Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen In Vitro

Zusammenfassung

Es werden Hochdurchsatz-Assays vorgestellt, die in Kombination hervorragende Werkzeuge zur Quantifizierung der NET-Freisetzung von menschlichen Neutrophilen bieten.

Zusammenfassung

Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blut. Neutrophile sind die ersten, die am Ort der Infektion ankommen. Neutrophile entwickelten verschiedene antimikrobielle Mechanismen, darunter Phagozytose, Degranulation und Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für Neutrophile. NETs bestehen aus einem DNA-Gerüst, das mit Histonen und mehreren Granulamarkern dekoriert ist, darunter Myeloperoxidase (MPO) und humane neutrophile Elastase (HNE). Die NET-Freisetzung ist ein aktiver Prozess, der charakteristische morphologische Veränderungen von Neutrophilen beinhaltet, die zur Ausstoßung ihrer DNA in den extrazellulären Raum führen. NETs sind wichtig für die Bekämpfung von Mikroben, aber die unkontrollierte Freisetzung von NETs wurde mit mehreren Erkrankungen in Verbindung gebracht. Um mehr über die klinische Relevanz und den Mechanismus der NET-Bildung zu erfahren, besteht ein Bedarf an zuverlässigen Werkzeugen, die in der Lage sind, die NET-Quantifizierung durchzuführen.

Hier werden drei Methoden vorgestellt, mit denen die NET-Freisetzung von humanen Neutrophilen in vitro beurteilt werden kann. Der erste ist ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung der extrazellulären DNA-Freisetzung aus menschlichen Neutrophilen unter Verwendung eines membranundurchlässigen DNA-bindenden Farbstoffs. Darüber hinaus werden zwei weitere Methoden beschrieben, die in der Lage sind, die NET-Bildung durch Messung des Gehalts an NET-spezifischen MPO-DNA- und HNE-DNA-Komplexen zu quantifizieren. Diese Mikroplatten-basierten Methoden bieten in Kombination hervorragende Werkzeuge, um den Mechanismus und die Regulation der NET-Bildung menschlicher Neutrophilen effizient zu untersuchen.

Einleitung

NET-Bildung ist ein neuartiger Mechanismus, mit dem Neutrophile Krankheitserreger bekämpfen. ¹ Der Kern von NETs ist die nukleare DNA. ¹ Dieses DNA-Netzwerk ist mit neutrophilen Körnerproteinen und Histonen assoziiert. ¹ Die Hauptform der NET-Bildung erfordert den Tod von Neutrophilen, die durch Chromatin-Dekondensation, Verschwinden von granulären und nukleären Membranen, Translokation der neutrophilen Elastase in den Zellkern, Citrullinierung von Histonen und schließlich das Verschütten von DNA-basierten NETs gekennzeichnet ist. ^{arabische Ziffer} NETs fangen und töten eine Vielzahl von Mikroben und sind ein wesentlicher Bestandteil des Repertoires an angeborenen Immunwaffen. Die unkontrollierte NET-Bildung wurde jedoch mit zahlreichen autoinflammatorischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. ^3,4 Trotz ihrer zunehmenden etablierten Relevanz ist nur wenig über den Mechanismus und die Regulierung der NET-Veröffentlichung bekannt.

Neutrophile, die durch Freisetzung von NETs sterben, unterscheiden sich von apoptotischen oder nekrotischen Neutrophilen. ^3,5 kgNET-freisetzende Neutrophile weisen mehrere Merkmale auf, die für die NET-Bildung charakteristisch sind. Granulatkomponenten sind mit der DNA in NETs assoziiert. ¹ Myeloperoxidase (MPO) und humane neutrophile Elastase (HNE) kommen beide in primären Granula in ruhenden Zellen vor, werden aber in den Zellkern transloziert, um an DNA in NETs zu binden. ¹ MPO-DNA- und HNE-DNA-Komplexe sind spezifisch für NETs, kommen in apoptotischen oder nekrotischen Neutrophilen nicht vor. ^1,3,5 Die Chromatin-Dekondensation ist ein weiteres typisches Merkmal der NETose. ^{arabische Ziffer} Die NET-Freisetzung erfordert auch die Citrullinierung von Histonen durch Peptidylaminidase 4 (PAD4). ⁶ Citrullinierte Histone sind Kennzeichen von Neutrophilen, die eine NET-Freisetzung durchlaufen haben. ⁶

Hier werden drei Methoden vorgestellt, die in Kombination hervorragende Werkzeuge zur Quantifizierung von NETs auf einer Hochdurchsatzskala bieten. Der erste Assay wurde mit unterschiedlichen Veränderungen vor Ort eingesetzt und quantifiziert die extrazelluläre DNA-Freisetzung in einem Mikroplattenformat. Der zweite und dritte Assay liefern die Bestätigung von NETs durch Messung von NET-spezifischen MPO-DNA- und HNE-DNA-Komplexen.

