Verwendung von Ultrahochfeld-MRT in Kleintier Modelle aus Polyzystische Nierenerkrankung für<em&gt; In Vivo</em&gt; Phänotypisierung und Drug Monitoring

Zusammenfassung

Die Verwendung der Ultrahochfeld-MRT als nicht-invasive Methode zur Gewinnung phänotypischer Informationen von Nagetiermodellen für polyzystische Nierenerkrankungen und zur Überwachung von Eingriffen wird beschrieben. Im Vergleich zum traditionellen histologischen Ansatz können MRT-Bilder in vivo aufgenommen werden, was eine longitudinale Nachsorge ermöglicht.

Zusammenfassung

Mehrere in vivo präklinische Studien zur polyzystischen Nierenerkrankung (PKD) verwenden orthologe Nagetiermodelle, um die genetischen und molekularen Mechanismen, die für die Krankheit verantwortlich sind, zu identifizieren und zu untersuchen, und sind sehr praktisch für ein schnelles Wirkstoffscreening und das Testen vielversprechender Therapien. Ein limitierender Faktor in diesen Studien ist oft der Mangel an effizienten nicht-invasiven Methoden zur sequentiellen Analyse der anatomischen und funktionellen Veränderungen in der Niere. Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist das aktuelle Goldstandard-Bildgebungsverfahren für Patienten mit autosomal-dominanter polyzystischer Nierenerkrankung (ADPKD) und bietet einen hervorragenden Weichteilkontrast und anatomische Details sowie Messungen des Gesamtnierenvolumens (TKV). Ein großer Vorteil der MRT in Nagetiermodellen der PKD ist die Möglichkeit der In-vivo-Bildgebung, die Längsschnittstudien am selben Tier ermöglicht und somit die Gesamtzahl der benötigten Tiere reduziert. In diesem Manuskript konzentrieren wir uns auf die Verwendung von Ultrahochfeld-MRT (UHF) zur nicht-invasiven Aufnahme von In-vivo-Bildern von Nagetiermodellen für PKD. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, den Einsatz der MRT als Werkzeug für die in vivo phänotypische Charakterisierung und das Wirkstoffmonitoring in Nagetiermodellen für PKD einzuführen.

Einleitung

Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) eine Gruppe von monogenen Erkrankungen, die durch die Entwicklung von Nierenzysten. Unter ihnen sind autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) und autosomal-rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD), die die häufigsten Arten ^1,2 darstellen. ADPKD, die häufigste Form der erblichen Nieren zystische Erkrankungen durch Mutationen in den PKD1 oder PKD2 Gene stammen. Es wird von late-onset, mehrere bilaterale Nierenzysten, begleitet von variable extraNierenZysten sowie Herz-Kreislauf- und Muskelskelettanomalien gekennzeichnet. ARPKD, allgemein betreffen die meisten Neugeborenen und kleinen Kindern, wird durch Mutationen im PKHD1 verursacht und wird durch vergrößerte echoreiche Nieren und angeborene Leberfibrose ³ gekennzeichnet.

Wichtig ist, dass durch ADPKD Heterogenität sowohl auf der Gen (gene) und Mutation (Allel) Ebenen, die im wesentlichen p-Ergebnissehenotypic Variabilität. Mutationen im PKD1-Gen werden mit schweren klinischen Präsentation (zahlreiche Zysten, Früherkennung, Bluthochdruck und Hämaturie) sowie schnelle Progression zu End-stage renal disease (20 Jahre früher als Patienten mit Mutationen PKD2) zugeordnet ^4. Schwere polyzystischen Lebererkrankung (PLD) und Gefäßmissbildungen können mit Mutationen in PKD1 und PKD2 sowohl ⁵ zugeordnet werden. Die Mehrzahl von Nierenkomplikationen ADPKD entstehen im Wesentlichen als Folge der Zystenexpansion, den zugehörigen Entzündung und Fibrose. Zyste Entwicklung beginnt in der Gebärmutter und setzt sich über den Patienten Lebenszeit. Nieren Regel behalten ihre reniform Form, auch wenn sie mehr als 20 Mal die normale Nierenvolumen erreichen konnte. Die meisten der Patienten vorhanden bilateralen Verteilung von Nierenzysten, aber in einigen seltenen Fällen, Zyste kann in einer einseitigen oder asymmetrische Muster zu entwickeln.

