf die Zucht Box und Schließfeld mit einem Deckel, so dass Fische nicht entweichen kann (Abbildung 2A).
    4. Zeigen Brutkästen in die Dunkelheit, um Stress abzubauen. Wir legen in der Regel die Kisten in einen 28,5 ° C Luft Inkubator ständigen Dunkelheit und Temperatur zu gewährleisten.
    5. Gönnen Negativkontrolle doppelt transgene Fische mit EtOH nur (250 ul pro 1 l Fischsystem Wasser).
      HINWEIS: Single transgenen oder Wildtyp-Fisch mit DOX behandelt werden als zusätzliche negative Kontrolle verwendet werden, obwohl wir noch nie nachteiligen Auswirkungen der auf fin Regeneration hier DOX Dosen beobachtet.
    6. Betäuben Fische, wie in Kapitel 2.4 und Transfer Fisch mit einer Pinzette oder einem Löffel auf einen benetzten Agarose-beschichteten Petri beschrieben Gericht. Sorgfältig verteilt die Schwanzflosse mit einer Pinzette.
    7. Screen Fisch für Aussehen YPet in den Wiedergeborenen mit einem Fluoreszenzstereomikroskop (2B).
      HINWEIS: In der Regel können TetResponder gesteuerte Fluoreszenz robust folgenden 6 Stunden von DOX-Behandlung beobachtet werden. Wir empfehlen jedoch, um die Dynamik der TetResponder Ausdruck für jede Zeile erzeugt charakterisieren.
    8. Rückgabe Fisch zum Fischhaltungssystem zu TetResponder Transgen Induktions beenden oder fortsetzen Behandlungen.
      HINWEIS: Für Behandlungen> 24 Stunden (Langzeitbehandlungen) ist es wichtig, den Wasseraustausch und die Brutkästen täglich gründlich zu reinigen.
    9. Während einer Langzeitbehandlung, Futtermittel Fisch alle 2-3 Tage durch die Übertragung von Fisch in einen sauberen Behälter mit frischem Fisch System Wasser, bevor sie dann wieder in Brutkästen nach der Fütterung.

4. Charakterisierung von TetResponder Expression in Fin Regeneriert

t ">. HINWEIS: Wir verifizieren üblicherweise gewebespezifische Genexpression in der Regenerierungsheckflosse mit Fluoreszenzabbildung von Kryoschnitten in 3 dpa Zu diesem Zeitpunkt die verschiedenen Gewebekammern eines Regenerats gebildet und kann deutlich an Gewebeschnitten ermittelt werden, und Kryoschneiden ist einfacher als in späteren Phasen der Regeneration. 2C zeigt die Gewebe-Domänen, die in der Regenerat unterschieden werden kann, und listet einige molekulare Marker für diesen Domänen. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von Längs- oder Quer Kryoschnitte für eine direkte Bilderzeugung oder Immunfärbung .

  1. Kryoschneiden der Erwachsenenheckflossen
    1. Gönnen Fische, deren Schwanzflossen wurden von 2 bis 3 amputiert dpa dpa mit DOX, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben
    2. Betäuben Fische, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben
    3. Mit einem Löffel oder einer Pinzette und ziehst übertragen Fisch auf einen Deckel einer Petrischale aus Kunststoff.
    4. Re-amputieren die Flosse Regenerat bei etwa 4-5 knöchernen Segments proximal zum Ausgangs Amputation Ebene mit einem Skalpell und zurück den Fisch um frischen Fisch Systemwasser.
    5. Sorgfältig Übertragungs regeneriert, um eine kleine Petrischale (zB 35 mm), der 4% (w / v) Paraformaldehyd (PFA) in 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; siehe Materialien Tabelle) unter Verwendung einer feinen Pinzette. Die Wiedergeborenen, sondern nur den Stumpf Teil des Gewebes nicht berühren.
    6. Zeigen Gewebe flach auf die Petrischale unten und befestigen Sie O / N bei 4 ° C.
    7. Wasch regeneriert zweimal in 1 × PBS mit 0,1% Tween (PBT) zu entfernen und PFA inkubieren regeneriert o / n bei 4 ° C in 0,5 M EDTA-PBS (pH 7,5) auf der Knochenmatrix zu entkalken.
    8. Regenerate Inkubieren bei RT in 10% Saccharose-PBS, 20% Saccharose-PBS, 30% Saccharose-PBS und 30% Sucrose-PBS: Gewebe Einfriermedium in einer 1: 1-Verhältnis (TFM; siehe Materialien Tabelle) für jeweils 30 min. Anschließend inkubieren Rippen bei 4 ° C für> 2 Stunden in Gewebe Einfriermedium.
    9. Zeigen cryomolds auf einen Objektträger und füllen diem mit Gewebe Einfriermedium. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen.
    10. Transfer regeneriert in cryomolds und orientieren Gewebe angemessen auf Längs- oder Querschnitte der Flosse regeneriert (2D) zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Wiedergeborenen ist gerade, das Schneiden erleichtert.
    11. Übertragungs cryomolds zusammen mit Objektträger auf ein Metallgestell auf einem Bett aus Trockeneis positioniert, um den Gefrierprozeß (2D) zu starten.
    12. Sobald das Gewebe Gefriermedium fest geworden ist, auf Bank cryomold Platz und lassen bei RT sitzen für ein paar Minuten, so dass die Gefriermedium Gewebe auftaut am Kunststoff-Medium-Schnittstelle.
    13. Verwenden Sie einen Stift oder ein ähnliches, um den gefrorenen Block aus dem cryomold schieben. Shop cryoblocks in einer Box bei -80 ° C, bis die Gewebeschneide.
    14. Bereiten 10-14 um dicke Gefrierschnitte mit einem Cryo-Mikrotom und sammeln Abschnitte über die Haftung Objektträger (siehe Materialien Tabelle). Objektträger bei -20 ° C bis neEDED.
  2. Charakterisierung von TetResponder Ausdruck auf Rippenabschnitte basierend auf YPet Fluoreszenz
    1. Behandeln Rippenabschnitte 30 min mit 100% MeOH gekühlt auf -20 ° C, um das Anhaften an die Objektträger, gefolgt von zwei Waschungen bei RT in PBT und 1 in PBS gewaschen, jeweils 5 min zu verbessern.
    2. Visualisieren Kerne durch Inkubieren Abschnitte für 10 min in 4 ', 6-Diamidino-2-phenylinodole (DAPI) in PBS (1: 5000), gefolgt von zwei Waschschritten jeweils 10 Minuten in PBS.
    3. Berg Sektionen in 75% Glycerin-PBS oder im Handel erhältlichen Antifade Reittiere, und mit einem Deckglas.
    4. Bild YPet und AmCyan Fluoreszenz unter einem konfokalen oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop (1E).
      ANMERKUNG: Um eine eindeutige Identifikation von Zelltypen, zusammen mit Anti-GFP Antikörper YPet, Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Zelltyp-spezifische Antigene exprimieren (die mit YPet reagieren, aber nicht AmCyan) erleichtern kann durchgeführt werden,. Alternativ zur Detektion von schwachen YPet Ausdruck zu erleichtern, kann RNA in situ Hybridisierung gegen YPet RNA durchgeführt werden, entweder auf Vollmontage Flossen oder Paraffinschnitten von Flossen.

