Methodenartikel

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

DOI:

10.3791/52771

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29. April 2015

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1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben Ganztier-Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Techniken zur Überwachung der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen als Reaktion auf die Immunisierung mit Nanopartikeln in einem Mausmodell der Impfung.

Zusammenfassung

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Traditionelle Impfstoff-Adjuvantien, wie z.B. Alaun, lösen suboptimale CD8+ T-Zell-Antworten aus. Um diese große Herausforderung bei der Impfstoffentwicklung zu bewältigen, wurden verschiedene Nanopartikelsysteme entwickelt, die Eigenschaften von Krankheitserregern nachahmen, um die Antigenabgabe an drainierende Lymphknoten zu verbessern und die Antigenaufnahme durch antigenpräsentierende Zellen zu erhöhen, was zu neuen Impfstoffformulierungen führte, die für die Induktion antigenspezifischer CD8+ T-Zellantworten optimiert sind. In diesem Artikel beschreiben wir die Synthese eines "pathogen-imitierenden" Nanopartikelsystems, das als interbilayer-vernetzte multilamellare Vesikel (ICMVs) bezeichnet wird und als wirksamer Impfstoffträger für die gemeinsame Verabreichung von Untereinheitsantigenen und immunstimulierenden Wirkstoffen und die Auslösung potenter zytotoxischer CD8+ T-Lymphozyten (CTL)-Reaktionen dienen kann. Wir beschreiben Methoden zur Charakterisierung der hydrodynamischen Größe und Oberflächenladung von Impfstoff-Nanopartikeln mit dynamischer Lichtstreuung und Zetapotentialanalysator und stellen ein konfokalmikroskopisches Verfahren zur Analyse der Nanopartikel-vermittelten Antigenabgabe an drainierende Lymphknoten vor. Darüber hinaus zeigen wir eine neue Biolumineszenz-Bildgebungstechnik für ganze Tiere, die den adoptiven Transfer von Luciferase-exprimierenden, antigenspezifischen CD8+ T-Zellen in Empfängermäuse nutzt, gefolgt von einer Nanopartikelimpfung, die eine nicht-invasive Abfrage von Expansions- und Transportmustern von CTLs in Echtzeit ermöglicht. Wir beschreiben auch die Tetramerfärbung und die durchflusszytometrische Analyse von mononukleären Zellen des peripheren Blutes zur longitudinalen Quantifizierung endogener T-Zell-Antworten bei Mäusen, die mit Nanopartikeln geimpft wurden.

Einleitung

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Traditionelle Impfstoffentwicklung hat überwiegend beschäftigt die empirischen Ansatz von Versuch und Irrtum. Jedoch mit der jüngsten Entwicklung einer breiten Palette von Biomaterialien und Entdeckung von molekularen Determinanten Aktivierung des Immunsystems ist es nun möglich, rationell Vakzinformulierungen mit biophysikalische und biochemische Hinweise von Pathogenen 1,2 abgeleitet. Insbesondere wurden verschiedene partikulären Drug-Delivery-Plattformen als Impfstoffträger, da sie mit Untereinheiten-Antigenen und immunstimulierende Mittel gemeinsam geladen werden untersucht, Impfstoffkomponenten Schutz vor Abbau, verbessern und ihre Co-Lieferung an präsentierenden Zellen Antigen (APCs) mit Wohnsitz in der Lymphe Knoten (LNS), damit die Maximierung Immunstimulation und Aktivierung 3-5. In diesem Bericht beschreiben wir die Synthese eines "pathogen-imitiert" Nanopartikel-System, genannt interbilayer netzten multilamellare Vesikel (ICMVs), die zuvor als ein potenter Impfstoff platfor demonstriert wordenm für die Auslösung robust zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und humorale Immunreaktionen sowohl systemische und Schleimhautgewebe Fächer 6-9. Insbesondere erzielte Impfung mit ICMVs wesentlichen Serum-IgG-Ebenen verstärkt gegen eine Malaria-Antigen, gegenüber der Impfung mit üblichen Hilfsmitteln (zB Alaun und Montanide) 7 und auch ausgelöste starke CTL-Antworten gegen Tumorzellen und virale Herausforderung Modellen in Mäusen 9. Hier mit ICMVs als Modell-Impfstoff Nanopartikelsystem beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung von Nano-Impfstoff-Formulierungen, einschließlich Partikelgröße und Zetapotentialmessungen und Verfolgung von Menschenhandel zu Partikel Ablassen LNs (DLNs) nutzen konfokale Bildgebung von Gewebe gefriergeschnitten 7. Zusätzlich stellen wir eine Ganztier-Bildgebung basierte Verfahren zum Analysieren Expansion von CTL-Antworten in Mäusen nach dem adoptiven Transfer von Luciferase-exprimierende Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen 9,10. Schließlich definieren wirRitz Tetramerfärbung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu Längs Quantifizierung der endogenen T-Zell-Antworten in Mäusen, die mit Nanopartikeln 6,9 geimpft.

