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Maus-Modell der Alloimmune-induzierte Gefäßabstoßung und Transplantat-Arteriosklerose

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DOI:

10.3791/52800

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17. Mai 2015

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Aorteninterpositionstransplantation bei Mäusen. Ziel des Protokolls ist es, ein Modell zur Verfügung zu stellen, mit dem pathologische Prozesse und therapeutische Strategien, die für alloimmune Reaktionen in den Arterien relevant sind, und die daraus resultierenden arteriellen Veränderungen, die zum Versagen von Organtransplantaten beitragen, untersucht werden können.

Zusammenfassung

Vaskuläre Abstoßung, die zu Transplantatarteriosklerose (TA) führt, ist die führende Darstellung für chronisches Herztransplantationsversagen. Bei der TA verursacht das Immunsystem des Empfängers eine Schädigung der Arterienwand und eine Funktionsstörung der Endothelzellen und der glatten Muskelzellen. Dies löst eine pathologische Reparaturreaktion aus, die durch eine Intimalverdickung und einen luminalen Verschluss gekennzeichnet ist. Das Verständnis der Mechanismen, durch die das Immunsystem die Abstoßung von Gefäßen und TA verursacht, kann die Entwicklung neuartiger Wege zur Behandlung von Transplantatversagen unterstützen. Hier beschreiben wir ein Maus-Aorten-Interpositionsmodell, mit dem die pathogenen Mechanismen von vaskulärer Abstoßung und TA untersucht werden können. Das Modell beinhaltet die Transplantation eines Aortensegments von einem Spendertier in einen allogenen Empfänger. Die Abstoßung des Arterienabschnitts geht mit alloimmunen Reaktionen einher und führt zu arteriellen Veränderungen, die einer Gefäßabstoßung ähneln. Der grundlegende technische Ansatz, den wir beschreiben, kann mit verschiedenen Mausstämmen und gezielten Interventionen verwendet werden, um spezifische Fragen im Zusammenhang mit vaskulärer Abstoßung und TA zu beantworten.

Einleitung

In den vergangenen mehr als 30 Jahren haben Fortschritte in der Immunsuppressiva Transplantatabstoßung aufgrund von akuten Abstoßung verringert, sondern chronische Abstoßung bleibt eine zentrale Herausforderung. Die wichtigste Manifestation der chronischen Herztransplantatabstoßung ist Transplantat-Arteriosklerose (TA) 1,2. Dieser Zustand wird durch Intimahyperplasie und vasomotorische Dysfunktion Allotransplantat Arterien charakterisiert und entwickelt sich als Folge der immunologischen Targeting von Endothelzellen und glatte Muskelzellen des Empfängers Immunsystems. Die spezifische Ausrichtung des Transplantats Gefäßsystem durch Anerkennung ausländischer Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ist durch die Entwicklung der TA ausschließlich im Transplantat Arterien hervorgehoben unter Schonung Wirtsgefäßen 3. In diesem Sinne ist die Beobachtung, dass TA nicht experimentell auftreten, wenn der Empfänger genetisch identisch zu dem Spender oder wenn der Empfänger-T-Zellen und B-4 fehlt. Immunvermittelten Gefäßverletzung und dysfunction bewirkt, dass die Entwicklung der Intimaverdickung und Fibrose sowie die aberrant Akkumulation von Lipiden und ECM-Proteine, TA 5. Intimaverdickung neigt während der gesamten arteriellen Baum 4-6 konzentrisch zu sein. Graft Verlust und Tod treten in der Regel als Folge der fortschreitenden Ischämie von Lumen Verschluss der Arterien Allograft 4 resultieren.

