Abstract
Celler från djur, växter och enstaka celler omges av en barriär som kallas cellmembranet som skiljer cytoplasman från utsidan. Cellskikt såsom epitel bildar även en barriär som separerar insidan från utsidan eller olika avdelningar av multicellulära organismer. En viktig del av dessa hinder är skillnaden fördelningen av joner över cellmembraner eller cellskikt. Två egenskaper ger denna fördelning: 1) membran och epitel visar selektiv permeabilitet för specifika joner; 2) joner transporteras genom pumparna över cellmembran och cellskikt. Dessa egenskaper spelar avgörande roller för att upprätthålla vävnads fysiologi och fungerar som signal ledtrådar efter skada, vid reparation eller under patologiska tillstånd. Den jonselektiva självrefererande mikroelektrod tillåter mätningar av specifika flöden av joner såsom kalcium, kalium eller natrium vid encelliga och vävnadsnivåer. Den mikro innehåller en jonofor cocktail som ärselektivt permeabelt för en specifik jon. Den interna fyllningslösning innehåller en inställd koncentration av jonen av intresse. Den elektriska potentialen hos den mikroelektrod bestäms av utsidan koncentrationen av jonen. Som jonkoncentrationen varierar ändrar potentialen i mikroelektrod som en funktion av logaritmen av jonaktivitet. När de förflyttas fram och tillbaka i närheten av en källa eller sjunka av jonen (dvs. i en koncentrationsgradient på grund av jonflöde) mikroelektroden potentialen fluktuerar vid en amplitud proportionell mot jonflödet / lutning. Förstärkaren förstärker mikroelektroden signalen och utsignalen registreras på datorn. Jonflödet kan då beräknas genom Ficks diffusionslag användning elektrodpotentialen fluktuation, utsvängningen av mikroelektrod, och andra parametrar, såsom den specifika jonrörlighet. I detta dokument beskriver vi i detalj metod för att mäta extracellulära jonflöden använder jonselektiva självrefererande mikro end presentera några representativa resultat.
Introduction
Alla djurceller är omgivna av ett lipiddubbelskikt membran som separerar cytoplasman från den yttre miljön. Cellen upprätthåller en elektrisk membranpotential, negativ inuti, genom aktiv transport av joner 1. Membranpotentialen är en lagrad energikälla som cellen kan använda för att driva olika molekylära enheter i membranet 2. Nervceller och andra exciterbara celler har stora membranpotentialer. Snabb öppning av natriumkanaler kollapsar membranpotentialen (depolarisation) och alstrar aktionspotentialen som transporteras utmed längden av neuron 2. Bortsett från dessa snabba elektriska förändringar, många vävnader och organ skapa och upprätthålla betydande långsiktiga elektriska potentialer. Till exempel, hud och hornhinnan epitel generera och upprätthålla trans epitelceller potentialer och extracellulära elektriska strömmar genom riktad pumpning av joner (främst natrium och klorid) 3.
tält "> Även om mätningar av endogena extracellulära elektrisk ström med hjälp av vibrerande sond 4-6 och mätningar av membran eller trans-epitelceller potentialer med hjälp av mikrosystemet 7-10 tillåta mätning av elektriska parametrar i cellmembran och epitelceller cellager, ger de inte uppgift om jontyper inblandade.Microelectrodes med selektiv jonofor kan mäta specifik jonkoncentration i lösning. Jongradienter eller flussmedel kunde mätas med två eller flera elektroder vid olika positioner. Emellertid skulle den inneboende spänningsdrift av varje sond vara olika, vilket orsakar felaktiga mätningar eller även detektering av en lutning som inte var närvarande. En enda elektrod som används i "självrefererande" -läge, varigenom den rör sig vid låg frekvens mellan två punkter löser detta problem. Nu jonflödet kan ses mot bakgrund av en relativt långsam och stabil signaldrift (se figur 3B). Mätsystemet jonkänsligt använder jonselektiva självrefererande mikroelektroder för att upptäcka små extracellulära flöden av joner nära vävnader eller enstaka celler. Systemet består av en förstärkare som behandlar signalen från mikroelektroden och en mikrostegmotor och föraren att kontrollera rörelsen av mikroelektrod. Den jonselektiva mikroelektroden och referenselektroden som sluta kretsen är anslutna till förstärkaren via en huvudsteg för-förstärkaren (Figur 1A). Dator program bestämmer parametrarna för mikroelektroden rörelsen (frekvens, avstånd) och även registrerar utsignalen från förstärkaren. Stegmotorn styr mikrorörelsen via en tredimensionell micropositioner. En låg frekvens vibrerande jonselektiva mikro utvecklades först år 1990 för att mäta specifik kalciumflöde 11. Samt kalcium, kommersiellt tillgängliga jonofora cocktails finns nu att göra microelectrodes känsliga för natrium, klorid, kalium, väte, magnesium, nitrat, ammonium, fluorid, litium eller kvicksilver.