Protokoll

Die Institutional Review Board der University of Georgia genehmigt das menschliche Subjekt Studie peripheren Blut von gesunden Freiwilligen (UGA # 2012-10769-06) zu sammeln. ^5,7,8 Freiwilligen unterzeichnet die erforderliche Einverständniserklärung vor der Blutentnahme. Die Forschung in diesem Artikel ausgeführt ist in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für die medizinische Forschung am Menschen von der Deklaration von Helsinki.

1. Isolierung von Neutrophilen aus peripherem menschlichem Blut (Figur 1)

Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, Neutrophile aus peripherem Blut zu isolieren. Das folgende Protokoll stellt eine Möglichkeit. Dieses Protokoll liefert eine große Anzahl von nicht-aktivierten menschlichen Neutrophilen der Lage NETs auf externe Stimulation freigesetzt wird. Verwenden Sie 40 ml Vollblut von gesunden Freiwilligen durch Venenpunktur. ^7,9

1. Aliquotieren 20 ml Blut in zwei 50 ml konischen Röhrchen. 10 ml 6% Dextran. Vorsichtig mischen.
2. Nach 20 min Transfer der Leukozyten-rich obere Phase ohne pelle roten Blutkörperchen in saubere 50 ml konische Röhrchen nehmen, und füllen Sie es mit sterilem PBS auf.
3. Zentrifuge bei 400 xg 10 min. Pellet in 4 ml sterilem PBS.
4. Bereiten Sie einen 5-stufigen Percollgradienten von 85% -80% -75% -70% -65% in zwei 15 ml konischen Röhrchen und Schicht 2 ml Leukozyten-Suspension auf der jeweils Gradienten.
5. Zentrifuge 800 × g für 30 min mit Bremsen aus.
6. Sammle alle Zellen (Neutrophile) in den Schichten an der 75% / 80% und 70% / 75% Schnittstelle.
7. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (350 · g, 10 min, RT) und zählen Zellen eine Zählkammer.

2. Messung der Kinetik der extrazellulären DNA Veröffentlichung Mit Hilfe eines Mikroplatten-Fluorimeter

Hinweis: Diese Methode ermöglicht die Messung von Veränderungen in der Fluoreszenz eines membran impermeable DNA-bindenden Farbstoff anzeigt DNA Freisetzung auf einer 96-Well - Mikrotiterplatten - Format (Abbildung 2).

1. Eine Suspension von Neutrophilen in Testmedium (HBSS +1% (v / v) autologem Serum + 5 mM Glucose) bei einer Konzentration von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml.
2. Werden 5 & mgr; mol / L der Membran undurchlässig DNA-bindenden Farbstoff. Vorsichtig mischen.
3. Aliquotieren humanen Neutrophilen (50 & mgr; l / Vertiefung) auf 96-Well-schwarz, transparenten Boden Mikrotiterplatten. Stellen Sie sicher, dass das Testmedium den gesamten Boden des Bohrlochs erstreckt. Wenn nicht, tippen Sie auf die Platte vorsichtig auf die Seite.
4. Warm up die Platte, die Neutrophile für 10 min bei 37 ° C.
5. In der Zwischenzeit werden die Lösungen von Reizen auf das Doppelte ihrer endgültigen Konzentrationen eingesetzt werden (in 37 ° C warmen Testmedium). Als ein positives Nettosteuer menschliche Neutrophilen mit 100 nM Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) für 4 Stunden nutzen , um eine maximale NET Freisetzung auslösen. ^5,8 PMA - Stimulation für 4 Stunden sorgt für maximale NET Freisetzung während spontane NET Bildung niedrig ^5,8 bleibt.
6. Bereiten Sie die Mikrotiterplatte Fluorimeter für die Messung (4 Stunden, 37 ° C, 530 nm zur Anregung und 590 nm für Emission).
7. Neutrophile stimuliert durch Zugabe von 50 & mgr; l Reizlösung auf 50 ul Neutrophilen Suspensionen. Verwenden Sie 0,5 ug / ml Saponin in einem gut maximale DNA-Freigabesignal zu messen.
8. Legen Sie die Platte in Leser und messen Veränderungen in der Fluoreszenz für 4 Stunden bei jeder 2 min ohne Schütteln.
9. Für die Datenanalyse berechnen normalisierten Erhöhungen der Fluoreszenz über die Zeit.
   1. Subtract Fluoreszenzbasis von Endpunktwerte für alle Vertiefungen einschließlich Saponin (2A, B). Aufstieg in Saponin Fluoreszenz sollte das höchste Signal sein. Es wird als "maximale DNA - Freigabe" (2A) bezeichnet.
   2. Berechnen Prozentsatz der DNA-Freisetzung in unbekannten Proben durch einen Anstieg der Fluoreszenz von unbekannten Proben durch maximale DNA-Freisetzung zu teilen.
   3. Durchschnittliche Ergebnisse der Replikate und präsentieren sie als "% der maximalen DNA - Release" (Abbildung 2C).