Im Jahr 1991 Mennander et al. 7 Pionier eine Aorten Zwischenmodell bei Ratten zu Modell TA. Mehrere Gruppen haben anschließend diese Prozedur für den Einsatz in Mäusen angepasst. In diesem Modell entwickeln Allograft Aortasegmente Läsionen, die Funktionen vergleichbar mit TA in klinischen Transplantationen beobachtet haben. Dies schließt Intimaverdickung die durch die Ansammlung von glatten muskelähnlichen Zellen und Leukozyten Empfänger 7. In den letzten 2 Jahren ist dieses Modell verwendet worden, um wichtige Einblicke in die Mechanismen der Gefäßverletzung, Ablehnung und TA zu erzeugen. Es kann unsed, Fragen an Immun- und Kreislauf-Reaktionen während arterielle Pathologie untersuchen. Die Wahl des Antigens Einstimmung beeinflusst die Fähigkeit, diese Fragen angemessen anzugehen.

Transplantation über komplette MHC Barrieren ermöglicht eine umfassende Bewertung der Immunreaktionen, die bekanntermaßen in Organtransplantatabstoßung beteiligt sein. Dies beinhaltet direkte CD4- und CD8-T-Zell-Erkennung und Ausrichtung der Fremdpeptid-MHC durch Pfropf-abgeleiteten Zellen präsentiert, indirekte CD4 (und möglicherweise CD8) T-Zell-Erkennung und Ausrichtung der Transplantat-Empfänger von abgeleiteten Alloantigene Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, und Antikörper- vermittelte Erkennung Alloantigene auf Gefäßzelloberflächen 8. Jedoch kann die vaskuläre Reaktion auf eine Verletzung im vollständigen MHC-fehlangepaßt Experimenten anders als die klinisch beobachtet wird. Johnson et al. 9 zeigt, daß in Zwischenaortatransplantate in einem vollständigen MHC Mismatch Barriere transplantiert meistendie neointimale Zellen des Empfängers Herkunft und nicht die von Spenderursprung. Dies ist anders als in den Menschen transplantiert wird, wo die meisten der intimalen glatten Muskelzellen von Spenderursprung 9,10 beobachtet. Um diese Einschränkung zu berücksichtigen, haben alternative Versuchsmodellen, die über kleinere Histokompatibilitätsantigen Mismatches Pfropfen beinhalten entwickelt, die Gefäßreaktionen, die mehr ähneln denen in der klinischen Transplantation 11 beobachtet auslösen. Während diese alternative Modelle erlauben wichtige Rückschlüsse auf den Gefäßreaktionen, die die Entwicklung der TA, die immunologischen Prozesse, die vaskuläre Abstoßung in kleinere Histokompatibilitätsantigen mismatched Transplantate verursachen nicht komplett neu kapitulieren solche, die in der klinischen Einstellung auftreten fahren hergestellt werden. Zum Beispiel sind Nebenhistokompatibilitätsantigene schlecht von Transplantat reaktive Antikörper 12 erkannt. Angesichts der vorstehenden Erwägungen ist es wichtig, die pathologische questi betrachtenon untersucht bei der Auswahl der Art des Antigens Fehlanpassung in einem aortischen Zwischenmodell verwendet. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Maus-Aortazwischen Pfropfen. Wir beschreiben Zwischen Pfropfung zwischen vollständigen MHC-fehlgepa Mäusen, aber das gleiche Protokoll wird für die Transplantation in andere Antigen mismatched Mausstämme verwendet.

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Protokoll

Alle Protokolle in dieser Studie wurden überprüft und von der Simon Fraser University Tierpflege Ethik-Kommission genehmigt. Verwenden Balb / CYJ (H2 d) Spendermäusen und C57BL / 6 (H2 b) Empfängermäuse zu allogenen Reaktionen zu untersuchen. Mäuse werden für Experimente im Alter von 8 bis 12 Wochen zwischen verwendet. Verwenden Sie entweder weiblichen oder männlichen Mäusen. Syngenen Kontrollen bestehen aus Aortasegmente von C57BL / 6-Geber in C57BL / 6-Empfänger.