I grund och botten omvandlar självrefererande jonselektiva mikroelektrodteknik aktiviteten av en specifik jon löstes i en lösning till en elektrisk potential, som kan mätas med en voltmeter. Jonoforen cocktail är en oblandbar vätska (organisk, lipofil) fas med jonbytande egenskaper. Jonoforen komplex selektivt (binder) specifika joner reversibelt och överför dem mellan vattenlösningen som finns i mikro (elektrolyt) och vattenlösningen där mikro är nedsänkt (Figur 1D). Denna jonöverföring leder till en elektrokemisk jämvikt och en variation av den elektriska potentialen mellan mikroelektroden och referenselektroden mäts med voltmetern. Spänningen är proportionell mot logaritmen för specifik jon aktivitet enligt Nernsts equation tillåter beräkningen av jonkoncentrationen (Figur 2A och B).
För närvarande flera system tillåter mätning av jonflöde använder ett liknande koncept eller princip. Till exempel Scanning jonselektiv elektrod Technique (SIET) 12,13 eller mikroelektrod Ion Flux Estimation (MIFE) teknik som utvecklats av Newman och Shabala 14-16 är kommersiellt tillgängliga och används i stor utsträckning av forskarsamhället i syfte att fastställa specifik jon flöden förekommer vid cellmembranet och vävnaden i en mängd olika djur, växter och enda levande cellmodeller. Jonselektiva mikroelektroder har använts för att mäta väte, kalium och kalciumflöde över växtrötter 17, klorid flöde i råtta cerebrala artärer 18 och i pollenslangar 19, väteflöde i skridsko retinala celler 20, kalciumflöde i mus ben 21, olika jon flöden i svamphyfer 22 och i rpå hornhinnan 23, och slutligen kalciumflöde under en enda cell sårläknings 12,24. Se även följande recension för detaljerad information om jonselektiva självrefererande mikroelektroder 25.
Följande artikel beskriver i detalj hur man förbereder och utför mätning av endogena extracellulära jonflöden hjälp av jonselektiva självrefererande mikroteknik vid den enda cellnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Jonselektiv självrefererande mikroelektrod Förberedelse
- Framställning av jonselektiv mikro
- Heat dra tunnväggiga borosilikat kapillärer utan filament (1,5 mm ytterdiameter, 1,12 mm innerdiameter) med en mikro avdragare.
Obs: Detta ger tips 3-4 mikrometer i diameter. Mindre spetsar har högre motstånd som gör mikroelektroder mer mottagliga för elektroniskt brus och är också associerad med en långsammare svar på en förändring i jonkoncentration. Praktisk information kan hittas i uppsatsen publicerades av Smith et al. 26. - Silaniseras elektroderna för att göra den inre ytan hydrofob för att underlätta kvarhållandet av den lipofila jonoforen cocktail. Placera mikroelektrodema i ett metallställ och värme O / N i en ugn vid> 100 ° C för att torka dem. Stället är en metallplatta med hål 2 mm diameter borras en del av vägen igenom. Placera elektroderna i hålen tippa uppåt med en 250 ml glass bägare över dem.
- På morgonen, stäng av ugnen och samtidigt bär isolerade handskar, försiktigt bort metall rack med elektroderna och bägare på plats. Stäng ugnsluckan för att behålla värmen.