ICMVs eine lipidbasierte Nanopartikel-Formulierung durch kontrollierte Fusion von Liposomen einfach synthetisiert in multilamellaren Strukturen, die dann chemisch durch Vernetzung Maleimid-funktionalisierten Phospholipid-Kopfgruppen in Lipidschichten mit Dithiol Vernetzer 6 stabilisiert werden. Sobald ICMVs synthetisiert werden, kann ein kleiner Anteil von Nanopartikeln verwendet werden, um Teilchengröße und Zeta-Potential (das heißt, die Oberflächenladung der Teilchen) mit einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) System und ein Zeta-Potential-Analysegerät ermitteln. DLS misst Änderungen der Lichtstreuung in Partikelsuspensionen, was die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten und die hydrodynamische Größe von Partikeln 11. Konsistente Teilchengröße von Charge zu Charge Synthese kritischDa Teilchengröße gehört zu den wichtigsten Faktoren, die Lymphdrainage Impfstoffpartikel DLNs und anschließende zelluläre Aufnahme durch APCs 12,13. Zusätzlich kann Zetapotential durch Messen der Partikelgeschwindigkeit, wenn ein elektrischer Strom angelegt wird, die Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Partikeln und Partikeloberflächenladung 11 können erhalten werden. Konsistente Werte Zeta-Potential von Teilchen ist wichtig, da Oberflächenladung der Teilchen bestimmt, kolloidale Stabilität, die direkten Einfluss auf die Dispersion während der Lagerung und nach der Verabreichung in vivo 14,15 hat. Um die Partikellokalisierungs zu DLNs verfolgen, können ICMVs mit gewünschten Fluorophore einschließlich lipophilen Farbstoffen und kovalent-markierten Antigene bezeichnet werden. Nach der Immunisierung können Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten getötet werden, DLNs reseziert gefriergeschnitten und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von lymphatischen draining sowohl der Nanopartikel Impfstoffträger und Antigen DLNs. Die Gewebeschnitte können zusätzlich mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und verwendet, um weitere Informationen zu erhalten, wie die Typen von Zellen mit dem Antigen, und die Bildung von Keimzentren assoziiert gefärbt, wie wir vorher 7 gezeigt werden.