1. Spender und Empfänger Vorbereitung

Anmerkung: Sowohl der Spender und Empfänger anästhesiert und vor der Operation bereit, Ischämie des Transplantats zu minimieren. Injizierbare Anästhetika sind in dem Protokoll zur Behinderung der tierischen Nebenanlagen für die Lieferung von inhalativen Anästhetika erforderlich zu verhindern. Wenn gewünscht, ist aber inhalierten Narkose eine geeignete Alternative. Von der anfänglichen Injektion von Anästhetika, wird der gesamte Prozess in etwa 90 min in Anspruch. Ischämische Zeit des Transplantats weniger Than 30 min.

  1. Betäuben die Maus mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) und Xylazin (10 mg / kg; 1 mg / ml). Die Maus wird innerhalb von 10 bis 15 min sediert werden. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Einklemmen des Fett Teil des Tieres Fuß-Pad. Verwalten 1/3 der ursprünglichen Dosis des Anästhetikums Cocktail, nach Bedarf, bis das Tier nicht Rückzug Reflex aufweisen. Überwachen Sie die Atemfrequenz eng nach jedem Cocktail verabreicht wird. Während der Operation beurteilen das Niveau der Anästhesie alle 15 min durch Einklemmen des vorderen Bauchwand mit einer Pinzette. Die Mäuse sollten tief für 60 bis 90 min narkotisiert bleiben.
  2. Augen der Maus die Schmieren mit einer Augensalbe zur Trockene, während der Narkose zu verhindern.
  3. Rasieren Haare so nah an der Haut wie möglich auf die Bauch ventralen Region aus der Mitte des Brustkorbs bis zum Schambein. Seien Sie besonders vorsichtig, nicht nick jede Haut. Verwenden Sie keine Enthaarungscreme, weil es i absorbiert werdenNTO die Haut und kann entzündliche sein.
  4. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Handtuch über der Heizung Tisch oder Unterlage.
  5. Reinigen Sie die Operationsstelle mit einer vorläufigen Peeling mit 2% Chlorhexidin. Bereiten Sie einen großen Arbeitsbereich, um das Operationsfeld zu maximieren. Beginnen Schrubben in der Mitte der Operationsstelle und Bewegung nach außen in einer linearen oder zirkulären Art und Weise. Entsorgen Sie die Gaze. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens 5 weitere Male. Tragen Sie eine Alkohol prep Pad auf den gleichen Bereich. Sobald der Alkohol trocken ist, bereiten den sauberen Bereich mit Betadine-Lösung und drapieren mit steriler Gaze.