- Använd latex eller nitril, labbrock och skyddsglasögon. Med en plast pasteurpipett, placera en droppe silaniseringen lösning som jag vid basen av varje elektrod (hålla bägaren på plats, använd häll läpp för pipett tillgång). Den silaniseringen lösningen förångas genom den heta plattan och silanizes insidan av elektroderna. Använd en kemisk köks dragskåp för detta steg. Placera rack / bägare / elektroderna tillbaka i varm ugn i några timmar så att eventuella kvarvarande silanisering lösning avdunsta.
Obs: Av säkerhetsskäl inte stänga av ugnen igen. Placera en etikett på ugnen indikerar det får inte vara påslagen eftersom det kan innehålla skadliga och brandfarliga ångor. - Efter kylning, lagra mikroelektrodema i en mikroförvaringsburk insifrån ett glas exsickator med 400 g torkmedel. Microelectrodes kan lagras alltså i flera veckor.
Obs: Ett alternativt silanisering metod beskrivs i Smith et al 26. - Back-fylla mikroelektrod med 50 till 100 | il (en längd av ca 1 cm) av en lösning innehållande 100 mM av jonen, som skall mätas (se Tabell 1 och figur 1B). Använd en engångsplast pasteurpipett värme dras i en bunsenbrännare till en fin glödtråd. Skölj pipetten i dH 2 O efteråt att förhindra blockering.
Obs: Du kan också justera jonkoncentrationen av återfyllningslösning för att matcha koncentrationen av jonen i extern lösning 27. - Observera mikro under ett dissekera mikroskop för att säkerställa att inget luftbubblor.
- Om bubblor finns kranen mikroelektroden lätt med en fingernagel medan du håller elektroden vertikalt (tippa ned) och / eller driva bubblans ut spetsen genom att applicera mottryck med användning av en injektionsspruta som modifierats med en silikonslang byter nål.
- Tip-fylla mikroelektrod med 15 till 20 nl (en längd av 30-50 | j, m) av jon-specifik jonofor cocktail (se tabell 1). Placera en liten droppe av jonofor cocktail på kortsidan av ett objektglas. Observera mikrospetsen under ett dissektionsmikroskop och flytta den mot objektglas tills mikrospetsen vidrör jonoforen cocktail för endast cirka en halv sekund. Rita jonoforen cocktail i mikro genom kapillär tryck.
Obs! Undvik en lång kolonn av jonofor cocktail eftersom detta ökar sondens elektriska motstånd som kan göra den känslig för elektroniska störningar (buller) och även saktar svarstiden. - Montera mikroelektroden i en rak mikrohållare med ett guld 1 mm hankontakt och AgCl (Ag +) kabeln (Figur 1B). </ Li>
- Fäst mikroelektroden hållaren på huvudet scenen är monterad på en tredimensionell datorstyrd elektronisk micropositioner (Figur 1A).
- Placera mikroelektroden spetsen i mätning lösning som är lämplig för det prov som skall mätas (fysiologisk saltlösning, odlingsmedium, etc.) för att göra det möjligt för mikroelektrod för att stabilisera under en timme eller två, eller till och med över natt.
- Heat dra tunnväggiga borosilikat kapillärer utan filament (1,5 mm ytterdiameter, 1,12 mm innerdiameter) med en mikro avdragare.
- Framställning av referenselektroden
- Referenselektroder (Figur 1C) är samma kapillärer som ovan. Skär kapillär med en diamant penna i 5 cm längder och brand poleras vid varje ände för 1-2 sekunder i en bunsenlåga.
- Fyll dessa elektroder med ~ 200 | il av en 3 M lösning av NaCl, CH3CO 2 K (kaliumacetat) eller KCI med 2% agaros. Välj den lösning beroende på jonen, som skall mätas (referenselektroden bör inte innehålla jonen som mäts, se tabell 1). Blandaagarosen och lösningen och värm till nästan kokning i en mikrovågsugn. Rör för att lösa agarosen (lösningen går klar).
- Fäst referenselektroden till en plast pasteurpipett och rita den varma lösningen i kapillären.
- Släpp elektroden i kall 3 M NaCl, CH3CO 2 K eller KCl-lösning och förvara i detta 3 M lösning i slutna rör före användning. Kasta några referenselektroder med luftbubblor.
- Montera referenselektrod i en rak mikrohållare (förfylld med 3 M lösning) med en AgCl (Ag +) pellets inuti och ett guld 2 mm hankontakt (figur 1C) och fäst elektrod och hållare på en manuell mikroläges monterad på ett magnetiskt ställ.
