Method Article

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender In-situ- Hybridization

DOI:

10.3791/52799

⸱

June 17th, 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNAs werden häufig Wirbel Axonen lokalisiert und ihre lokalen Übersetzung für Axon Wegfindung oder Verzweigung während der Entwicklung und für die Wartung, Reparatur oder Neurodegeneration in postdevelopmental Zeiten erforderlich. Hochdurchsatz-Analysen haben kürzlich ergeben, dass Axone haben ein dynamischer und komplexer Transkriptom als bisher erwartet. Diese Analyse jedoch wurde meist in kultivierten Neuronen, wo Axone aus den somato-dendritischen Fächern isoliert werden getan. Es ist praktisch unmöglich, eine solche Isolation in ganze Gewebe in vivo zu erreichen. So um die Rekrutierung von mRNAs und ihre funktionelle Relevanz in einem ganzen Tier überprüfen, Transkriptom Analysen sollten im Idealfall mit Techniken, die die Visualisierung von mRNAs in situ ermöglichen kombiniert werden. In jüngster Zeit neuartige ISH Technologien, die RNAs in einer Einzelmolekülebene zu erfassen, wurden entwickelt. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse der subzellulären Lokalisierung von mRNADa lokalisierten RNAs werden in der Regel in geringen Mengen gefunden. Hier beschreiben wir zwei Protokolle zur Detektion axonally lokalisierte mRNAs unter Verwendung eines neuen hochempfindlichen RNA ISH Technologie. Wir haben RNAscope ISH mit axonalen Gegenfärbung in Kombination mit Fluoreszenz Immunhistochemie oder histologische Farbstoffe, um die Rekrutierung von ATF4 mRNA um Axone in vivo in der reifen Maus und menschliche Gehirne zu überprüfen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Axonalen mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung ermöglichen Axone auf extrazelluläre Reize in einem zeitlich und räumlich akuten Weise 1 reagieren. Intra-axonale Proteinsynthese wird am besten im Zusammenhang mit der Entwicklung des Nervensystems, wo sie eine entscheidende Rolle bei Wachstumskegel Verhalten 2-8 spielt verstanden Axon Pathfinding 9-11 und retrograde Signalisierungs 12,13. Aber weit weniger ist über die funktionelle Bedeutung der axonalen Proteinsynthese in post-Entwicklungs Neuronen bekannt sind, wenn axonalen mRNA und Ribosom Niveaus stark verringert 14,15. Mature Wirbel Axone haben lange geglaubt, translational inaktiv 16 zu sein. Die jüngsten Studien zeigen, dass lokale Übersetzung wird in reifen Axone unter pathologischen Bedingungen reaktiviert. Zum Beispiel wird eine Untergruppe von mRNAs zu regenerierenden Axonen nach einer Nervenverletzung und intra axonalen Proteinsynthese ist für die korrekte Regeneration dieser Axone 17 erforderlich rekrutiert. Darüber hinaus unsere Gruppe has gezeigt, dass bestimmte mRNAs sind Axone rekrutiert, nachdem lokale Engagement in der Alzheimer-Krankheit Aß-Peptid 1-42, und lokale Übersetzung des Transkriptionsfaktors ATF4 ist verpflichtet, die neurodegenerative Effekte von Aß 1-42 von Axonen zu der neuronalen Soma 18 propagieren. Schließlich Hochdurchsatz-Analysen haben ergeben, dass reife Axone haben ein komplexer und dynamischer als erwartet Transkriptom 18-21, vor allem unter pathologischen Bedingungen. Im Lichte dieser Untersuchungen wurde ein hochempfindliche und spezifische Methode zum Nachweis axonally lokalisierte mRNAs im adulten Nervensystem erforderlich ist.