2. End-to-End-Anastomose Ordnung

  1. Donor Betrieb
    1. Pflegen aseptische Technik während des gesamten Betriebs. Reinigen Sie alle Arbeitsplatte und OP-Tisch Oberflächen mit 0,5% beschleunigt Wasserstoffperoxidlösung vor der Verwendung. Wickeln und Autoklaven alle chirurgische Instrumente, Gazen, Vorhänge und Kleider vor der Verwendung. Stellen Sie sicher, die Sterilität der Instrumente mit einer DampfSterilisator Indikatorstreifen in jeder Packung platziert. Sterile OP-Handschuhe werden verwendet und der zwischen Operationen angeordnet ist. Für mehrere Operationen, sterilisieren die chirurgischen Instrumente zwischen den Anwendungen mit der heißen Glasperlen Sterilisator.
    2. Legen Sie die Spendermaus in Rückenlage auf eine saubere, dünne Plexiglasplatte mit sterilen Tuch unter dem Operationsmikroskop bei 8-30X Vergrößerung gewickelt.
    3. Nachdem eine angemessene chirurgische Anästhesie, wie in Abschnitt 1.1 dargelegt, gehen Sie mit der Operation.
    4. Mit Hilfe einer sterilen Schere, stellen eine einzige Mittellinie untere Längsbauchschnitt, vom Schambein bis zum Schwertfortsatz.
    5. Mit einem kleinen Retraktors, öffnen Sie die Bauchwand in den Hohlraum zu entlarven.
    6. Mit sterilen Wattestäbchen Applikatoren, sanft zurückziehen den Darm souverän an die Tier links und Abdeckung mit Gaze mit Kochsalzlösung angefeuchtet haben. Bewegen Sie die Fortpflanzungsorgane inferior und suchen Sie den infrarenalen Aorta und der unteren Hohlvene (IVC). Moiszehn des freigelegten Gewebes periodisch mit Kochsalzlösung.
    7. Verwendung der medizinischen No. 5 Zange, trenne die Aorta vom IVC, der Pegel des linken Nierenarterie zur Bifurkation. Verwenden 10-0 Polyamid Monofilamentnahtmaterialien die kleine Äste in der Nähe von der Aorta zu ligieren.
    8. Sobald der Geber Aorta aus der IVC getrennt worden ist, zu sättigen, das Gefäß mit Kochsalzlösung, decken Sie die freiliegenden Hohlraum mit feuchten Gaze und legen Sie den Spender zur Seite auf einen sterilen Bereich. Überprüfen Sie den Status des Spenders (Atemwegs- und Herz-Kreislauf-Funktion, und die Tiefe der Anästhesie) alle 15 min. Beginnen, die auf den Empfänger, Isolierung der Aorta wie unten (Schritte 2.2.1 bis 2.2.7) beschrieben.
    9. Sobald der Empfänger Aorta aus der IVC getrennt worden und zur Seite stellen, geben Sie den Geber unter dem Mikroskop. Kreuzklemme (proximal und distal zu dem Segment von Interesse) der Spender Aorta ungefähr 5 mm voneinander entfernt sind, mit zwei 4 mm mikrovaskulärer Klemmen.
    10. Mit den Vannas-Tübinger Mikroschere,transect einen kleinen Implantatsegment (3 bis 4 mm in der Länge) der Bauchaorta.
    11. Unter Verwendung einer 25 G 5/8 Nadel an einer Spritze befestigt ist, spülen Sie die ausgeschnitten Aorta mit Heparin (100 U / ml) Kochsalzlösung. Sicherstellen, dass die Spitze der Nadel nicht in Kontakt mit dem Schiff kommen.
    12. Platz Aorta in heparinisierten (100 U / ml) Kochsalzlösung auf Eis und beiseite stellen. Noch unter tiefer Narkose, lassen Sie die mikrovaskuläre Schellen. Euthanize den Spender durch Ausbluten.
    13. Implantieren das abgebende Schiff innerhalb von 30 Minuten der Exzision. Obwohl es möglich ist, eine Spenderbehälter für mehrere Empfänger durch Herausschneiden einer größeren Länge der Aorta zu verwenden, halten Sie die ischämischen Zeit auf weniger als 30 min.
  2. Empfänger Betrieb
    1. Pflegen aseptische Technik während des Betriebs, wie in den Geberbetrieb.
    2. Platzieren Sie den Empfänger der Maus in Rückenlage auf einer dünnen Plexiglasplatte mit sterilen Tuch unter dem Operationsmikroskop bei 8-30X Vergrößerung gewickelt.
    3. After eine angemessene Betäubung, gehen Sie mit der Operation, wenn das Tier nicht Rückzug Reflex aufweisen.
    4. Mit Hilfe einer sterilen Schere, stellen eine einzige Mittellinie untere Längsbauchschnitt, vom Schambein bis zum Schwertfortsatz.
    5. Mit einem kleinen Retraktors, öffnen Sie die Bauchwand in den Hohlraum zu entlarven.
    6. Mit sterilen Wattestäbchen Applikatoren, sanft zurückziehen den Darm souverän an die Tier links und Abdeckung mit Gaze mit Kochsalzlösung angefeuchtet haben. Bewegen Sie die Fortpflanzungsorgane inferior und suchen Sie den infrarenalen Aorta und die IVC. Befeuchten Sie die freiliegenden Gewebe periodisch mit Kochsalzlösung.
    7. Trenne die Aorta vom IVC, von der Ebene der linken Nierenarterie zur Bifurkation. Falls erforderlich, verwenden 10-0 Polyamid Monofilamentnahtmaterialien die kleine Äste in der Nähe von der Aorta zu ligieren.
    8. Kreuzklemme (proximal und distal zu dem Segment von Interesse) die Aorta ungefähr 5 mm voneinander entfernt, mit zwei 4 mm mikrovaskulärer Klemmen.
    9. Verwendung der Vannas-Tübingen Mikroscheren, stellen eine einzelne horizontale Aortotomie und resezieren ein kleines Segment (nicht mehr als 0,5 mm) aus der Bauchaorta, den Spender Aortentransplantat aufzunehmen.
    10. Spülen Sie die ausgeschnitten Aorta mit heparinisierter (100 U / ml) Kochsalzlösung. Der Spender Aortentransplantat sollte von geeigneter Länge zu durchtrennten Enden der Aorta des Empfängers zu verbinden.