2. Jonselektiv självrefererande mikroelektrod kalibrering
- Förbereda kalibrering lösningar innehållande jonen av intresse som i referenslösningen; se tabell 1 (t.ex. odlingsmedier, fysiologisk saltlösning). Det är, måste en kalibreringslösning innehåller en lägre koncentration av jon än i mätningslösningen, och en högre.
- Använd till exempel saltlösning som innehåller 1 mM K +. Vid konsolen denna koncentration, upplöses KCl pulver i avjoniserat vatten till en koncentration av 10, 1 och 0,1 mM i serieutspädningar. Använd dessa kalibreringslösningar. Alternativt kan du använda åtminstone två av dessa lösningar.
- Sänk den jonselektiva mikro och referenselektrod i varje kalibreringslösning och låt spänningsvärdet stabiliseras under 1 till 3 minuter innan du spelar in den motsvarande spänningen med hjälp av särskild programvara (se tabell 1).
- Eftersom programvaran sparar data (output förstärkare) som en txt-fil, kopiera data till ett kalkylblad. Plotta mikroelektroden utgång (mV) mot logaritmen förden molära jonkoncentration (Figur 2A).
- Applicera en linjär regression och beräkna Nernsts lutning, intercept och R-värdet 2. Acceptera mikroelektroden om Nernsts lutningen är 58 ± 11 mV / dekad för monovalenta joner och 29 ± 11 mV / dekad för tvåvärda joner (för katjoner, är Nernsts lutning positiv, för anjoner det är negativt). Dessutom bör goda mikroelektroder har en stark linjär korrelation (R 2> 0,9; Figur 2B).
Obs! MV utgång från förstärkaren används här ger mV läsning med en tiofaldig vinst. Värden måste delas med en faktor tio. - Använd den linjära regressionsformeln för att omvandla råa mV utsignal mikroelektroden till faktisk jonkoncentration (Figur 2B).
3. Validering av Jonselektiv mikroelektrod Teknik
- Förbereda en artificiell källa
- Artificiella käll kapillärer är samma kapillärer somovan. Värme dra kapillär med hjälp av en mikro avdragare som i steg 1.1.1.
- Återfyllning dessa kapillärer med 200 | il av en 1 M lösning av NaCl, KCl, CaCl2 2 H 2 O eller pH 4 buffert. Välj den artificiella källan lösning beroende på vilken jon som skall mätas (se tabell 1).
Obs: Du kan också dra elektroder med större spetsdiameter (~ 20 mikrometer) och dricks Fyll med samma lösningar men innehållande 0,5-1% agaros (agaros kommer förhindra massflöde lösning). - Montera den artificiella källan kapillär på en mikromanipulator och doppa den i den lösning som används för att mäta flödet av jonen i proverna. Lämna den artificiella källan i lösningen under 30 min till 1 h för att tillåta stabilisering av gradienten.
- Validering av den jonselektiva mikroelektroden
- Doppa den jonselektiva mikroelektrod ungefär en centimeter från den artificiella källan kapillär i lösningen som används för att measure flödet av joner på proverna och sluta kretsen med referenselektrod som förut. Låt spänningsvärdet stabiliseras under 1 till 3 minuter innan inspelning av motsvarande spänning med hjälp av dedicerad programvara under 1 till 2 min. Detta värde motsvarar buffertvärdet (i litteraturen även kallat referens, bakgrund eller blankvärdet).
- Flytta jonselektiva mikro till ca 5 pm från den artificiella källan och låt spänningsvärdet stabiliseras under 1 till 3 minuter innan du spelar in den motsvarande spänningen med hjälp av programvara för 1 till 2 min.
- Upprepa proceduren ovan genom att placera jonselektiva mikroelektroden vid 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 och 1280 um bort från den artificiella källan kapillär.
- Extrahera data som en txt-fil och kopiera värdena i ett kalkylblad.
- Beräkna jonkoncentration motsvarande de mV värden på samma sätt som för kalibreringsvärdena. Plotta värdet.