Sobald die Partikelsynthese optimiert und Handels den DLNs bestätigt wird, ist es wichtig, Auslösung in vivo CTL-Expansion zu validieren. Um Hervorrufen von antigenspezifischen CD8 + -T-Zellen als Reaktion auf die Impfung Nanopartikel zu analysieren, haben wir eine Modellantigen, Ovalbumin (OVA) verwendet, die mit OVA 257-264-Peptid (SIINFEKL) immun CD8 + T-Zell-Epitop, das detaillierte immunologischen Analysen ermöglicht von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten für die anfängliche Entwicklung von Impfstoffen 16,17. Insbesondere, um die Dynamik der Expansion und Migration von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen zu befragen, erzeugten wir haben eindoppelt transgenen Mausmodell durch Kreuzung Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden transgenen Mäusen (Luc) mit OT-I-transgenen Mäusen, die CD8 + T-Zellen mit T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für SIINFEKL (in Verbindung mit H-2K b) besitzen. Aus diesen OT-I / Luc Mäusen, Luciferase-exprimierenden kann OT-I CD8 + -T-Zellen isoliert und zur adoptiven Transfer in naiven C57BL / 6-Mäusen hergestellt werden. Sobald ausgesät werden erfolgreiche Immunisierung mit OVA haltigen Nanopartikeln in Expansion der übertragenen T-Zellen, die durch die Überwachung des Biolumineszenz-Signals mit einem ganzen Tier Abbildungssystems 9,10 verfolgt werden können führen. Diese nicht-invasive Ganzkörper-Bildgebung Technik hat mit anderen viralen oder Tumorantigene, die in der Vergangenheit 18-20 angewandt, sodass Prozesse in T-Zell-Expansion in Lymphgewebe und Verbreitung in die peripheren Gewebe in Längs Weise beteiligt.

Komplementär zur Analyse adoptiv transferierte Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen, endogenous T-Zell-Reaktionen nach der Impfung mit dem Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Tetramer-Assay 21, bei dem ein Peptid-MHC-Tetramer-Komplex, bestehend aus vier Fluorophor-markierten MHC-Klasse I-Moleküle mit Peptid beladen Epitope untersucht werden, wird verwendet, TCR und Etiketten CD8 + T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Art und Weise zu binden. Der Peptid-MHC-Tetramer-Assay kann entweder im Terminal Nekropsie Studien zur Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen in lymphoiden und peripheren Gewebe zu identifizieren oder in Langzeitstudien mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von der seriellen Blutabnahmen durchgeführt werden, erhalten. Nach Färbung Lymphozyten mit Peptid-MHC-Tetramer, Durchflusszytometrie Analyse wird für detailliertere Analysen auf den Phänotyp von CTLs oder Quantifizierung ihrer Häufigkeit bei CD8 + T-Zellen durchgeführt.

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Protokoll

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Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden von der Universität Ausschuss für Nutzung und Pflege von Tieren (UCUCA) an der Universität von Michigan nach den Verhaltensregeln und Richtlinien genehmigt und durchgeführt.

Mit Protein-Antigen und Adjuvans Molecules 1. Synthese und Charakterisierung von ICMVs CO bela