    11. Setzen Sie den Spender Aortentransplantat im orthotopen Position und anastomosieren Transplantat Ende des Spenders auf der Empfängerseite, passend zu den jeweiligen Transplantat anatomischen Orientierung mit dem des Empfängers an.
    12. Fassen Sie die Tunica externa des Schiffes und umzustülpen es leicht mit den medizinischen No.5 Pinzette. Mit den Zangen, fahren die Nadel an der 10-0 Polyamid-Monofilament Faden durch die gesamte Dicke der Gefäßwand befestigt, um die Spender Aortentransplantat reseziert Gefäß des Empfängers zu sichern. Achten Sie darauf, dass die Gefäßöffnung nicht ausgeschaltet aufgrund t geschlosseno unbeabsichtigte Nähte der Rückwand des Behälters.
    13. Für kontinuierliche Maschen, legen Nähte bei 9 Uhr in der oberen und unteren Enden des Transplantats. Beginnend am oberen Ende des Transplantats ab 3 Uhr, anastomosieren die reseziert Enden mit 2 Lauf Nähte und sichern Sie die Naht auf die Naht Aufenthalt.
      1. Flip das Transplantat über und setzen Sie die fortlaufende Naht, einen Teil des Schiffes dorsal, welche den Ursprung Aufenthalt Naht. Befestigen, ohne großen Druck auf das Gefäß. Wiederholen Sie das Nähen für den unteren Anastomose.
        Anmerkung: Die Einzelnähten beginnen auf die gleiche Weise wie die fortlaufende Naht, mit der Ausnahme, dass der Behälter mit drei getrennten Stichen zwischen den Haltefäden anastomosiert. Anastomose Zeit beträgt gewöhnlich 20 min.
    14. Sobald die Anastomose abgeschlossen ist, lassen Sie die mikrovaskuläre distale Klemme, damit retrograden Blut zu fließen und überprüfen Sie die Leckage der Anastomose Webseiten. Wenn es eine Leckage immediately legen einen Stich, um den defekten Stelle zu schließen. Wenn es keine Blutungen an den Standorten, lassen Sie die proximale Klemme.
    15. Untersuchen Sie die Transplantation und überprüfen, dass es keine Blut Hindernis in dem Transplantat und der proximalen und distalen Teil des Schiffes des Empfängers. Kräftigem Impulsmuster sowohl des Spenders und des Empfängers Gefäß ist eine primäre Anzeige, daß das Blut frei fließt. Unter Verwendung der Pinzette vorsichtig greifen ein Ende der Haltefäden und leicht umzustülpen, das Schiff an der Rückwand des Schiffes zu prüfen.
      Anmerkung: Es sollte kein Kräuseln der Gefäßwand an den beiden Enden der anastomosiert Seiten besteht. Schlechte Durchblutung nach dem Entfernen der Klemmen ist ein Zeichen der Thrombose.
    16. Verwendung Wattestäbchen Applikatoren, zurück in den Darm in die Bauchhöhle.
    17. Mit dem Nadelhalter Castroviejo und Graefe Pinzette, schließen Sie die Bauchdecke mit 5-0 Polypropylen Nähte mit Seriennähen. Schließen Sie die Hautschicht mit dem gleichenNähte mit subkutikuläre Verschluss.
    18. Verabreichen Torbugesic (1 mg / kg) im unmittelbar nach Beendigung der Transplantation.
    19. Geben sofort, in der Reihenfolge, Atipamezol (1 mg / kg), Ketoprofen (5 mg / kg) und erwärmte Ringer-Lactat-Lösung subkutan.
    20. Unmittelbar nach der Operation, legen Mäuse in einem beheizten Käfig unter einem Wasser Decke über Nacht (12 h). Während der Narkose-Erholungsphase, legen die Tiere allein in einem sauberen, trockenen unverbauten Gegend. Linie den Käfig (autoklaviert) mit sauberen Papiertüchern und stellen Sie die Temperatur des Wassers, Decke, um etwa 20 bis 22 ° C. Bieten Trocken- und Nass kibbles ad libitum auf dem Käfigboden.
      Wichtig: eine wichtige Komponente von postoperativen Betreuung ist die Beobachtung des Tieres und ein entsprechender Eingriff, wenn erforderlich, während der Erholung von der Anästhesie und Chirurgie. Die notwendige Intensität der Überwachung wird mit dem Tier unterscheiden und konnten während der sofortigen Betäubung Erholungsphase als Co größer seinmpared später in postoperative Erholung.
    21. Kontinuierlich Tiere unterzogene Narkose überwacht, bis sie wieder ganz gesund zu überwachen. Das Tier muss in der Lage, ohne fremde Hilfe Brustlage zu halten, und es muss ruhig und schmerzfrei erscheinen, bevor sie unbeaufsichtigt gelassen werden.
    22. Geben Buprenorphin (0,1 mg / kg BID) und Ketoprofen (5 mg / kg SID) für einen Zeitraum von drei Tagen, sowohl subkutan.
    23. Überwachen kardiovaskulären und respiratorischen Funktion, Körpertemperatur, und postoperative Schmerzen oder Beschwerden während der Erholung von der Anästhesie für ein Minimum von drei Tagen. Zusätzliche Sorgfalt erforderlich sein kann, wie beispielsweise Analgetika und anderen Drogen, und parenterale Fluide zu Dehydratation und Elektrolytverlust zu minimieren.
    24. Beurteilen Sie den Erfolg der Transplantationschirurgie durch die Beobachtung der motorischen Funktion der hinteren Gliedmaßen. Voller Erfolg der Transplantation beinhaltet ungehinderten Blutfluss in den hinteren Gliedmaßen und Schwanz, der sofort bei der Wiederherstellung des anim sein sollteal und vollständige Erholung ohne Lähmung der hinteren Gliedmaßen am zweiten Tag