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Ergebnisse

Um eine Funktions Teton System für gewebespezifische induzierbaren Genexpression, transgene TetActivator und TetResponder Linien etablieren müssen generiert werden (Abbildung 1A). Dies wird durch Mikroinjektion TetActivator (1B - C) erreicht oder TetResponder (1E) Konstrukte in frühen Zebrafischembryonen und anschließender Keimbahn-Integration. Funktions TetActivator Konstrukte können entweder durch Klonen von kurzen Regulationssequenzen (Enhancer-Eleme...

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Diskussion

Die erwachsenen Zebrafisch hat eine erstaunliche Fähigkeit, viele der inneren Organe und Anhänge erfolgreich zu regenerieren. Ein gründliches Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen erfordert gewebespezifische Analyse von Gen-Funktionen und Signalwege. Auf dem Weg zu diesem bietet die Teton-System ein effizientes Werkzeug für die raumzeitlich gesteuerte Genexpression in embryonalen und erwachsenen Zebrafisch. Die Teton System Konstrukte und Methoden in dieser Handschrift beschrieben wurden erfolgreich in ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken Christa Haase, Doris Weber und Brigitte Korte für die technische Unterstützung. Arbeit im Labor Weidinger durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1 unterstützt, WE 4223 / 4-1 und von der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie über eine Oskar-Lapp-Stipendium und ein Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ZuchtboxenAqua SchwarzAquaBox 1
Zusammengesetztes Fluoreszenzmikroskopz.B. Leica, Zeissvariiert je nach Herstellerzur Abbildung von fluoreszierenden Gewebeschnitten
Konfokales Mikroskopz.B. Leica, Zeissvariiert je nach Herstellerzur Abbildung von fluoreszierenden Gewebeschnitten
Kryostatz.B. Leica, Thermo-Scientificvariiert mit dem Herstellerfür Kryosektionen
4', 6-Diamidino-2-phenylinodol (Dapi)Sigma-AldrichD9542verwenden 1/5.000 in PBS
zur Visualisierung von Zellkernen
DoxycyclinSigma-AldrichD9891bereiten Brühen in 50% EtOH bei 50 mg/ml (97 mM)
für TetResponder-Induktion
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-AldrichP6148vor4% (w/v) Paraformaldehyd in PBS, pH 7,5
zur Fixierung
1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5
1x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung + Tween 20 (PBT)1x PBS mit 0,1% Tween 20
Superfrost Ultra Plus Adhäsionsmikroskop-ObjektträgerThermo Scientific 1014356190für die Entnahme von Gewebeschnitten
Stereo-Fluoreszenzmikroskopz. B. Leica, Zeiss,variiert mit dem Herstellerfür die fluoreszenzbasierte Genotypisierung
Thermocycler, z. B. Biorad, Applied Biosystemsvariiert mit dem Herstellerfür PCR-basierte Genotypisierung
Tissue Freezing Medium (TFM)Triangel Biomedical SciencesTFM-Cfür die Einbettung von Gewebe Proben
Tricain (L-Ethyl-m-amino-benzoat-methansulfonat/MS-222)Sigma-AldrichE10521zur Anästhesie
Anwendung bei 1 mg/ml im E3-Embryomedium
,

Referenzen

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