Ein Haupt Challenge für Nephrologen folgenden Patienten mit ADPKD oder Durchführungstherapien ist die Naturgeschichte der Krankheit. Während der meisten Zeit seines Laufs bleibt die Nierenfunktion normal und durch die Zeit der Nierenfunktion beginnt zu sinken, die meisten der Nieren durch Zysten ersetzt. Wenn Therapien werden in späteren Phasen implementiert, ist es weniger wahrscheinlich, um erfolgreich zu sein, da der Patient kann bereits einen Punkt ohne Wiederkehr bei chronischen Nierenerkrankungen zu erreichen. Wenn im Gegensatz dazu Therapien in frühen Stadien gestartet werden, ist es schwierig, eine Antwort nur auf die glomeruläre Filtrationsrate basierend identifizieren. Als Ergebnis der Begriff Nierenvolumen als Marker der Progression der Erkrankung gewonnen Aufmerksamkeit.

Das Konsortium für Radiologische Imaging Studium der Kidney Disease (CRISP) Studie hat gezeigt, dass bei Patienten mit ADPKD die Zunahme der Nierenzyste und Volumina direkt korreliert mit Nierenfunktionsverschlechterung und unterstreicht das Potenzial der Gesamtnieren Volume (TKV), wie alsurrogate Marker für die Progression der Erkrankung ^6,7. Folglich wird TKV derzeit als primäre oder sekundäre Endpunkt in mehreren klinischen Studien für ADPKD ^2,8,9 verwendet.

Mehrere Mausmodellen einschließlich spontaner Mutationen und gentechnisch verändert wurden, Licht auf die Pathogenese der PKD ^10,11 vergießen. Pkd1 oder PKD2 Modelle (Mutationen entweder Pkd1 oder PKD2) haben sich am meisten verbreitet sind, da sie perfekt imitieren menschliche Krankheit. Darüber hinaus haben Nagetiermodellen mit Mutationen in anderen als Pkd1 oder PKD2 Gene Gene als experimentelle Plattform verwendet, um zu erläutern Signalwege mit der Krankheit. Außerdem können mehrere dieser Modelle wurden verwendet, um mögliche Therapien zu testen. Jedoch ist ein begrenzender Faktor in vielen Studien an Nagetieren für PKD oft der Mangel an effizienten nichtinvasive Methoden zur sequentiellen Analyse der anatomischen und funktionellen Veränderungen in der Niere.

Magnetic resonance Tomographie (MRT) ist der derzeitige Goldstandard bildgebendes Verfahren zur ADPKD Patienten folgen und bietet eine ausgezeichnete Weichteilkontrast und anatomische Detail, und ermöglichen TKV Messungen. Obwohl MRI ist für anatomischen Bildgebung in größeren Tieren und Menschen, Imaging kleine Nagetiere in vivo etabliert bringt zusätzliche technische Herausforderungen, denen die Fähigkeit, hochauflösende Bilder erwerben kann seine Nützlichkeit zu begrenzen. Mit der Einführung von Ultrahochfeld (UHF) MRI (7-16,4 T) und der Entwicklung von stärkeren Gradienten, ist es nun möglich, höhere Signal-zu-Rausch-Verhältnisse und der räumlichen Auflösung von MRI-Bildern mit diagnostischer Qualität ähnlich derjenigen zu erreichen beim Menschen erhalten. Folglich ist die Verwendung von UHF-MRT für die in-vivo-Bildgebung von kleinen Nagetiermodellen für PKD hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug für die Forscher.