3. Gewebeentnahme

Anmerkung: Vorbestimmte Endpunkte in Abhängigkeit von der Art der gewünschten Analyse und der Natur des Antigens Fehlanpassungsbereich von 3 bis 60 Tagen. Im Allgemeinen ist Intimaverdickung nach der Transplantation über komplette MHC mismatched Mausstämme robust am Tag 30.

  1. Betäuben die Maus mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) und Xylazin (10 mg / kg; 1 mg / ml). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Einklemmen des Fett Teil des Tieres Fuß-Pad. Fahren Sie mit der Operation, wenn das Tier nicht Rückzug Reflex aufweisen.
  2. Reinigen Sie die Operationsstelle mit Wasser und endend mit 70% Alkohol.
  3. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Tablett mit absorbierenden Kissen ausgekleidet.
  4. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem großen Mittellinie Längsschnitt. Legen Sie ein Selbsthalter, um den Hohlraum freizulegen, die IVC eind der Bauchaorta.
  5. Trennen sanft das transplantierte Spender Aortensegment vom benachbarten IVC Verwendung eines Paars von medizinischen No. 5 Pinzette. Seien Sie besonders vorsichtig, nicht zu der Adventitia des transplantierten Gefäß abstreifen.
  6. Setzen die Brusthöhle durch Schneiden durch die Rippen auf beiden Seiten der Brustwirbelsäule ganzen Weg zu der Brusteinlass. Spiegeln die vorderen Brustwand superior, den Herzbeutel freizulegen und sichern Sie den Brustkorb mit einem Paar von Gefäßklemme.
  7. Sobald das Herz ausgesetzt ist, legen Sie eine 25 G 5/8 Nadel (an einer Spritze angebracht ist) in den linken Ventrikel und bündig mit 0,1 ml heparinisiertes (100 U / ml) Kochsalzlösung.
  8. Verwenden Sie eine Schere, entfernen Sie den rechten Vorhof, damit das Blut, heparinisierter Kochsalzlösung, und Fixiermittel, um den Körper während der Perfusion zu verlassen. Perfundieren das Tier mit 5 ml 4% Paraformaldehyd oder bis die Flüssigkeit klar ist. Entfernen Sie die Herzen der Euthanasie zu gewährleisten.
  9. Excise transplantiert Gefäßsegment und tauchen in 4% paraFormaldehyd nicht mehr als eine Stunde. Stellen Sie die transplantierte Gefäß in OCT (optimale Schnitttemperatur) Matrix und Flash-Freeze. Abschnitt der Behälter unter einem Kryostaten bei 8 um Dicke eingestellt. Stain Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin und / oder Verhoeff-van Gieson (van Gieson) elastische Fleck.

