Abstract
Ziekte van Alzheimer is een neurodegeneratieve ziekte die vergrijzing. Een belangrijk neuropathologische kenmerken van de ziekte is de overproductie van amyloïd-beta en de afzetting van amyloid-beta plaques in de hersenen van getroffen individuen. Door de jaren heen hebben wetenschappers gegenereerd talrijke ziekte van Alzheimer muismodellen die proberen om de amyloid-beta pathologie repliceren. Helaas, de muismodellen slechts selectief de ziekte kenmerken na te bootsen. Neuronale dood, een prominent effect in de hersenen van patiënten met de ziekte van Alzheimer, merkbaar ontbreekt in deze muizen. Vormen van amyloïd-bèta die bewezen zeer toxisch voor neuronen zijn - - Daarom hebben wij en anderen een werkwijze voor infusie direct oplosbare oligomere species van amyloïd-beta toegepast stereotaxically in de hersenen. In dit rapport gebruiken we mannelijke C57BL / 6J muizen om deze chirurgische techniek van het verhogen van amyloid-beta niveaus in een select regio hersenen documenteren. Deinfusie doel de dentate gyrus van de hippocampus omdat hersenenstructuur, samen met de basale voorhersenen dat via het cholinerge circuit, is een van de gebieden van degeneratie bij de ziekte. De resultaten verheffen amyloïd-beta in de dentate gyrus via stereotactische infusie openbaren toename neuron verlies in de dentate gyrus binnen 1 week, terwijl er een bijkomende toename in celdood en cholinerg neuron verlies in het verticale been van de diagonale band van Broca van de basale voorhersenen. Deze effecten zijn waargenomen tot 2 weken. Onze gegevens suggereren dat de huidige amyloid-beta infusie model een alternatief muizenmodel voor regiospecifieke neuron death op korte termijn te pakken. Het voordeel van dit model is dat amyloid-beta kan worden verhoogd in een ruimtelijke en temporale manier.
Introduction
Amyloid plaque afzettingen, die bestaan uit amyloid-beta (Aß 1-42), is een belangrijk kenmerk van de pathologie van de ziekte van Alzheimer (AD). Talrijke studies hebben aangetoond dat hoge giftigheidsniveaus van recombinant oligomeer Aß 1-42 opwekken neuronale dood, synaptische dystrofie, verlies en disfunctie; evenals leren en geheugen tekorten 1-4. Brain getroffen regio's zijn de hippocampus, de cortex en subcorticale structuren zoals de basale voorhersenen en de amygdala 5,6. Tot op heden zijn er meerdere transgene muismodellen die proberen te simuleren de Aß 1-42 pathologie van AD. Afhankelijk van het soort dieren die nuttig blijken bij het onderzoek select pathologische kenmerken van AD zijn. Helaas, met uitzondering van 2 transgene lijnen APP23 en 5XFAD deze muizen niet volledige replicatie neuronaal verlies, een sleutelaspect van AD. Zelfs met de neuronaal verlies waargenomen in APP23 en 5XFAD, de neuronale dood opmerved was subtiele, leeftijd afhankelijk, en geïsoleerde om een paar selecte regio's 7,8.
De directe infusie van oligomere Aß 1-42 in de wild-type muizenhersenen een uitstekend in vivo model dat de neuronale dood aspect van amyloidopathy 1,9,10 repliceert. In tegenstelling tot de vaak gebruikte transgene muismodellen de oligomere Aß 1-42 infuus model is ideaal voor acuut verheffen Aß 1-42 niveaus in een ruimtelijke en temporele manier. Het voordeel van wild-type muizen van dit model ondervangt potentiaalvereffening of bijwerkingen van de mutaties geïntroduceerd in transgene muizenlijnen. Past studies hebben aangetoond dat infusie toxische niveaus van Aß 1-42 in de hippocampus lokt neuron sterfte in de nabijheid van de injectieplaats binnen 1 week 1. Bovendien, in overeenstemming met de waarneming dat Aß 1-42 toxisch is voor cholinergische neuronen van de basale voorhersenen 11cholinergisch neuron (BFCN) populatie die uitsteekt naar de hippocampus verminderd 20-50% binnen 7-14 dagen na beta-amyloïde infusie 1,10 bij muizen, effectief waardoor de onderzoeken van geïsoleerde neuronale circuits in de hersenen. Aangezien BFCN project ipsilateraal aan de dentate gyrus van de hippocampus 12, grotendeels control / medium en oligomere Aß 1-42 oplossingen geïnjecteerd worden aan weerszijden van de hersenen toelaat vergelijkingen te maken tussen de linker en rechter hemisferen 1.