  1. Mix 1: 1-Molverhältnis von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p maleimidophenyl) butyramido] (MPB) in Chloroform, wobei die Gesamtlipidmenge bei 1,26 umol pro Charge (das heißt, 500 & mgr; g von DOPC und 630 ug MPB) in einem 20 ml Glasröhrchen (Durchmesser = 28 mm und Höhe = 61 mm).
  2. Hinzuzufügen lipophile Arzneimittel, wie Monophosphoryl-Lipid A (MPLA) oder lipophilen Farbstoffen (zB DID), um die Lipidlösung in gewünschte Konzentration. Gründlich zu entfernen des organischen Lösungsmittels durch Spülen mit extra dry nitrogen Gas- und indem die Proben unter Vakuum O / N.
  3. Hydratisieren des Lipidfilms durch Zugabe von 200 ul 10 mM Bis-Tris-Propan (BTP, pH 7,0), enthaltend wasserlösliche Medikamente (zB Protein-Antigene). Vortex für 10 Sekunden alle 10 Minuten für 1 Stunde bei RT.
  4. Übertragen Sie den Inhalt aus dem Glasfläschchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Ort Proben in einem Eis-Wasser-Bad und beschallen kontinuierlich für 5 min mit der Intensität von 40% Einstellung auf einem 125 W / 20 kHz-Sonde-Spitze Ultraschallgerät.
  5. In 4 ul 150 mM Dithiothreitol (DTT) zu jeder Charge (Arbeitskonzentration 2,4 mM), Wirbel, und kurz Zentrifuge unter Verwendung eines Tischmikrozentrifuge.
  6. In 40 ul 200 mM CaCl 2 und mit der Pipette (Arbeitskonzentration 33 mM) zu mischen. Proben bei 37 ° C für 1 Stunde zur Vernetzung des MPB-enthaltende Lipidschichten mit DTT zu ermöglichen.
  7. Centrifuge Proben bei 20.000 · g für 15 Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 200 ul ddiH 2 O.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 1,7 und Zentrifuge wieder nach dem zweiten ddiH 2 O zu waschen, um CaCl 2, nicht umgesetzten DTT und nicht verkapselten Fracht Materialien aus dem Überstand zu entfernen.
  9. Herstellung von 10 mg / ml 2 kDa Polyethylenglycol-thiol (PEG-SH) in ddiH 2 O. Resuspendieren jedes ICMV Probe in 100 ul PEG-SH-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 30 min.
  10. Führen Sie zwei ddiH 2 O Wäschen (Schritt 1.7) und resuspendieren die endgültige ICMV Pellet in PBS und bei 4 ° C. Vor dem Gebrauch mischen ICMV Suspension, als Partikel auf den Boden nach längerer Lagerung zu begleichen.
  11. Zur Charakterisierung der Partikel, Entnahme einer kleinen Aliquot (~ 10%) der ICMVs aus jeder Charge und einzeln in einem Gesamtvolumen von 1 ml ddiH 2 O verdünnen Platzieren einer einzigen Probe in einem Zetasizer Zelle und Messung Teilchengröße Polydispersitätsindex und Zeta-Potential der Proben unter Verwendung eines DLS und Zetapotential-Messsystem (nach dem Protokoll des Herstellers).

2. Prüfung der Lymphknotens von Fluoreszenz-markierten ICMVs mit konfokale Mikroskopie

  1. Vorbereitung der ICMVs mit Fluorophor-markierten Antigen und lipophilen Fluoreszenzfarbstoff beladen
    1. Vorbereitung Fluorophor-markierten Protein, wie Ovalbumin mit Alexa Fluor 555-succinimidylester umgesetzt, entsprechend der Anleitung des Herstellers.
    2. Um ICMVs mit Fluorophor in der Lipidhülle versehen vorzubereiten, fügen lipophilen Fluoreszenzfarbstoff (zB 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) während der Herstellung der Lipidfilm (Schritt 1.2) mit 0,05% molaren Lipidmenge. Für Lipidfilm Flüssigkeitszufuhr (Schritt 1.3), Verwendung Puffer, der Fluorophor-markierten Antigen und komplette ICMV Synthese wie in Schritten von 1,4 bis 1,11 dargestellt.
  2. Die subkutane Verabreichung von Nanopartikeln an Schwanzbasis
    1. Betäuben Maus mit einem kontrollierten Fluss Verdampfer mit einer Induktionskammer u ausgestattettilizing 3% Isofluran und 1,5 l / min Sauerstoff Strom gemäß einer IACUC genehmigt Tier-Protokoll. Sobald die Maus bewusstlos ist, führen Sie folgende Schritte schnell vor der Narkose nachlässt, um optimalen Zugang zu der Stelle der Injektion zu ermöglichen und zu minimieren Beschwerden an das Tier. Alternativ können Sie einen gut passenden Nasenkegel auf die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Wenn Mäuse länger als 5 min narkotisiert, gelten Augenschmier notwendig, Reizung nach dem Eingriff zu minimieren.
    2. Sprühen Sie die Basis des Schwanzes mit 70% Ethanol zu desinfizieren und nass das Pelzteil das nasse Haar, ein kleines Stück Haut sichtbar, die verwendet werden kann, um die Nadel unter die Haut sichtbar zu schützen.
    3. Vorbereitung Partikelinjektionssuspension enthaltend gewünschte Menge an Antigen und Adjuvans pro 100 ul Impfdosis in PBS (beispielsweise 10 & mgr; g OVA und 0,3 & mgr; g MPLA pro 100 ul Injektionsdosis wurde in der Vergangenheit 6,9 verwendet wurde).
    4. Zeichnen Sie die Partikelsuspension intoa Spritze mit einer 27-29 G Nadel und führen Sie die Nadel an der Basis des Schwanzes (~ 5 mm vom Haaransatz) mit der Fase nach oben ein und injizieren 50 ul der Partikelsuspension 22.
    5. Warten Sie einige Sekunden für Druckausgleich, um übermäßige Rückströmung zu verhindern, und ziehen Sie die Nadel heraus. Ist die Einspritzung auf der anderen Seite der Schwanzbasis auf beiden Ablaßleisten LNs zielen.
  3. Vorbereitung von Lymphknotengefrierschnitten und Prüfung mit der konfokalen Mikroskopie.
    1. Euthanize die Maus mit CO 2 Ersticken, gefolgt von induzierten Pneumothorax nach ein IACUC genehmigten Tier Protokoll. Auszug Leisten LNs nach Protokoll in Bedoya 23 gezeigt und waschen das Blut, indem das Gewebe in 1 ml 4 ° C PBS.
    2. Absorbieren die PBS aus dem Gewebe mit Gewebe und legen Gewebe in Gewebe cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) an die Spitze vorgefüllt mit Oktober Einfriermedium 24. Snap einfrieren tisverklagen Block in flüssigem Stickstoff für 30 Sekunden. Alternativ legen Gewebeblock auf Trockeneis für 30 min. Speichern gefrorenen Gewebe in -80 ° C Tiefkühltruhe.
    3. Schneiden Gewebeschnitte 5-10 um dick in einem Kryostat bei -20 ° C 24 gesetzt.
    4. Falls erforderlich, Immunfluoreszenz Etikettierung, und untersuchen das Gewebe mit der konfokalen Mikroskopie, wie zuvor gezeigt 24.