Ein Großteil der Arbeit an mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung in reifen Axone wurde an kultivierten Neuronen durchgeführt. Dies gilt vor allem für die Transkriptom-Analysen, da spezialisierte Kultivierungsverfahren bestehen, dass die Isolierung der Axone von der somato-dendritischen Raum 18-20 ermöglichen. Obwohl solche Studien haben wertvolle Ins gegebenight in die Rolle des lokalen Übersetzung in reifen Axone, die Frage, ob kultivierten Neuronen glaubwürdig die Situation in vivo oder mRNA Rekrutierung ist eine adaptive Reaktion von Axonen zu Kultivierungsbedingungen ist noch offen. Nur wenige Studien haben Hinweise auf mRNA Anwerbung für den Axonen in vivo fällig gestellt. Zum Beispiel hat das Transkript der olfaktorischen Markerprotein in Axonen bei erwachsenen sensorischen Neuronen 22 erfasst wurde. Ein Transgen, das die 3'-UTR von β-Actin mRNA Axonen in den peripheren und zentralen Nervensystems Neuronen in Mäusen transportiert und vor Ort nach dem Entwicklungsperioden 23 übersetzt. Lamin B2 mRNA an retinalen Axonen lokalisiert in Xenopues laevis Kaulquappen und seine Erschöpfung wirkt Axon Wartung nach axonalen Entwicklung 21. Störung des axonalen Transport der mRNA-Codierung für Cytochrom C Oxidase IV verändert Mausverhalten 24. Schließlich wird ATF4 mRNA in ein erwachsener gefundenXON-Fluß von Mäusen und menschlichen Gehirnen im Rahmen von Aß 1-42 induzierte Neurodegeneration 18.

Hochdurchsatz-Transkriptom Analysen haben sich als nützlich zu sein, um mRNA-Profilen in isolierten Axone in vitro zu identifizieren, sondern haben ihre Grenzen für die in-vivo-Studien, da im ganzen Gewebe Axone sind nie isoliert gefunden, aber mit neuronalen Zellkörpern, Gliazellen und anderen Zelltypen vermischt. Folglich müssen derartige Analysen mit bildgebenden Verfahren, die die subzelluläre Lokalisation von mRNAs bestätigen kombiniert werden. RNA in situ-Hybridisierung (RNA-ISH) erlaubt die Detektion und Darstellung von spezifischen RNA-Sequenzen, die in Zellen und Geweben. Jedoch waren ursprünglichen RNA ISH Assays nur für die Identifizierung von zahlreicheren RNAs 25, was selten der Fall axonally lokalisierten mRNAs geeignet. In den letzten Jahrzehnten zunehmenden Bemühungen in die Entwicklung neuer Technologien, die den Nachweis der mRNAs ermöglichen an der Einzelmolekülebene gesetzt 25,26. Zum Beispiel haben Singer und Kollegen ISH Sonden entwickelt, um mRNAs in Einzelzellen zu erfassen, die aus in 5 nicht überlappenden Fluoreszenz-markierten 50-mers (Details siehe 27). Der Hauptunterschied zwischen den oben genannten Techniken und das hier beschrieben wird, ist, daß die später verwendet 20 Doppel Z-Struktur (nicht linear) Sonden, die typischerweise Ziel ~ 1 kb Region der RNA von Interesse sicherzustellen Spezifität und geringem Hintergrundniveaus. Sonden werden dann mit Vorverstärker und Verstärker-Sequenzen, die schließlich fluoreszenzmarkierte oder mit Enzymen, die chromogene Reaktionen ermöglichen konjugiert hybridisiert. Diese Amplifikationsschritte Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu anderen Technologien ISH 28. Hier beschreiben wir zwei Protokolle mit RNAscope kombiniert entweder mit Fluoreszenz Immunzytochemie oder histologische Farbstoffe ermöglicht axonalen Gegenfärbung. Beide Protokolle sind geeignet zur axonalen Lokalisierung ATF4 mRNA in der Erwachsenen mo visualisierenverwenden und das menschliche Gehirn.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle tierischen Verfahren wurden durch die IACUC der Columbia University und der geltenden Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt wurden befolgt. Hinweis: Bereiten Sie alle für die ISH Verfahren in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser verwendeten Puffer. Diese Empfehlung ist nicht unbedingt notwendig, nachdem ISH abgeschlossen ist, aber es wird vorgeschlagen, dass Puffer noch in autoklaviertem bidestilliertem Wasser hergestellt und / oder durch Filtern sterilisiert.