In dit rapport zullen we een gedetailleerde chirurgische en injectie methodologie voor volwassen wild-type C57BL / 6J muizen bieden. Deze muizenstam is gekozen vanwege zijn brede gebruik in onderzoek. Technisch gezien kan elk hersengebied worden gericht voor infusie, maar hier zullen we de dentate gyrus van de hippocampus als de doelstelling om de techniek te illustreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Voor alle dierproeven, institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd.
1. Bereid chirurgische instrumenten en oplossingen voor Heelkunde
- Autoclaaf volledig roestvrij staal chirurgische instrumenten.
- Bereid 70% ethanol door verdunning 200 bewijs absolute ethanol met steriel moleculair-biologische kwaliteit gedeïoniseerd gedestilleerd water.
- Bevestig de 29 G-naald om de Hamilton spuit. Reinig de binnenkant van Hamilton spuit en de naald door het opstellen en uitwerpen nanozuiver water herhaaldelijk gedurende 1 min. Herhaal deze procedure met 70% ethanol.
- Verwijder de zuiger en naald uit de Hamilton spuit. Air droog de onderdelen in een laminaire stroming kap O / N.
- Bestralen van de naald en spuit met ultraviolet licht gedurende 30 minuten voor gebruik.
- Bereid zoutoplossing door oplossen NaCl in moleculaire kwaliteit water tot een uiteindelijk gewicht volumeconcentratie van 0,9%. OntsmettenZé de oplossing door filtering door 0,2 um porie filter.
2. Bereid Oligomere Aß 1-42
- Monomerize en resuspendeer recombinant humaan Aß 1-42 in DMSO tot 5 mM precies zoals beschreven in de publicatie van Fa en andere 13.
- Verdun 5 mM Aß 1-42 met steriel (1x) PBS tot 100 uM op de dag voor de operatie.
- Meng de oplossing goed door trituratie.
- Incubeer Aß 1-42 oplossing gedurende 12 uur bij 4 ° C.
Noot: Controle oplossingen zoals verdunning DMSO in PBS of scrambled / achteruit Aß 1-42-peptide moet net als Aß 1-42 worden bereid.
3. Bepaal Injectie Coördinaten
- Gebruik de volwassen muis hersenen atlas om de exacte anterior-posterior (AP), mediaal-laterale (ML) te bepalen, en de dorsale-ventrale (DV) coördinaten voor de hersenen regio van belang 14.
Neete: Om de techniek die we pakte de dentate gyrus van de hippocampus als het doel met de volgende coördinaten van de bregma illustreren: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2.2 mm. Het minteken vóór de AP waarde geeft aan dat het 2,00 mm posterior van de bregma. De ± teken voorafgaand aan de ML-waarde geeft links en rechts de richting van het centrum. Ten slotte minteken vóór de DV aangeeft dat het ventraal beweegt vanaf het oppervlak van de hersenen.
4. Stereotaxische Frame Setup
- Draag een chirurgisch gezichtsmasker, schone laboratoriumjas en steriele chirurgische handschoenen.
- Veeg stereotaxische instrument en muis adapter met 70% ethanol.
- Leg steriele chirurgische laken op de teller.
- Plaats de stereotaxische instrument met de muis adapter op de top van de steriele chirurgische laken.
- Veeg de muis verwarming pad met 70% ethanol. Plaats de verwarming pad over het stereotaxisch kader bed. Gebruik voor algemene doeleinden laboratory etikettering tape op tape onderaan de verwarming pad over de muis adapter bed.
- Bevestig de verwarming pad naar het warme water Recirculator pomp volgens aanwijzingen van de fabrikant.
- Zet de warm water Recirculator pomp en de temperatuur tot 37 ° C, en dan wachten tot het temperatuur bereikt.
- Bevestig de 50 ul Hamilton spuit met een 29 G naald op de stereotaxische frame vast te schroeven op de gemotoriseerde verticale injecteren as volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
- Zet de kraal sterilisator en wachten tot het vooraf ingestelde temperatuur van de fabrikant bereikt.