Nejte: Om en jonflöde är närvarande, upptäcker en skillnad i jonkoncentration mellan de två lägena (figur 3B) mikroelektroden. Om den artificiella källan innehåller flera joner av de arter som uppmätts än den lösning, bör koncentrationen vara högre nära källan än långt borta, validera förmågan hos den jonselektiva mikroelektrod för att korrekt detektera riktningen av en jonflödet (i detta fall utflöde; för en artificiell diskbänken, med lägre specifik jonkoncentration än mätmediet, bör det vara tillströmning).- Beräkna jonflödet användning Ficks diffusionslag: J = C μ (dc / dx) där c är jonkoncentrationen i lösningen (mol cm -3), μ är jonrörlighet (mol- cm N -1 sek -1) och dc är koncentrationen skillnaden över avstånd dx (cm) (figur 2C). Jonflöde uppgifter brukar presenteras i pmol cm -2 s-1 Eller nmol cm -2 s -1.
Anm.:. En alternativ metod för jonflöde beräkning beskrivs av Smith et al, 26 kan användas. De viktigaste skillnaderna inkluderar användning av diffusionskoefficienten i stället för jonrörlighet och subtraktion av bakgrunden jonflöde (även spänningsdrift eller korrektionsfaktor) beräknas genom mätning av jonflöde i saltlösning utan prov. - Plotta medelvärdet av jonflöden i varje steg mot avståndet från källan (figur 2D). Rör sig bort från källan, observera en exponentiell minskning av flödesvärdet validera förmågan hos den jonselektiva mikroelektrod för att avkänna olika storleken på jonflöden.
- Gör artificiell källa validering gång för varje specifik jon avsedd att spelas in för att validera sina rätta riktning och storlek mätningar med en stor signal-noise förhållande.
Obs: jonflöde mätning av buffert utan prover visar bakgrundsnivån eller brus. Normalt visar buffertmätning ingen tydlig fluktuationer i jonkoncentration leder till mycket liten flöde som visar varierande riktningar.
- Beräkna jonflödet användning Ficks diffusionslag: J = C μ (dc / dx) där c är jonkoncentrationen i lösningen (mol cm -3), μ är jonrörlighet (mol- cm N -1 sek -1) och dc är koncentrationen skillnaden över avstånd dx (cm) (figur 2C). Jonflöde uppgifter brukar presenteras i pmol cm -2 s-1 Eller nmol cm -2 s -1.
4. Framställning av mätkammaren
Obs! Innan experiment, anser det prov som skall mätas och hur provet ska monteras och orörlig under mikroelektrodmätningar.
- För Xenopus laevis äggcell mätningar klippa en 1 kvadratcentimeter av en 800 pm nylonnät (Nitex mesh) och limma den i en plastpetriskål (Figur 1E).
5. Ion Flux Mätning
- Mät jonkoncentrationen närvarande i bufferten som används för att utföra mätningar på provet på samma sätt som för kalibreringslösningen. X. laevis oocyter kräver Mark modifierade Ringer (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl och HEPES i avjoniserat vatten för att nå en slutlig koncentration av (mM): 100 NaCl, 2 KCI, 2 CaCl, 1 MgCl och 5 HEPES. Justera pH i bufferten till 7,5 med användning av NaOH.
- Placera provet in i mätkammaren och föra den jonselektiva mikroelektrod nära provet (ca 10 | j, m bort) med användning av micropositioner att definiera den nära positionen för mikroelektrod (figur 3A).
- Starta låg frekvens (0,3 Hz) utflykt (100 nm) av mikro mellan stängt läge och ett läge bort från provet (avlägsen) med hjälp av särskild programvara. Se till att förflyttningen av mikroelektrod är vinkelrät mot ytan av provet.
Obs: Utflykten av mikro kan ställas in på programvara. Stor utflykt ökar gradienten läsa möjliggör en enklare detektering av små flöden under mätningen medan förlänger samplingsintervall och minskar tidsupplösning. Se- Starta inspelningen med hjälp av programvaran. Den mikro pausar vid varje position och den elektriska potentialen i mV registreras på datorn. Skaffa mätningar under minst 2 minuter, vilket gör att signalstabilisering. För korta tidsförlopp experiment, spela potentiella variationer i läget av intresse för hela tidsförloppet.