1. Nachweis der ATF4 mRNA lokalisiert Cholinerge Axone im Gehirn erwachsener Mäuse mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) durch Immunhistochemie Gefolgt

  1. Probenvorbereitung für die Para fixierten gefrorenen Hirnschnitten
    1. Für das folgende Beispiel, bereiten Scheiben von festen gefrorenen Gehirn der Maus.
      1. Kurz gesagt, zu opfern, 9 Monate alten Mäusen durch Anästhesie mit Ketamin (100 mg kg -1 Körpergewicht) und Xylazin (10 mg kg -1 Körper weigHT) von transkardialer Infusion von 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) folgte.
      2. Gehirne und post-fix in 4% Paraformaldehyd zu entfernen für 24 Stunden bei 4 o C
      3. Nach der Fixierung, Waschen Proben dreimal in PBS und in 30% cryoprotect Saccharose in PBS (pH 7,4) für 24 Stunden bei 4 ° C.
      4. Betten Sie Gehirne in OCT Einfrieren Verbindung, seriell Schnitt bei 20 & mgr; m auf einem Kryostaten und montieren auf Poly-D-Lysin behandelten Objektträgern. Halten Hirnschnitten bei -20 o C bis zur Verwendung.
    2. Entfernen Parafesthirnschnitten aus dem Gefrierschrank und der Luft trocknen für 30 min bei RT.
    3. Dreimal mit 1x PBS waschen.
    4. In einer Abzugshaube, Re-fix Hirnschnitten 20 min mit 4% Paraformaldehyd bei RT.
      HINWEIS: ACHTUNG: 4% Paraformaldehyd ist giftig und muss behandelt und entsorgt werden entsprechend folgenden Sicherheitsprotokolle.
    5. Dreimal mit 1x PBS waschen.
    6. Entwässern Hirnschnitten.
      1. Vorbereitung 50%, 75% und 100%Ethanollösungen.
      2. Einzutauchen Folien in 50% Ethanol für 5 Minuten bei RT.
      3. Einzutauchen Folien in 75% Ethanol für 5 Minuten bei RT.
      4. Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT.
      5. Einzutauchen Folien in frischem 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT. Hinweis: Alternativ können Folien in 100% Ethanol bei -20 ° C bis zu 1 Monat gelagert werden.
  2. FISH-Test, gefolgt von Immunhistochemie unter Verwendung von Hitze-induzierte Antigen / RNA Demaskierung
    1. Vor dem Start bereiten alle erforderlichen Material:
      1. Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und legen Sie eine Schale mit destilliertem Wasser in den Ofen, um eine feuchte Umgebung schaffen.
      2. Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen.
      3. Sonden (sowohl negative als auch Zielsonden) Entfernen von Kühlschrank und erwärmen diese im Hybridisierungsofen für 10 min. Lassen Sie die Proben abkühlen down bei RT.
      4. Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-4 (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) bei RT.
      5. Bereiten Antigen-Retrieval-Lösung: 10 mM Natriumcitrat (pH 6), 0,05% Tween 20 Hinweis: Lösung kann bei RT auf unbestimmte Zeit gespeichert und für zukünftige Färbung verwendet werden.
      6. Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser.
        HINWEIS: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden. 50x Waschpuffer könnte auszufällen. Wenn ja, Wärme 50x Waschpuffer bei 40 ° C für 10 Minuten vor der Herstellung der Lösung, 1x.
    2. Folien aus 100% Ethanol und Luft trocknen entfernen 5 min bei RT.
    3. Bereiten Sie eine Coplin-Gefäß mit 50 ml Antigen-Retrieval-Lösung. Tauchen Sie Folien in Antigen-Retrieval-Lösung und kochen Sie sie für 10 Minuten in einem Mikrowellenofen.
      HINWEIS: Alternativ Ort horizontal gleitet in einer 100 mmDurchmesser runde Glasschale, die 100 ml Retrieval-Lösung.
      1. Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit destilliertem Wasser und legen Sie sie in der Mikrowelle.
        HINWEIS: Das Wasser wird "Puffer" die Hitze bei der Durchführung Entlarvung.