3. Überwachung Expansion von Antigen-spezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8 + T-Zellen nach der Nanopartikel-Impfung mit ganzen Tier Imaging

  1. Isolierung des OVA 257-264-spezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8 + T-Zellen von OT-I / Luc transgenen Mäusen
    1. Euthanize eine OT-I / Luc transgene Maus mit CO 2 Ersticken und induzieren ein Pneumothorax nach einem IACUC genehmigten Tier Protokoll. Ernten der Milz steril durch Zugriff auf die Bauchhöhle und sorgfältig Ablösen der Gewebe aus dem Pankreas 23 undin 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS für die Übertragung auf Gewebekultur Kapuze.
    2. Platzieren der Milz auf einem 70 & mgr; m Nylon-Sieb über ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen (bis zu 3 Milz zu einem Zeitpunkt). Verwendung eines Kolbens von einer 3-ml-Spritze, mahlen die Zellen durch das Sieb.
    3. Waschen Sie den Kolben und das Sieb mit PBS + 2% FBS und entsorgen. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 10 ml / Milz in der 50 ml Tube, nehmen Sie eine kleine Probe der Zellsuspension mit einem Hämocytometer zählen, und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g.
    4. Mit einem handelsüblichen Magnet negative Selektion Kit, isolieren die CD8 + T-Zell-Population, indem Sie den Anweisungen des Herstellers.
    5. Nach Waschen der Zellen mit PBS, zählen die Anzahl der isolierten CD8 + T-Zellen. Die Reinheit der isolierten CD8 + T-Zellen zu bewerten, inkubieren ~ 20.000-30.000 Zellen in 20 ul Maus CD16 / 32-Antikörper (0,025 mg / ml) für 10 min, anschließend werden 20 ul αCD8-APC-Antikörper (0,005 mg / ml) und Inkubation für 30 min. Perform alle Inkubationen bei 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Zuführen Durchflusszytometrieanalyse 25.
  2. Der adoptive Transfer von isolierten CD8 + T-Zellen und Visualisierung ihrer Expansion nach der Impfung
    1. Zuführen adoptiven Transfer von isolierten OT-I / Luc CD8 + T-Zellen in naiven C57BL / 6-Mäusen durch Verabreichung 1-10 x 10 5 Zellen in einem 200 & mgr; l Volumen von PBS durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene 22 (Tag -1). In Anbetracht, dass Pelz und schwarze Flecken auf der Haut in C57BL / 6-Mäuse können mit dem Biolumineszenz-Signal stören, sind rasiert Albino C57BL / 6-Mäuse ideal für diese Studien.
    2. Nach einem Tag (Tag 0), zur Verwaltung der Impfstoff wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.2).
    3. Verwalten 150 mg Luciferin pro kg Körpergewicht der Maus intraperitoneal in einem 300 & mgr; l Volumen von PBS. Nach 10 min zu betäuben die Mäuse mit Isofluran (wie in Schritt 2.2.1) und zu visualisieren OT-I / Luc CD8 + T-Zellen durch den Erwerb der Biolumineszenz-Signal für 5-10 min wit einem ganzen Tier Abbildungssystem (IVIS, siehe Wilson 26 für detaillierte Anleitung). Wiederholen Sie dies für Langzeitstudien wie nötig.