Let op: Dit wordt gebruikt voor het steriliseren van RVS instrumenten tussen dieren. Het duurt instrumenten 20 seconden contact met de korrels voor sterilisatie. - Zet op hete plaat en zet deze op 42 ° C en plaats een schone lege kooi bovenop.
- Terwijl de Hamilton spuit wordt vastgesteld op de stereotaxische kader Gebruik de gemotoriseerde stereotaxisch injector het opstellen van de Aß 1-42 oplossing.
Opmerking: Trek meer dan 4 pl van de oplossing in de spuit en gebruik vervolgens de stereotaxisch injector om het injecteren volume in te stellen. Bedien de injector volgens de instructies van de fabrikant.
5. Bereiding van dieren
- Bepaal het gewicht van de muis met behulp van de weegschaal.
- Verdoven muizen met ketamine / xylazine cocktail aan 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine door injectie intraperitoneaal (IP). Bewaken van de diepte van de anesthesie door het verlies van teen knijpen reflex.
- Nadat de muis is verdoofd neem de tondeuse en scheren zijn kop op de huid over de schedel bloot te leggen.
- Plaats de muis boven het verwarmingselement bovenop het stereotaxische bed.
- Gebruik de spatel om de mond van de snijtanden in de tanden bewaker te openen en te plaatsen. Bevestig het neusstuk over het gezicht van de muis. Klem het voorzichtig naar beneden en niet te strak.
- PosiTion de bilaterale oor dwarsbalken in gehoorgang naar het hoofd te beveiligen. Beweeg elke dwarsbalk in totdat het de schedel raakt, en draai dan de schroef om deze te vergrendelen.
- Om ervoor te zorgen de kop is beveiligd gebruik uw wijsvinger om duw omlaag op het hoofd. Als het hoofd goed is vastgezet zal het niet geven of te verplaatsen wanneer ingedrukt.
- Breng een druppel oogcrème of oogdruppels om de ogen om ze vochtig te houden. Zorg ervoor dat de ogen vochtig gedurende de chirurgische procedure.
- Ontsmet de operatieplaats gebruiken steriele wattenstaafjes met betadine oplossing op de huid op de schedel, gevolgd door 70% ethanol. Voer de afwisselende betadine en 70% ethanol schoonmaak 2 keer.
6. Chirurgie en Infusion
- Gebruik een scalpel om een 2-3 mm incisie in de middellijn van de hoofdhuid te maken, en vervolgens een rechte fijne schaar om de incisie lijn uit te breiden tot 1,0-1,5 cm aan de pijlnaad, bregma en lambda van de schedel, landmark bloots waarbij de stereotaxische coördinaten gebaseerd. Gebruik micro klemmen om de huid uit elkaar houden.
Opmerking: De bregma en lambda posities worden uitgelegd in de hersenen van muizen atlas "The Mouse Brain in Stereotaxische Coördinaten" 14. - Neem een wattenstaafje, laat deze in steriele zoutoplossing, en gebruik deze om de schedel te reinigen. Gebruik vervolgens een schone, droge wattenstaafje om de schedel te drogen.
- Gebruik een steriele fijne punt pen een stip op de bregma markeren. Gebruik de stereotaxische micromanipulator om de Hamilton spuit te positioneren zodat de punt van de naald net raakt de punt op de bregma.
- Noteer de DV coördineren.
- Om te controleren of de AP as van de schedel is niveau bewegen de Hamilton spuit naar achteren, zodat de punt van de naald raakt de lambda punt.
- Noteer de DV positie. Zorg ervoor dat de DV-coördinaten voor bregma en lambda zijn binnen 0,5 mm.
Opmerking: Het doel is het DV verschil tussen bregma en lambda minimaliseren.
- Gebruik zeicromanipulator naar de Hamilton spuit naald terug te keren naar de bregma stip.
- Noteer de start AP positie.
- Bereken de eindigend AP positie door het aftrekken van 2,00 mm van het vertrekpunt AP coördineren.
- Gebruik de micromanipulator aan de Hamilton injectienaald om de definitieve AP herpositioneren coördineren.
- Noteer de huidige ML coördineren.
- Bereken de linker en rechter eindigt ML coördinaten door het toevoegen of aftrekken van 1,3 mm van het vertrekpunt ML coördineren.
- Gebruik de micromanipulator aan de Hamilton naald verplaatsen naar ofwel het beëindigen van ML coördineren.