- Extrahera data som en txt-fil och kopiera värdena i ett kalkylblad.
- Beräkna jonkoncentration motsvarande de mV värden på samma sätt som för kalibreringsvärdena. Plotta värdet.
Obs: Om en jonflöde är närvarande, upptäcker en skillnad i jonkoncentration mellan de två lägena (figur 3B) mikroelektroden.- Beräkna jonflödet använder Ficks lag diffusion som tidigare (steg 3.3.1).
- Upprepa buffert mätningen före mätning ett nytt prov och upprepa proceduren för flödesmätning och beräkning för varje nyprov.
6. Statistisk analys och presentation av data
- Testa de oberoende effekterna av läget och / eller tiden på jonflöden under kontroll tillstånd med hjälp av en ANCOVA modell med blandade effekter 28.
Obs: Analys av samvariation (ANCOVA) är en allmän linjär modell som blandar regelbunden ANOVA och regression genom att tillåta både kategoriska och kontinuerliga åtgärder som skall användas som oberoende variabler. Dessutom i närvaro av korrelerade fel orsakade av upprepade mätningar per individ och eventuella kapslade effekter, är blandade effekter modeller som används för att modellera exakta uppskattningar av både fasta och slumpmässiga effekter. - Beräkna parvisa jämförelser med hjälp av Students t-test mellan gruppnivå med Bonferroni korrigeringen för multipel testning 28.
- Generera boxplots att sammanfatta jonflöde mätning enligt position och tid. Inkludera p-värden från den parvisa Student t beskrivsovan (fig 3D) och ange signifikansnivåer p-värden enligt följande: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0,001 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidigare visat att kalciuminflöde visas efter en enda cell såra 24. Frågade vi därför om andra jonflöden uppträda när en enda cell sårskada. Vi använde X. laevis äggcellen, en väl etablerad modell för enskild cell sårläkning 30-34 och elektrofysiologiska inspelning 24,35-39. Intressant, kaliumjoner är mer koncentrerad inne X. laevis oocyter (ca 110 mm) 40 än i den extracellulära lösning som används (i MMR 1x: 1 mM) vilket tyder på en utflödet av kalium vid sårskada. För att bekräfta den hypotesen, mätte vi kaliumflödet under X. laevis äggcellen cellmembranet läka med hjälp av jonselektiva självrefererande mikro.
För att såra äggcellen, först dra en kapillär elektrod med en stor spets storlek (~ 50 mikrometer). Fäst elektroden till en rak elektrodhållare och montera på en manuell mikroläges. Sår i oocyte genom att vidröra membranet med elektrodspetsen 24. Snart efter sårbildning vi upptäckt ett stort utflöde av kalium (upp till 250 nmol cm -2 sec -1; Figur 3B - D). Eftersom membran såret läkt, detta flöde minskat, återvänder till oskadad flödesvärden ses i intakta membran (~ 5 nmol cm -2 sek -1) när såret läkt (upp till 16 minuter efter att såra, Figur 3B - D). ANCOVA visade en signifikant effekt av tid efter sårskada på kaliumflödesmätningar (p <0,001). Post hoc analyser avslöjade signifikant ökad kaliumutflödet på 1-2 minuter (p <0,001) och vid 5-6 min (p <0,05), men inte vid 15-16 minuter efter sårskada jämfört med intakt cellmembranet tillstånd (Figur 3D). Vi drog slutsatsen att vid enkel cell sårskada, visas ett utflöde av kalium på nivån för såret som minskar dUring under läkning.
| Jon | Jonofor cocktail | Elektrolytlösning (100 mM) | Referenslösning (3 M) | Artificiell källa lösning (1 M) |
| Ca2 + | Kalciumjonofor I Cocktail A (kat # 21048) | CaCl2 2 H2O | KCl | CaCl2 2 H2O |
| Na * | Natrium jonofor II Cocktail A (kat # 71178) | NaCI | KCl | NaCI |
| Cl - | Chloride jonofor I Cocktail A (kat # 24902) | NaCI | CH2CO 2 K (kaliumacetat) | NaCI |
| K + | Kalium jonofor I Cocktail A (kat # 60031) KCl | NaCI | KCl | |
| H + | Väte jonofor I Cocktail A (kat # 95.291) | pH 7,0 | KCl | pH 4,0 |
Tabell 1:. Exempel på vanligen använda jonofora cocktails visas också lämpliga lösningar för att placera i microelectrodes, för den artificiella källan och att utföra kalibrering. Katalognummer är från Sigma-Aldrich.
