Es werden Hochdurchsatz-Assays vorgestellt, die in Kombination hervorragende Werkzeuge zur Quantifizierung der NET-Freisetzung von menschlichen Neutrophilen bieten.
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Methodenartikel
Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blut. Neutrophile sind die ersten, die am Ort der Infektion ankommen. Neutrophile entwickelten verschiedene antimikrobielle Mechanismen, darunter Phagozytose, Degranulation und Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für Neutrophile. NETs bestehen aus einem DNA-Gerüst, das mit Histonen und mehreren Granulamarkern dekoriert ist, darunter Myeloperoxidase (MPO) und humane neutrophile Elastase (HNE). Die NET-Freisetzung ist ein aktiver Prozess, der charakteristische morphologische Veränderungen von Neutrophilen beinhaltet, die zur Ausstoßung ihrer DNA in den extrazellulären Raum führen. NETs sind wichtig für die Bekämpfung von Mikroben, aber die unkontrollierte Freisetzung von NETs wurde mit mehreren Erkrankungen in Verbindung gebracht. Um mehr über die klinische Relevanz und den Mechanismus der NET-Bildung zu erfahren, besteht ein Bedarf an zuverlässigen Werkzeugen, die in der Lage sind, die NET-Quantifizierung durchzuführen.
Hier werden drei Methoden vorgestellt, mit denen die NET-Freisetzung von humanen Neutrophilen in vitro beurteilt werden kann. Der erste ist ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung der extrazellulären DNA-Freisetzung aus menschlichen Neutrophilen unter Verwendung eines membranundurchlässigen DNA-bindenden Farbstoffs. Darüber hinaus werden zwei weitere Methoden beschrieben, die in der Lage sind, die NET-Bildung durch Messung des Gehalts an NET-spezifischen MPO-DNA- und HNE-DNA-Komplexen zu quantifizieren. Diese Mikroplatten-basierten Methoden bieten in Kombination hervorragende Werkzeuge, um den Mechanismus und die Regulation der NET-Bildung menschlicher Neutrophilen effizient zu untersuchen.
Einleitung
NET-Bildung ist ein neuartiger Mechanismus, mit dem Neutrophile Krankheitserreger bekämpfen. 1 Der Kern von NETs ist die nukleare DNA. 1 Dieses DNA-Netzwerk ist mit neutrophilen Körnerproteinen und Histonen assoziiert. 1 Die Hauptform der NET-Bildung erfordert den Tod von Neutrophilen, die durch Chromatin-Dekondensation, Verschwinden von granulären und nukleären Membranen, Translokation der neutrophilen Elastase in den Zellkern, Citrullinierung von Histonen und schließlich das Verschütten von DNA-basierten NETs gekennzeichnet ist. arabische Ziffer NETs fangen und töten eine Vielzahl von Mikroben und sind ein wesentlicher Bes....
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Protokoll
Die Institutional Review Board der University of Georgia genehmigt das menschliche Subjekt Studie peripheren Blut von gesunden Freiwilligen (UGA # 2012-10769-06) zu sammeln. 5,7,8 Freiwilligen unterzeichnet die erforderliche Einverständniserklärung vor der Blutentnahme. Die Forschung in diesem Artikel ausgeführt ist in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für die medizinische Forschung am Menschen von der Deklaration von Helsinki.
1. Isolierung von Neutrophilen aus peripherem menschlichem Blut (Figur 1)
Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, Neutrophile aus peripherem Blut zu isolieren. Das folgende Protokoll stellt eine Möglichkeit....
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Ergebnisse
Die Zahlen in diesem Manuskript die Methode der Neutrophilen - Isolierung, experimentelle Verfahren beschreiben und präsentieren repräsentative Ergebnisse mit Erklärung der Datenanalyse. Abbildung 1 die aufeinanderfolgenden Schritte der humanen neutrophilen Vorbereitung zeigt. Dieses Protokoll stellt nur eine mögliche Art der Neutrophilen-Isolation. Es ergibt große Mengen an Neutrophilen freisetzen kann , NETs bei Stimulierung ruht. 2 zeigt , wie die Flu.......
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Diskussion
NETs stellen eine faszinierende neuartige Mechanismus , durch den Erreger Neutrophilen töten. 1 Obwohl die Literatur von NETs hat den letzten zehn Jahren den Ausbau über kontinuierlich seit ihrer Entdeckung, einige wichtige Fragen zu ihrer Rolle im Zusammenhang mit der Biologie, Mechanik und Regelung unklar bleiben. Entsprechende Methodik entwickelt werden NETs zu messen, diese einzigartigen antimikrobiellen Mechanismus. Dieser Artikel beschreibt Verfahren, die verwendet werden können NETs in einem Hochdurchs.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Besonderer Dank geht an das Personal des Labors des University of Georgia Health Center für ihre kontinuierliche Unterstützung unserer Arbeit zur Isolierung menschlicher Neutrophilen. Diese Arbeit wurde durch den Start-up-Fonds von Dr. Rada unterstützt, der vom UGA-Büro des Vizepräsidenten für Forschung zur Verfügung gestellt wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-humane neutrophile Elastase Kaninchen ab | Calbiochem | 481001 | 1:2.000x beschichtetes |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Kaninchen) | Millipore | 07-496 | 1:2.000x beschichtetes |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µ g/ml für den Aufschluss |
| verwendet 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2,5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Zelltoderkennung ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Mikrotiterplatten-Spektralphotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One-Mikrotiterplatten-Software | Biotek | Analysewerkzeug (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0,2 % Endkonzentration/Volumen |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Verwenden Sie eine Endkonzentration von 10 mM. |
| 1 M Glukose | Sigma | Verwenden Sie 5 mM Endkonzentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Konische Röhrchen 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Konische Röhrchen 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8,5-9,5) | Sigma | P 1644 | Natriumchlorid, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 Medien | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 Well Assay Platte schwarze Platte | Costar | 3603 |
Referenzen
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