- Raak de naald naar het oppervlak van de schedel op beide eindigend ML coördinaten en noteer de DV-coördinaten en zorg ervoor dat de waarden binnen 0,5 mm.
Opmerking: Het doel is het DV verschil tussen beide eindigende ML coördinaten minimaliseren. - Terwijl op een einde te coördineren trek de naald omhoog 0.5-1 cm over de schedel. Neem een steriele fijne punt pen een stip op th markerene oppervlak van de schedel. Herhaal deze stap voor de contralaterale kant van de schedel.
- Raak de naald naar het oppervlak van de schedel op beide eindigend ML coördinaten en noteer de DV-coördinaten en zorg ervoor dat de waarden binnen 0,5 mm.
- Swing de Hamilton spuit duidelijk uit de weg.
- Bevestig 0,8 mm boorkop aan de boor. Neem de boor met beide handen, zet ellebogen op het oppervlak van de tafel voor de stabiliteit en de positie van de boorkop iets boven de Sharpie stip op de linker of rechter ML coördineren. Activeer de boor, verlagen de boor tip op de schedel oppervlak om een gat in de schedel te introduceren. Herhaal deze stap voor de contralaterale kant.
Opmerking: Sommige bloeden kan optreden van de onlangs geïntroduceerde gaten. Als er is bloeden gebruik dan een schone, droge wattenstaafje om het bloed te deppen. - Beweeg de Hamilton spuit terug in positie boven een van de onlangs geïntroduceerde ML gaten. Verlaag de Hamilton naald net voorbij de schedel. Op dit punt voorzichtig de hersenen niet te doorboren. Om ervoor te zorgen dat de naald is geslaagd voor de schedel neem uw wijsvinger en duw de naald tegen de schedel te maken sure de naald niet het gat te verlaten.
- Noteer de start DV coördineren.
- Bereken het einde DV coördineren door het aftrekken van 2.2 mm van het vertrekpunt DV coördineren.
- Laat de naald naar het einde DV coördineren.
- Activeer de stereotaxische injectie pomp 4 pl Aß 1-42 te pompen in de dentate gyrus een snelheid van 0,5 ul / min.
- Wanneer de infusie voltooid is laat de naald blijft in de plaats voor een extra 1 min tot terugstromen van de oplossing te minimaliseren uit de injectieplaats.
- Beweeg de naald naar de andere kant van de hersenen en herhaal stappen 6,13-6,18.
7. Animal verwijderen en postoperatieve zorg
- Schroef het oor bars en gezicht / neus bewaker. Verwijder de muis uit het apparaat.
- Gebruik een student standaard patroon tang te trekken sluiten de hoofdhuid en dan sluit de wond met hechtdraad.
- Injecteer 1 ml steriele zoutoplossing in de muis via IP hydratatie.
- Inject buprenorfine (0,1 mg / kg) subcutaan om pijn te verlichten.
- Handhaving van de muis in de schone lege kooi op de top van 42 ° C hete plaat tot het wakker wordt, dan terug in de behuizing kooi met voldoende voedsel en water.
- Dien buprenorfine via subcutane injectie om de 12 uur gedurende 3 dagen voor pijnbestrijding.
8. Suture Removal
- Verdoven muis met ketamine / xylazine cocktail bij 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xlyazine door IP. Opmerking: Dit gebeurt 7-10 dagen na de operatie.
- Gebruik een student standaard patroon tang en rechte fijne schaar om de hechting te verwijderen.
- Injecteer 1 ml steriele zoutoplossing in de muis via IP hydratatie.
- Houd de muis in een schone lege kooi op de top van 42 ° C hete plaat tot het wakker wordt, en dan terug in de behuizing kooi met voldoende voedsel en water.
9. Animal Sacrifice en Tissue Processing
- Verdoven van de muis en perfuse het met 4% paraformaldehyde 15, verwijder de hersenen, en verwerken het voor cryosectioning 16.