4. Peptid-MHC-Tetramer-Färbung von PBMCs für die Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen

Anmerkung: Die folgenden Protokollprozedur kann entweder C57BL / 6-Mäuse adoptiv mit OT-I / Luc CD8 + T-Zellen oder C57BL / 6-Mäusen ohne die adoptive Übertragung übertragen geführt werden.

  1. Bei einem gewünschten Zeitpunkt nach der Impfung, sammeln etwa 100 ul Blut (4-6 Tropfen) von Mäusen über submandibular Blutungstechnik 27 in ein Rohr mit K 2 EDTA beschichteten und invertieren mehrere Male, um die Gerinnung zu verhindern.
  2. Übertragen Sie 100 ul Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 1 ml Lysepuffer, und Inkubation für 2 bis 3 min, um die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) zu entfernen. Centrifuge Proben für 5 min bei 1.500 xg und entfernen Sie den Überstand. Wenn das Pellet noch einppears rot (zeigt unvollständige Entfernung der roten Blutkörperchen), wiederholen Sie die Lyse mit einer kurzen Inkubationszeit (<1 min) Lysepuffer.
  3. Waschen der verbleibenden PBMCs mit 1 ml FACS-Puffer (PBS + 1% w / v BSA) und Zentrifugieren bei 1500 × g für 5 min.
  4. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Probe in 20 ul Maus-CD16 / 32-Antikörper (0,025 mg / ml) zu unspezifisch und FcR-vermittelte Antikörper blockieren die Bindung. Inkubieren für 10 min bei RT.
  5. Übertragen Zellen von Mikrozentrifugenröhrchen in 4 ml-Rund FACS-Röhrchen. Mit 20 ul H-2K b OVA Tetramer-SIINFEKL-PE-Lösung nach den Angaben des Herstellers zu jeder Probe und inkubiere für 30 min auf Eis.
  6. Bereiten Sie die Antikörper-Cocktail (zB αCD8-APC, αCD44-FITC und αCD62L-PECy7 Antikörper (0,005, 0,005 und 0,002 mg / ml-Konzentration, respectively)). In 20 ul zu jeder experimentellen Probe und Inkubation für 20 min auf Eis. Bereiten einzigen Fluorophor Kontrollen labeling Zellen mit jeder Fluorophor-markierten Tetramer oder Antikörper in der oben angegebenen Konzentration.
  7. Mit FACS-Puffer waschen 2mal und resuspendieren Endpellet in FACS-Puffer, enthaltend 2 ug / ml DAPI. Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie-Analyse (Details und Beispiele können in Scheffold 25 zu finden).