      2. Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in der Mikrowelle. Boil gleitet bei hoher Leistung für 5 Minuten. Unmittelbar nach Proben gestoppt Kochen, gleitet Wärme wieder bei hoher Leistung für zusätzliche 5 min.
      3. Cool down Folien bei RT.
        HINWEIS: kritischer Schritt: siedendem Dauer und Verfahren ist vom Anwender festgelegt werden, abhängig von den Mikrowelleneigenschaften. Je schneller das Kochen beginnt desto höher die Chancen der Lösung Verdunstung. In diesem Fall empfiehlt es sich, dass die Proben für kürzere Zeiträume mehr als zweimal, um eine Gesamt Demaskierung von 10 min abgeschlossen gekocht. Im Gegenteil, wenn der Heizbetrieb mit mittlerer oder niedriger Leistung durchgeführt wird, Demaskierung kann einmal für 10 min durchgeführt werden. Allerdings, wenn Proben nicht kochen continuously für eine Gesamtmenge von etwa 10 min wird diese in Teil Demaskierung sowohl der Ziel-RNA und Protein führen zu detektieren.
    4. Wash gleitet dreimal mit 1x PBS.
    5. In 2 - 3 Tropfen (~ 100 & mgr; l) des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt. Hinweis: Das dapB Sondensatz richtet sich an ein bakterielles Gen und sollte keine Säugetier-RNA zu erkennen.
    6. Fügen Sie 2-3 Tropfen der Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt. Hinweis: ein Sondensatz Targeting-Reste 20 - 1381 der Maus ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet.
    7. Deckgläser mit Parafilm zu Sonde Verdunstung zu vermeiden, legen Sie sie in der befeuchteten Objektträger Box in der Hybridisierungsofen inkubieren sie bei 40 ° C für 2 Stunden.
      HINWEIS: Optional: zusätzliche Hirnschnitten mit einem Sondensatz Targeting Maus Polr2A hybridisiert und als positive Kontrollen verwendet werden.
    8. Wash slides zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    9. Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 1-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen.
    10. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    11. Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 2-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen.
    12. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    13. Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 3-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen.
    14. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    15. Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 4-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in dieDia-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen.
    16. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und zweimal mit 1 × PBS.
    17. Hinzuzufügen 100-200 ul (oder genügend Volumen, um vollständig zu bedecken Slices) einer Blockierlösung, die 3 mg / ml BSA, 100 mM Glycin und 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) auf die Objektträger, bedecken sie mit Parafilm und Inkubation für 30 min bei RT.
    18. In 100 bis 200 & mgr; l Anti-ChAT-Antikörper in Blockierungslösung (1/100) auf die Objektträger verdünnt, decken Sie sie mit Parafilm und Inkubation für 2 Tage bei 4 o C Stellen Sie sicher, dass Hirnschnitten nicht austrocknen. Falls erforderlich, erneut bewerben anti-ChAT-Antikörperlösung zu Hirnschnitten von 24 Stunden nach der Inkubation.
    19. Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT.
    20. In 100 bis 200 & mgr; l der geeigneten Alexa-konjugierten Sekundärantikörper (. ZB Alexa-594 Esel anti-Ziege für dieses spezielle Beispiel) auf die Objektträger, Deckel mit Parafilm und Incubaß für 1 h bei RT.
    21. Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT.
    22. Wash gleitet einmal mit destilliertem Wasser.
    23. Berg Träger mit DAPI haltigen Eindeckmedium.
    24. Visualisieren Hirnschnitten unter dem Fluoreszenzmikroskop.