Protokoll

Vor Beginn der Verfahren mit lebenden Tieren sollten experimentelle Protokolle von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt werden.

1. Scanner Configuration

1. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, das Heizgerät in die Position OFF.
2. Wählen Sie das mini Bildgebungsgradienten und 38 mm-HF-Spule und mini-Bildgebung Halter.
3. In der zentralen Bohrung der Halterung installieren Sie die variable Temperatur Montage.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Für MRI Experimente, eine optimale Anästhesie mit Isofluran verdampft. Zur Narkoseeinleitung, legen Tier in einer Induktionskammer mit einem saugfähigen Tuch ausgekleidet. Stellen Sie den Durchflussmesser der Isofluran-Verdampfer auf 2,0 bis 2,5 l / min, und die auf 3% Isofluran in Sauerstoff.
2. Entfernen Sie alle Metallschild oder andere Metallgegenstand in diesem Stadium. Bewerben vet Salbe auf die Augen Tieres bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Sobald das Tierhat die chirurgische Ebene der Narkose erreicht (dh Verlust der Ziehreflex bis Fuß pinch), legen Sie das Tier auf einem Halter mit der Nase in ein Nasenkegel eingesetzt. Eingestellt Anästhesieluftstrom in der Sonde an 2,0-2,5 ml / min und die Isoflurankonzentration 1,5-2,0% in Sauerstoff. Anästhesie wird während des Verfahrens durch den Nasenkegel geliefert werden. Von Zeit zu Zeit anpassen Isofluran-Konzentration je nach Alter Tieres und Gewicht, eine Atemfrequenz von ~ 40 bpm aufrechtzuerhalten.
4. Verwenden Tierhalter, um das Tier zu befestigen und Bewegung während der MRI-Experiment zu verhindern. Variiert die Art des Tierhalters in Abhängigkeit vom Körper abzutastenden Bereich.
   Hinweis: Kundenspezifische Halterungen aus Labor Kunststoffe (Polypropylen, Teflon, Polystyrol, Polycarbonat) werden können, um spezifische Experiment unterzubringen und um das Tier Größe (von neugeborenen Maus, um 160 g Ratte) angepasst werden.
5. Legen Sie die Rektalthermometer im Tierkörpertemperatur Tieres zu überwachen. Während der experiment, halten das Tier bei 35-37 ° C, mit einem warmen Luftstrom. Einzustellen Lufttemperatur (30-38 ° C) und Strömung (1200-2000 l / h) auf der Basis der Körpertemperatur Feedback Tieres.
6. Einen Ballon Atemdrucksensor Bringen Sie den Tierleib, um die Atemfrequenz zu überwachen.
7. Sichern Sie das Tier in der Mitte der HF-Spule und vorsichtig die HF-Spule mit Tier in MRI-Scanner.