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Ergebnisse

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Die bei der Synthese von ICMVs beteiligten Schritte sind in Figur 1 6 gezeigt. Kurz gesagt wird ein Lipidfilm keine lipophilen Arzneimitteln oder Fluoreszenzfarbstoffe enthält in Gegenwart von hydrophilen Arzneimitteln hydratisiert. Zweiwertige Kationen, wie Ca 2+, werden zugegeben, um die Fusion von anionischen Liposomen in multilamellaren Vesikeln zu fahren. Dithiol-Vernetzer, wie beispielsweise DTT, auf apposing Lipidschichten und schließlich verbleibenden externen Maleimidgrupp...

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Diskussion

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Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines neuen lipidbasierte Nanopartikel System bezeichnet ICMVs und liefert das Verfahren zur Überprüfung der Wirksamkeit der Nanopartikel-Impfstoffformulierungen zu Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten induzieren. ICMV Synthese in allen wässrigen Zustand, was ein großer Vorteil ist, verglichen mit anderen gemeinhin verwendeten polymeren Nanopartikelsysteme (zB Poly (lactid-co-glycolid) Säurepartikel), die typischer...

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Offenlegungen

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Perkin Elmer, sofern die Produktionskosten bei der Veröffentlichung dieses Artikels entstehen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Health gewähren 1K22AI097291-01 und von der Nationalen Zentrum für die Förderung der Translational Sciences der National Institutes of Health unter Preis Anzahl UL1TR000433. Wir erkennen auch Prof. Darrell Irvine am MIT und Prof. Matthias Stephan am Fred Hutchinson Cancer Center für ihren Beitrag auf der ersten Arbeiten auf den Impfstoff Nanopartikeln und OT-I / Luc transgenen Mäusen.

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Materialien

3. Überwachung der Expansion von antigenspezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8+ T-Zellen nach Nanopartikel-Impfung mit Ganztier-Imaging

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1. Synthese und Charakterisierung von ICMVs, die mit Proteinantigen- und Adjuvansmolekülen beladen sind
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramid] (Natriumsalz) (MPB)Avanti Polar Lipids, INC.
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)Avanti Polar Lipids, INC.
Monophosphoryllipid A (synthetisch) (PHAD&Trade;) (MPLA)Avanti Polar Lipids, INC.699800
20 ml GlasfläschchenWheaton0334125D
Symphny VakuumofenVWR414004-580
Ovalbumin (OVA)Worthington3054
Bis-Tris Propan (BTP)FisherBP2943
Q125 Ultraschallgerät (125  W/20  kHz)QsonicaQ125-110
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172
2 kDa Thioliertes Polyethylenglykol (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer KüvettenMalvernDTS1070
2. Untersuchung der Lymphknotendrainage von fluoreszenzmarkierten ICMVs mit konfokaler Mikroskopie
>1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanin, 4-Chlorbenzolsulfonatsalz (DID)Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-succinimidylester (AF555-NHS)Life TechnologiesA37571
Tissue-Tek OCT GefriermediumVWR25608-930
Gewebe-KryoformenVWR25608-922<
C57BL/6 MäusenJackson000664
Albino C57BL/6 MäuseJackson000058
OT-1 C57BL/6 MäuseJackson003831
70 μ m Nylon-SiebBD352350
EasySep™ Maus CD8+ T-Zell-IsolationskitStemCell19853
IVIS® Ganztier-BildgebungssystemPerkin Elmer
4. Peptid-MHC-Tetramerfärbung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) für die durchflusszytometrische Analyse von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen
K2EDTA-RöhrchenBD365974
ACK-LysepufferLife TechnologiesA10492-01 
Anti-CD16/32 Fc BlockEbioscience14-0161-86
H-2Kb OVA TetramerMBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APCBD553031
Anti-CD44-FITCBD553133
Anti-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4′,6- Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)SIGMAD8417-10MG
CyAn DurchflusszytometerBeckman Coulter
FlowJo SoftwareFlowJo
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Referenzen

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Antigenspezifische CD8 T ZellenDurchflusszytometrieBiolumineszenz ImagingTetramer F rbungperiphere mononukle re Blutzellendynamische LichtstreuungZeta Potenzial Analysekonfokale Mikroskopie

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