2. Nachweis von ATF4 mRNA lokalisiert, um Axone in Human Brain Proben unter Verwendung chromogener in situ Hybridisierung (CISH) von Luxol Fast Blue und Kresylviolett Gegenfärbung Gefolgt

  1. Probenvorbereitung für die Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettete menschliche Gehirnproben
    1. Bake Scheiben in einem Trockenofen bei 60 ° C für 1 Stunde.
    2. Entparaffinieren Hirnschnitten in einem Abzug.
      HINWEIS: ACHTUNG: Reagenzien sind giftig und müssen behandelt werden und verworfen folgenden die entsprechenden Sicherheitsrichtlinien
      1. Tauchen Sie Folien in Xylol alternativen Clearingstelle, zweimal für 10 min.
      2. Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol zweimal für 1 min.
      3. EINir-trockenen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ können Proben bei Raumtemperatur getrocknet werden, O / N, sondern muss innerhalb von 24 Stunden verwendet werden.
  2. Diaminobenzidin (DAB) -basierte chromogenen ISH Assay gefolgt von Luxol schnell blau und Kresylviolett Fleck mit wärmeinduzierten und Protease-induzierte RNA Demaskierung
    1. Vor Beginn der Vorbereitung benötigte Materialien:
      1. Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und setzen Sie ein Fach destilliertes Wasser, das um eine feuchte Umgebung schaffen.
      2. Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen.
      3. Bereiten 1x vorbehandeln 2 durch Verdünnen der 10x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser. Wenn Vorbehandlung auf einer heißen Platte durchgeführt wird, werden 100 ml Vorbehandlung Lösung zu einem Durchmesser von 100 mm Glasschale, um die Kontaktfläche zwischen der Schüssel und der heißen Platte zu erhöhen (falls Vorbehandlungin der Mikrowelle durchgeführt wird, kann ein Coplin-Gefäß statt dessen verwendet werden, wie in 1.2.3 angegeben). Wärme Lösung auf 100 o C und halten Sie sie koch nicht länger als 30 Minuten vor dem Untertauchen Proben.
      4. Wärme negativen und positiven Proben 10 min bei 40 ° C und Abkühlen auf RT.
      5. Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-6 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) bei RT.
      6. Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in destilliertem Wasser. Hinweis: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden.
    2. In ~ 4 Tropfen (~ 120 & mgr; l) von 1 vorbehandeln zu jeder Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
    3. 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser waschen.
    4. Führen wärmeinduzierten Demaskierung:
      1. Objektträger, um heiße vorbehandeln 2 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) Lösung und kochen für 15 Minuten. Hinweis: Boiling können auf einer heißen Platte Gewährleistung durchgeführt werdenkontinuierliche Kochen oder in der Mikrowelle folgenden kritischen Schritte in 1.2.3 angegeben).
    5. Dias zu destilliertem Wasser sofort übertragen und waschen 3 bis 5 mal.
    6. Wasch gleitet 3 bis 5 mal mit frischem 100% Ethanol.
    7. Luft trocknen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ Scheiben getrocknet werden O / N.
    8. Führen Sie Protease-induzierte Demaskierung:
      1. 4 Tropfen vorbehandeln 3 (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), Deckel mit Parafilm und Inkubation 30 min bei 40 o C im Hybridisierungsofen.
    9. Wash gleitet 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser.
    10. 4 Tropfen des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt.
    11. 4 Tropfen des Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt.
      Hinweis: eine Sondensatz Targeting-Reste 15 - 1256 des menschlichen ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet. OPTIONAL: zusätzliche Hirnschnitten können hyb seinmit einer Sonde, Satz gegen Menschen PPIB ridized und als positive Kontrollen verwendet.
    12. Die Objektträger in der Folie Box und Inkubation für 2 Stunden. bei 40 o C im Hybridisierungsofen.
    13. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    14. 4 Tropfen AMP 1 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen.
    15. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    16. 4 Tropfen AMP 2 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen.
    17. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    18. 4 Tropfen AMP 3 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen.
    19. Wash gleitet zweimal mit 1x warH-Puffer für 2 min bei RT.
    20. 4 Tropfen AMP 4 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen.
    21. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    22. 4 Tropfen AMP 5 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 30 min bei RT.
    23. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    24. 4 Tropfen AMP 6-Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 15 min bei RT.
    25. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    26. Mix gleichen Volumen BROWN BROWN-1 und-2-Reagenzien (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), fügen ~ 120 & mgr; l-Lösung in jede Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation 10 min bei RT.
    27. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und einmal in destilliertem Wasser spülen.
      HINWEIS: kritische Schritte: die folgenden Schritte sind entscheidend für dieeine optimale axonalen Gegenfärbung zu erhalten, ohne Maskierung der Anwesenheit von RNA-Granulat.
    28. Vor der Durchführung Gegenfärbung das Vorhandensein von mRNA von Interesse unter einem Hellfeldmikroskop überprüfen. Bestimmung von Referenzflächen in den Gehirnproben, in denen das Vorhandensein von puncta gesamten Kontrastfärbungsverfahren zu überwachen.
    29. Vorheizen Luxol schnelle Blau-Lösung bei 60 o C.
    30. Die Objektträger in Luxol schnell blau und Inkubation 30 min bei 60 o C.
    31. Spülen Sie mehrmals in destilliertem Wasser.
    32. Dip Slides mehrfach in 0,05% Lithiumcarbonat-Lösung, um die Differenzierung zu starten.
    33. Dip Slides zweimal in frischem 75% Ethanol.
    34. Spülen in destilliertem Wasser.
    35. Überprüfen Hirnschnitten unter einem Hellfeldmikroskop. Beachten Sie, dass grauer und weißer Substanz beginnen sollte, zu unterscheiden und RNA-Granulat noch als dunkelblau / schwarz puncta sichtbar sein. Überprüfen Sie, dass Axone beginnen, wie hellblau Fasern erscheinen.
    36. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.28 bis 2.2.32. Perform Inkubationen mit Luxol Fast Blue-Lösung in 10 bis 20 min Schritten sorgfältige Überwachung der Gegenfärbung und die Anwesenheit von RNA Granulate. Hinweis: In der Regel wird eine optimale Gegenfärbung in 60 erworben - 90 min (Gesamt Inkubationszeit), aber die Zeit kann verkürzt werden, wenn der Verdacht besteht, dass RNA-Granulat kann durch die Luxol schnell Bläue (siehe Abbildung 2 für Beispiele) maskiert werden kann.
    37. Folien Kresylviolett Lösung inkubieren für 10 min bei RT.
    38. Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser.
    39. Dip Schlitten 5 bis 10 mal in 70% Ethanol.
    40. Entwässern Hirnschnitten bis 3 schnelle Änderungen von 100% Ethanol.
    41. In einer Abzugshaube, klar Hirnschnitten durch Inkubation zweimal in Xylol alternative Clearingstelle für 2 min und ein drittes Mal für 5 Minuten bei RT.
    42. Berg Hirnschnitten in Xylol-basierte permanentes Fixiermittel.
    43. Analysieren Sie die Proben unter einem Hellfeldmikroskop.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine kurze Zusammenfassung der oben beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