3. Die Quantifizierung von NET-Formularation von MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays

Hinweis: Diese Assays modifiziert (MPO-DNA) oder etablierte (HNE-DNA) in unserem Labor NET Bildung Quantifizieren von Niveaus von MPO-DNA und HNE-DNA - Komplexe Messung ^5.

1. Mantel 96-well hohe Bindungskapazität ELISA-Platten über Nacht mit Fänger-Antikörper (50 & mgr; l / Well): anti-MPO (1: 2000 Verdünnung) oder anti-HNE (1: 2000).
2. Wasch ELISA Platten dreimal mit PBS (200 ul / Vertiefung) und blockieren sie mit 5% BSA und 0,1% humanes Serumalbumin für 2 h bei RT (200 ul / Vertiefung). Wasche dreimal mit PBS.
3. Seed Neutrophilen auf 96-well Mikrotiterplatten in einer Dichte von 100.000 Zellen / Well in 100 & mgr; l Assay-Medium und NET Bildung stimulieren. Inkubiere Zellen: 4 h 37 ° C.
4. Führen Sie eine begrenzte DNase-Verdau durch Zugabe von 2 U / ml DNase Neutrophilen Stände, mischen sie gut. Halten Sie diese bei RT.
5. Stoppen Sie die DNase nach 15 Minuten durch Zugabe von 11 & mgr; l 25 mM EGTA (Endkonzentration 2,5 mM). Gut mischen. Sammeln Sie supernatants in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Proben bei 300 × g für 5 min bei RT loszuwerden Zelldebris zu werden. Bringen Sie ihre Stände in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie sie auf Eis, bis sie bereit.
6. Verwenden Sie einen aliquoten Teil einer zuvor hergestellten "NET-Standard".
   Hinweis: Die NET-Standard ist eine Mischung aus DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten, die aus mindestens 5 verschiedenen, unabhängigen menschlichen Spendern.
   1. Um den gleichen Standard für eine lange Zeit, zu sammeln und ein großes Volumen an neutrophilen Stände von jedem einzelnen Spender aliquotieren. Sammeln zum Beispiel 2 ml DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten Neutrophilen werden in 200 Aliquots (10 ul jeweils) genug für 200 ELISA-Platten führen. Die Daten der NET - Standard kennzeichnen , sind in Abbildung 5 gefunden.
   2. Stimulieren menschliche Neutrophilen mit 100 nM PMA für 4 Stunden und gelten DNase nach Schritten, um ihre Überstände verdauen 3,4-3,5.
   3. Sammeln, Pool, Aliquot (10 ul) und kostenlosze (-20 ° C) neutrophil Überständen.
   4. Zur Herstellung der "NET-Standard", Tauwetter ein Aliquot / Spender aus mindestens fünf verschiedenen Spendern erhalten, mischen sie und halten sie auf dem Eis.
   5. Entsorgen Sie aufgetauten Proben und frische für den nächsten Versuch verwenden.
   6. Bereiten Sie eine 1: 2 serielle Verdünnung des NET-Standard in PBS + EGTA.
7. Verdünnen Sie DNase1-verdauten Proben (Standard und unbekannte Stände) 20-fach in PBS + EGTA und aliquotieren sie auf ELISA-Platten mit Fänger-Antikörper beschichtet.
8. Inkubieren ELISA-Platten über Nacht bei 4 ° C und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
9. Bewerben Detektions-Antikörper-Lösung (100 & mgr; l / Well): Meerrettich-Peroxidase-konjugierter anti-DNA-Antikörper (1: 500, Maus). Inkubieren für 1 Stunde in Dunkelheit.
10. Nach vier Waschungen mit PBS TMB Peroxidasesubstrat hinzufügen: 100 & mgr; l / Vertiefung, 30 min. Blaue Färbung ist ein Indiz für die Peroxidase-Aktivität (NETs vorhanden).
11. Stop Reaktion durch Zugabe von 100 ul / Vertiefung 1 M HCl. Dasblau Lösungen gelb (5A) drehen.
12. Lesen Sie die Absorption bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Photometer.
13. Für die Datenanalyse, die Berechnung der Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA-Komplexe im Vergleich zu dem NET-Standard.
    1. Ziehen Sie den Hintergrund Wert der optischen Dichte des Testmediums aus allen Proben.
    2. Zeichnen Sie die Absorptionswerte (X-Achse) der verdünnten Standardproben gegen ihren Nettogehalt (Y-Achse) (5A).
    3. Mit dem nicht gesättigten Bereich dieser Standardkurve eine Trendlinie etablieren (beste exponentielle Anpassung der Software verwendet wird ) (5A). Die Gleichung dieser Trendlinie bestimmt die Umwandlung von OD-Werte Mengen von NETs quantitativ.
    4. Legen Sie die gemessenen OD - Werte der Unbekannten in den Trend-Linie Gleichung von 3.13.3, die die Menge von NETs in der unbekannten Probe als Prozentsatz des Netto-Standard (5A) geben wird.
    5. BerechnenMittelwerte von Replikaten (dreifacher Ausführung) und die endgültigen Daten als "Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA - Komplexe ( in % der Norm)" (5C) präsentieren.