4. Morphologische Analyse von Grafts

Anmerkung: TA durch Intimaverdickung 13 gekennzeichnet. In diesem Modell Intimaverdickung und eine resultierende Verringerung der Größe des Lumens reflektierend sind für die Schwere der immunvermittelten Gefäßverletzung. Syngraft Kontrollen werden verwendet, um die Baseline-Charakteristika der Schiffe in der Abwesenheit von allogenen Immunantworten zu bestimmen. Diese Steuerungen ermöglichen auch Auswertung Arterienschädigung, die als Ergebnis des chirurgischen Eingriffs auftritt. Es sollte keine intimale Verdickung in syngrafts sein.

  1. Um Intimaverdickung und luminale Okklusion prüfen, messen Sie den Bereich innerhalb der EndothelzellenSchicht, innere elastische Lamina (IEL) und auf elastischen van Gieson gefärbt Arterien-Segmente mit einer Bildanalysesoftware externe elastische Lamina (EEL). Die folgenden Parameter können verwendet werden, um den arteriellen Veränderungen widerspiegeln TA zu bestimmen.
    1. Messen Sie die absolute Intima-Bereich: Bereich innerhalb der innere elastische Lamina - Bereich innerhalb der endothelialen Zellschicht. Dies stellt eine absolute Messung der Intima-Expansion, die das Markenzeichen der TA ist.
    2. Messen Sie die absolute medialen Bereich: Bereich innerhalb des externen elastischen Lamina - Bereich innerhalb der innere elastische Lamina. Dies liefert eine absolute Messung der medialen Zersetzung oder das Wachstum, die gelegentlich als Folge immunvermittelte Änderungen in diesem Bereich der Gefäßwand auftreten.
    3. Messen die gesamte Gefäßfläche als der Bereich innerhalb der äußeren elastischen Lamina. Dies stellt eine Messung des Gefäßumbau die Expansion oder Verengung der Arterie infolge der immunologische Schäden beinhaltet.
    4. Maßnahmedie Intima / Media-: (Gebiet innerhalb der Lamina elastica interna - Bereich innerhalb der endothelialen Zellschicht) / (Fläche innerhalb der externen elastischen Lamina - Bereich innerhalb der inneren elastischen Lamina). Dies liefert ein relatives Maß der intimalen Expansion und normalisiert auf Unterschiede in Gefäßgröße.
    5. Messung der% Lumeneinengung: [(Fläche innerhalb der Lamina elastica interna - Bereich innerhalb der endothelialen Zellschicht) / Fläche der internen elastischen Lamina)] * 100. Dies liefert ein Maß für das Ausmaß der luminalen Okklusion, die aus einer Kombination der intimalen Expansion und Umbau (innen oder außen) der Gefäßwand führt.