Optimale Erkennung von ATF4 mRNA Granulat in cholinergischen Axonen mit wärmeinduzierten Demaskierung

Bei der Beurteilung axonale Lokalisation mRNAs ist es kritisch, in der Lage, die Axone zu identifizieren und um niedrige reichlich RNAs zu visualisieren. Die hier beschriebene RNA ISH Technologie ermöglicht die Erkennung von RNAs in einer Einzelmo...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung eines hochauflösenden ISH Technologie bei der Erkennung von axonally lokalisiert ATF4 mRNA. Diese und frühere veröffentlichte Studien zeigen, dass diese Technik mit Antikörper-basierte Proteinnachweis in Geweben oder sogar ganzen Embryonen 33 kompatibel. Wichtiger ist, es wurde kürzlich zur Detektion von mRNA im Arc Dendriten der hippocampalen Neuronen 34 eingesetzt. Es kann auch mit histologischen Farbstoffe zur Gewebefärbung kombi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Alzheimer's Association (NIRG-10-171721; an U.H.), dem National Institute of Mental Health (MH096702; an U.H.), dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; an C.M.T.) und Pilotstudienpreisen des vom National Institute on Aging finanzierten Alzheimer's Disease Research Center an der Columbia University (AG008702; an J.B. und Y.Y.J.), das auch die New York Brain Bank unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Labors Hengst für die Kommentare und Diskussionen

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
benutzerdefinierte Sonde für die Reste 20-1.381 der Maus-mRNA Atf4 (NM_009716)Advanced CellDiagnostics-Sonde
für die Reste 15-1.256 der menschlichen ATF4 mRNA (NM_001675.2)Advanced Cell Diagnostics-
Negativkontrollsonde - DapBAdvanced Cell Diagnostics310043Sonde
Positivkontrollsonde und Maus Polr2A (optional)Advanced Cell Diagnostics312471Sonde
Positivkontrollsonde für humanes PPIB (optional)Advanced Cell Diagnostics313901Sonde
RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Reagenzkit (für Fluoreszenzdetektion)Advanced Cell Diagnostics320850in situHybridisierungskit
RNAscope 2.0 HD Reagenzien-Kit - BRAUN (für den chromogenen Nachweis)Advanced Cell Diagnostics310035in situ Hybridisierungskit
Ziegen-Polyklonaler Anti-ChAT-AntikörperMilliporeAB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain KitAmerican MasterTechKTLFB
Clearify-Clearingmittel (Xylol-Ersatz)American MasterTechCACLEGAL
ProLong Gold Eindeckmedium mit DAPILife TechnologiesP36935
DPX EindeckmediumSigma6522

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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