Ergebnisse

Die Zahlen in diesem Manuskript die Methode der Neutrophilen - Isolierung, experimentelle Verfahren beschreiben und präsentieren repräsentative Ergebnisse mit Erklärung der Datenanalyse. Abbildung 1 die aufeinanderfolgenden Schritte der humanen neutrophilen Vorbereitung zeigt. Dieses Protokoll stellt nur eine mögliche Art der Neutrophilen-Isolation. Es ergibt große Mengen an Neutrophilen freisetzen kann , NETs bei Stimulierung ruht. 2 zeigt , wie die Flu...

Diskussion

NETs stellen eine faszinierende neuartige Mechanismus , durch den Erreger Neutrophilen töten. ¹ Obwohl die Literatur von NETs hat den letzten zehn Jahren den Ausbau über kontinuierlich seit ihrer Entdeckung, einige wichtige Fragen zu ihrer Rolle im Zusammenhang mit der Biologie, Mechanik und Regelung unklar bleiben. Entsprechende Methodik entwickelt werden NETs zu messen, diese einzigartigen antimikrobiellen Mechanismus. Dieser Artikel beschreibt Verfahren, die verwendet werden können NETs in einem Hochdurchs...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-humane neutrophile Elastase  Kaninchen ab	Calbiochem	481001	1:2.000x beschichtetes
Anti-Myeloperoxidase Ab (Kaninchen)	Millipore	07-496	1:2.000x beschichtetes
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µ g/ml für den Aufschluss
verwendet 20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2,5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Zelltoderkennung ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Mikrotiterplatten-Spektralphotometer	Biotek
Gen5 All-in-One-Mikrotiterplatten-Software	Biotek		Analysewerkzeug (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0,2 % Endkonzentration/Volumen
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Verwenden Sie eine Endkonzentration von 10 mM.
1 M Glukose	Sigma		Verwenden Sie 5 mM Endkonzentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Konische Röhrchen 15 ml	Thermoscientific	339650
Konische Röhrchen 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8,5-9,5)	Sigma	P 1644	Natriumchlorid, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 Medien	Corning Cellgro	17-105-CV
96 Well Assay Platte schwarze Platte	Costar	3603