3. MRI Experiment

1. Tune und passen Sie die HF-Spule, bevor die Experimente zu minimieren HF-Leistung und zur Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu maximieren. So starten Sie die passenden / Tuning:
   1. Öffnen Sie die Spektrometersteuerung Tool, indem Sie auf das Symbol Tools.
   2. Im Spektrometer Steuerungstool klicken Acquisition → Wobble. Ein Acq / Reco Fenster geöffnet, das Wobble-Kurve.
   3. Alternativ können die Tuning und Anpassungskondensatoren (unter Verwendung der passenden Tuning- und Stäbe) in kleinen Schritten einzustellen, bis der reflektierte HF-Leistungminimiert. Das Ziel ist, eine Kurve mit einem Minimum an der vertikalen Achse bei Null an der horizontalen Achse positioniert sehen.
   4. Wenn die Kalibrierung der Spule hat erfolgreich erreicht wurde, drücken Sie die Stopptaste in der Acq / Reco-Fenster.
2. Erwerben Sie scout Bilder in den drei orthogonalen Ebenen, um eine axiale, koronale und sagittale Bilder zu schaffen. Verwenden Sie eine schnelle Bildfolge, wie Intra-Tor Fast Low Angle Shot (IG-FLASH), um die Erkundungsbilder ¹² zu erwerben. Verwenden Sie die Erkundungsbilder, um die richtige Geometrie für die eigentliche Bildgebung eingestellt.
3. Je nach den spezifischen Forschungsziele, wählen Sie die richtige Bildfolge und Parameter ein und starten die Suche mit einer Ampel. Dies wird HF-Kanal zu kalibrieren, Shim den Magneten, setzen Trägerfrequenz bei Resonanz für Wasser und passen Empfängerverstärkung, die alle automatisch.
   1. Für anatomische Studien und T2-gewichteten Bildern, erwerben in 2D Multi Slice oder 3D-Modus. Um das Experiment für eine gegebene räumliche Auflösung zu verkürzen, halten Sie das Feld-der (FOV) so klein wie möglich, aber groß genug, um Umwickelartefakte (2,56 bis 3,2 cm) zu vermeiden.
4. Halten des Zyklus der gewählten Sequenz geringfügig kürzer als die tierischen Atemzyklus durch geeignete Wahl der Wiederholungszeit (TR) und / oder der Anzahl der Schichten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Daten während der Ruheperiode der Tiere gesammelt.
   1. Zum Beispiel für Bauch Bilder, halten Atemfrequenz Tieres bei ~ 30 bpm; das ist etwa 2000 ms pro Atemzug. Verwenden Sie einen Turbo schnelle Erfassung mit Relaxation Enhancement (RARE) Sequenz und erwerben 11-19 koronalen Scheiben schneiden, mit TR / TE 1500/9 msec, RARE Faktor 8 und (Matrix 256 x 256, FOV 2,56 x 2,56 cm, Schichtdicke 0,75 mm) .
      Hinweis: Durch Einstellen des TR 1500 ms, und halten die Atemfrequenz des Tieres ~ 30 bpm (2,000 ms pro Atemzug), stellen wir sicher, dass die Daten während der Ruhezeit der Tiere gesammelt.
5. Nachdem alle Bildaufnahme abgeschlossen ist, legen Sie das gescannte Tierauf beheizten Unterlage und zu überwachen, bis die ambulante. Nach der Wiederherstellung, bringen Sie das Tier in den Käfig und 1 Stunde lang überwacht zumindest vor der Rückkehr in die Tierhaltung.

Ergebnisse

In dieser Handschrift, streben wir an, den Nutzen der UHF-MRT als Instrument für die in vivo phänotypische Charakterisierung oder Arzneimittelüberwachung in Nagetiermodellen für PKD und anderen Nierenerkrankungen zeigen. Alle Versuche waren Teil der IACUC genehmigt Versuchsprotokollen.

In-vivo-Phänotypisierung von kleinen Nagetiermodellen für PKD mit UHF-MRT:

Alle bildgebenden Untersuchungen wurden auf lebende Tiere unter Isofluran-Narkose durchgef...

Diskussion

Diese Handschrift zeigt die Durchführbarkeit der Verwendung von UHF-MRT als Instrument für die in vivo phänotypische Charakterisierung oder Arzneimittelüberwachung in Nagetiermodellen für PKD.

Wir beschreiben Experimente bei 16,4 T mit einer großen Bohrung Avance III hochauflösende NMR-Spektrometer mit Mikro- und Mini-Imaging-Zubehör ausgestattet wurde. Das Spektrometer wurde durch die Erfassung und Verarbeitung Software TopSpin2.0PV von Paravision 5.1 Imaging-Software gesteuert wir...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Zweikanal-Mehrkernspektrometer mit breiter Bohrung, ausgestattet mit Mini- und Mikrobildgebungszubehör für die Bildgebung kleiner Nagetiere in vivo
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Spektrometer-Verarbeitungssoftware
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging-Software
VTU BVT 3000 digital	Bruker	W1101095	Temperaturregler