Figur 1:. Jonselektiva mikroelektroder (A) Schematisk representation av den jonselektiva självrefererande mikroelektrodsystemet. (B) Jonselektiv mikroelektrod. (C) referenselektrod. (D) Jonbyte mellan den externa lösningen och microelectrode via jonoforen. (E) Scheme of mätkammaren används för X. laevis oocyt.
Figur 2: Jonselektiva microelectrodes kalibrerings, artificiell källa och flödesberäknings (A) Kalibreringskurva.. (B) Ekvation av kalibreringskurvan och beräkningen av jonkoncentrationen. (C) Beräkning av jonflödet. (D) jonflödet uppmätt vid särskilda avstånd från den artificiella källan (1 M KCl).
Figur 3: Utvecklingen av kaliumflöde vid X. laevis äggcellen sår under läkning. (A) Foto och illustration av utflyktenav den jonselektiva mikroelektrod mäta jonkoncentrationen vid X. laevis oocyt sår; den streckade linjen mellan '' A '' och '' v '' representerar djur vegetabiliska axeln. (B) Illustration av variationen av kaliumjonkoncentrationen på X. laevis äggcellen sår under läkning. (C) Scatter (xy) diagram som visar medelvärdet och standardfelet av kalium flödesmätning vid nivån för såret vid olika tider under X. laevis äggcellen sårläkning. (D) Boxplot visar kaliumflödesmätning vid nivån för såret vid olika tider under X. laevis oocyt sårläkning (n = 16; p-värden som anges på följande sätt: *: p <0,05; ***: p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrik mätning av extracellulära jonflöden in vivo är följande: en minskning av bullret, den korrekta tillverkningen av jonselektiva mikroelektroder och referenselektrod, och placeringen av provet och båda elektroderna.
För att minimera buller, bör registreringssystemet vara i ett jordat (jordad) Faradays bur företrädesvis med en metallskiva (vibrationsisolering) bord som också är jordad. Dessutom bör mikroskopet chassit även vara jordad. Källor till elektriska störningar innefattar ljuskällan. En fiberoptisk "fläktlös" ljuskälla orsakar minimal elektrisk buller. Slutligen hålla silvertråd och pelleten i mikroelektroden hållare klorerad också minimerar brus (dopp i natriumhypoklorit blekmedel och skölj i dH 2 O) .Den närvaron av luftbubblor i den jonselektiva mikroelektrod eller i referenselektroden kommer att resultera i mätning misslyckande somkonduktiviteten hos mikroelektrod kommer att vara noll eller komprometterad. Därför är det viktigt att kontrollera elektroderna under mikroskop innan montera dem på hållarna. Se protokollet för detaljerat förfarande för att ta bort luftbubblor. Den korrekta positioneringen av både provet och mikroelektroderna krävs för att säkerställa tillförlitliga och reproducerbara resultat. Mätningen av jonflödet är beroende av utsvängningen hos den mikroelektrod och dess position i förhållande till provet. Det är viktigt att identifiera exakt det område av intresse som kommer att mätas på provet och placera mikro att ha en vinkelrät rörelse från provet. Någon utflykt av mikroelektrodema på ett sätt som inte är vinkelrät mot provet kommer att resultera i förändrad jonflöden mätningar och ökad variabilitet bland proverna.