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Ergebnisse

In diesem Modell wird die Bauchaorta, die von einer Balb / CYJ Maus in der infrarenalen Aorta einer C57BL / 6-Empfänger angeordnet ist. Dies ermöglicht eine umfassende Bewertung der Alloimmune Reaktionen, Transplantat Arterien Ziel. Immunvermittelte Gefäßverletzung in diesem Modell initiiert Gefäß reparative Antworten, die in Verdickung der Intima, Lumeneinengung und die Rekrutierung von Immunzellen gipfeln (Abbildungen 1 und 2). Diese Kriterien dann als Auslese für die Schwere der Allo...

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Diskussion

Wir haben ein Protokoll für Aorten Zwischen Pfropfung bei Mäusen, die zur Untersuchung von immunvermittelten Gefäßabstoßung und TA beschrieben. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Ursachen der TA als auch die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu untersuchen. Es hat in der Vergangenheit verwendet, um eine wesentliche Rolle der adaptiven Immunität, zytotoxische T-Zellreaktionen, Zytokin-vermittelte CD4 T-Zell-Effektor-Reaktionen und Antikörper-vermittelte Transplantatschäden TA 14,17-21 herzu...

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Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem kanadischen Institutes of Health Research und Herz-und Schlaganfall-Stiftung von BC & Yukon (JCC) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL/6J (H-2b)Jackson Laboratories, Bar Harbour MEStamm# 000664
Balb/cBYJJackson Laboratories, Bar Harbour MEStamm# 001026
Ketaminhydrochlorid Injektion USP 100 mg/mlKetaleanDIN 00612316
Xylazin Injektion 20 mg/mlRompumDIN 02169592
Ketoprofen Injektion 100 mg/mlAnafenDIN 01938126
Butorphanol Tartrat  Injektion 10 mg/mlTorbugesicDIN 008450000
Buprenorphin Injektion 0,3 mg/mlReckitt BenckiserB.N. 5241
Atipamezolhydrochlorid sterile injizierbare LösungAntisedanDIN 02237744
Heparin-Natrium-Injektion, USP, 1.000 Einheiten/mlMcKesson VerteilungDIN 02264315
Tränen natürliche AugensalbeAlconDIN 02082519
StereomikroskopLeicaM80
0,9% Natriumchlorid, sterilBaxter Corporation
Lactated Ringer' s Lösung, sterilBaxter Corporation
0,9% Natriumchlorid Injektion, steril, 10 mlBaxter Corporation
Alkohol VorbereitungspadsLoris
Povidon JodBetadin
Chlorhexidin Gluconat 4% w/vGermi-Stat
Schwarz Polyamid MonofilamentAROSurgisch InstrumenteT4A10Q07
Nahtmaterial, 10-0 Nahtmaterial, 70 MikronCorporation
Blue Monofilament Naht 5-0, P3 NadelEthicon8698G
1 ml SpritzeBDREF 309659
10 ml SpritzeBDREF 309604
1cc TB Insulinspritze mit 28 G 1/2BDREF 309309
25 G 7/8, InjektionsnadelBDREF 305124
27 G 1/2, InjektionsnadelBDREF 305109
Colibri Retractor- 1,5 cm Spreizung 4 cmFine Science Tools17000-04
S& T CAF-4 Clip-Greifzange, ohne SchlossFine Science Tools00072-14
Supergrip-Pinzette, S& TFine Science Tools00632-11
Medical Nr.5 PinzetteFine Science Tools11253-20
Lexer BabyschereFine Science Tools14078-10
Micro Adson-Pinzette gezahntFine Science Tools11018-12
Vannas-Tübingen MikroschereFine Science Tools15003-08
Mikroklemmen, b-1; 3,5 mm x 1 mm; 7mm LängeFine Science Tools00396-01
Graefe-Pinzette, 10cm 1x2 ZähneFine Science Tools11054-10
Castroviejo mit Schloss und WolframbackenFine Science Tools12565-14
HeißglasperlensterilisatorInotech 250IS-250 - Steri-250
VliesgazeProgene
Cotton Tiped ApplikatorenPuritan
BartschneiderWahl
HeizkissenSunbeam

Referenzen

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