Jonofora drinkar avsedda att mäta de specifika joner, t ex kalium, kan också avkänna närvaron av andra joner, såsom natrium.I det fall att mätningslösningen innehåller en stor mängd av en konkurrerande jon för jonoforen cocktail, är det viktigt att bestämma selektiviteten hos jonoforen cocktail med hjälp av artificiella källan experimentet. Här, den lösning som används för att odla X. laevis oocyter (MMR) innehåller en hög koncentration av natrium. Därför är det viktigt att bedöma huruvida kalium jonofor cocktail används också känner natrium. Genom att använda kalium jonofor cocktail fylld mikroelektrod, kan vi försöka att mäta en natriumflödet med hjälp av en artificiell källa som innehåller hög natriumkoncentration (1 M NaCl; se tabell 1) att hålla samma lösning mätning. Den kemiska gradienten gynnar utflödet av natrium, men helst inte natrium flux bör upptäckas av kaliumspecifika jonofor cocktail. Om en betydande flöde mäts, bör den experimentella tillståndet optimeras. Exempelvis kan koncentrationen av den konkurrerande jonen sänkas ner till den punkt på microelectrode inte känna det längre, även om detta kan påverka natriumflödet över plasmamembranet vilket leder till risk för störningar under kaliumflödesmätningar. Helst kan en korrektionsfaktor som beräknas från den artificiella källan experimentet tillämpas på data eller annan jonofor cocktail kan testas. Jonflödet mätningar med användning av de jonselektiva självrefererande mikroelektroden tillåta mätning av jonflöden som inträffar vid celler och vävnad i vattenlösning. Mätningar av jonflöden i celler eller vävnader som normalt är i kontakt med en luftmiljö kräver närvaro av en lösning som inte är naturligt närvarande i deras miljö och som kan ändra jonflödet och utbyte som sker under normala förhållanden. Särskild uppmärksamhet måste göras för att definiera innehållet i en sådan lösning och minimera avvikelsen från den ursprungliga, fysiologisk miljö. Spektrumet av joner som kan mätas genom de jonselektiva självrefererande microelectrode teknik beror på tillgång och förekomsten av särskilda jonofora cocktails selektiva för joner.
Jonflödet mätningar som utförts med den jonselektiva självrefererande mikroelektrod görs i lösning, vanligtvis nära ytan av celler eller vävnader, vilket gör att icke-invasiv mätning av extracellulära jonflöden. Denna metod tillåter inte mätning av jonflöden inuti vävnader, mellan cell och intercellulära utrymmet. Den jonselektiva självrefererande mikroelektrod är inte den enda metoden som medger mätning av jonflöden in vivo. Ett alternativt ny metod använder fluorescerande bioelektricitet reportrar 41, som möjliggör mätning av jonflöden som inte är möjligt med mikroelektroder. Dessa färgämnen tillåter mätningar av joner flöden inuti vävnader och celler och kan uppnå subcellulär lokalisering. Denna teknik kan få geografisk information av jonflödet inuti vävnader och celler, men inte jon exväxla mellan vävnaden och den extracellulära utrymmet. Dessutom fluorescerande bioelektricitet reportrar brukar generera halv kvantitativa data. Användningen av mikrobaserad teknik för att mäta jonflöden är fortfarande giltigt och nödvändig och ger ytterligare information till användningen av fluorescerande bioelektricitet reportrar, vilket gör dem kompletterande snarare än konkurrerande tekniker. Dessutom intressanta senaste utvecklingen innefattar amperometriska självrefererande detektorer av syre, kväveoxid och signalsubstanserna dopamin och glutamat 42,43. Amperometrisk avkänning är baserad på en kemisk reaktion vid sensorspetsen. Nya fiberoptiska mikroelektroder ("optrodes") har utvecklats för att mäta icke-invasivt metaboliska syreflödet 34,35 och pH 44 med hög selektivitet och känslighet 45,46. Det finns nu också en enzymbaserad nanopartikelbelagda sond känslig för glukos 47.
Vi har sett att the jonselektiv självrefererande mikro möjliggör mätningar av extracellulära jonflöden in vivo. Joner är inte bara utbyts mellan celler / vävnader och extracellulära utrymmet, men också mellan celler och vävnader i levande organismer. Det är viktigt att kombinera denna teknik med andra såsom fluorescerande bioelektricitet reportrar i syfte att uppskatta den rumsliga upplösningen av jonflöden inne vävnader utöver de faktiska mätningar av jonflöden nära dess yta. Dessutom jonflöden utgör en viktig del av den bioelektriska tillståndet som definierar celler och vävnader tillsammans med cellmembranpotential, trans-epitel potential eller extracellulära elektriska strömmar. Det är viktigt, förutom mätning av jonflöden, att mäta, i kombination, cellmembranet och trans-epitel potential samt extracellulära elektriska strömmar 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M.
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D.
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C.
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