Opmerking: De timing van dierenoffer afhankelijk van het experiment. Voor onze studies hebben we gekozen 7 en 14 dagen na de operatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De onderhavige werkwijze voor het bereiden van menselijke recombinant oligomeer Aß 1-42 oplevert oplosbare oligomere vormen bestaande uit monomeren, dimeren, trimeren en tetrameren (figuur 1A). Deze laag molecuulgewicht Aß 1-42 species, maar niet de vezels en plaques, hebben talrijke instellingen aangetoond giftigst neuronen 1,4,9,17-19 zijn. Om te bepalen of oligomere Aß 1-42 induceert neurondood in muizenhersenen Aß 1-42 (4 pi van 100 pM voorraadoplossing) werd toegediend in de DG van de hippocampus in een hemisfeer van 9 maanden oude wild-type C57BL / 6J muizen. Het gewicht van de hippocampus van C57BL / 6J maakt ongeveer 0,018 g en derhalve de afgifte van Aß 1-42 bedroeg ongeveer 100 ug / g. De contralaterale DG van dezelfde muizenhersenen werd geïnfuseerd met een controle / vehiculumoplossing - dat bestond uit gelijke hoeveelheid DMSO gebruikt bij het oplossen Aß 1-42 verdund in (1x) PBS - ter vergelijking. Zoals eerder vermeld vervormd of omgekeerd Aß 1-42 peptide kan worden gebruikt als controle ter vergelijking aangezien we eerder hebben geen effect op hippocampale neuronen 1. Aangezien de introductie van de naald in de hersenen leidt tot lokale weefselbeschadiging (Figuur 1B) en gaat uiteindelijk DG collapse we gekozen om na injectie analyses uitvoeren naast de injectie darmkanaal wanneer het weefsel nog intact. Binnen 1 week Aß 1-42 injectie DG vertoonden verhoogde Aß 1-42 niveaus in de moleculaire laag en de polymorfe cellaag in de nabijheid van de injectieplaats (Figuur 2A). Bij 7 en 14 dagen ontlokte Aß 1-42 verhogingen van TUNEL-positieve kleuring en dalingen in DG dikte bevestiging van de neurodegeneratieve effecten van AB 1-42 (Figuur 2B).
Omdat BF cholinerge neuronen projecteren naar de DGvan de hippocampus we vastgesteld naast als de neuron verlies in de DG triggers BF degeneratie. Voor deze studie een retrograde tracer Fluorogold (2% suspensie) was mede-geïnjecteerd samen met Aß 1-42 in de DG. 7 dagen na de injectie Fluorogold werd gedetecteerd in de BF (figuur 2C) suggereert omgekeerd transport van label via cholinerge neuronen. Daarom, met het oog op kwantificering in de BF kozen we Fluorogold-positieve neuronen, omdat dit aangeeft dat de neuronale terminals werden blootgesteld aan Aß 1-42 in de DG. Zowel 1 en 2 weken na DG Aß 1-42 infusie, de kern van de diagonale band - een subgebied van het BF waar de cholinergische neuronen projecteren DG - ipsilateraal aan de Aß 1-42 -injected ter vertoonden toenames in TUNEL kleuring en afname in cholinerge neuronen (Fig 2D). De waargenomen neuron verlies in het BF bevestigt eerdere studies die de destructieveeffecten van Ap 1-42 de BF-hippocampale pathway 1,10. Het is ook belangrijk op te merken dat het vergelijken van de 2 weken tijdstip tot 1 week tijdstip aan de zijde van de kern van de diagonale band waar de besturing / vehikel oplossing werd geïnjecteerd in de DG onder verdere toename TUNEL kleuring en dalingen in cholinerge neuronen (figuur 2D, tabel). Deze resultaten weerspiegelen significante dalingen in de GCL dikte en stijgingen in TUNEL-positieve etikettering (Figuur 2B, tabel) in de DG van de auto gespoten side vergelijking tussen de 2 na de injectie tijdstippen, hetgeen impliceert dat de fysieke trauma veroorzaakt door de naald bijdraagt aan degeneratie na verloop van tijd. Zelfs met deze ongewenste bijwerking van de naald, het neurodegeneratieve effect van Aß 1-42 nog altijd aanzienlijk groter dan die van de controle / vehikeloplossing (figuur 2D). Bij elkaar genomen, de huidige infusie model effectively reproduceert de toxische effecten van AB 1-42 in de hersenen van muizen binnen 7 dagen na het maken dit een aantrekkelijk model om op korte termijn Aß 1-42 stimulatie bestuderen.
Figuur 1. Oligomere Aß 1-42 preparaat en muizenhersenen injectie darmkanaal visualisatie. (A) 2 uM oligomere Aß 1-42 werd gescheiden op 10-20% tricine gel en overgebracht op nitrocellulose membraan. Het membraan werd geblot met Aß 1-42 antilichaam 6E10 (1: 1000). (B) Aß 1-42 (4 pl van 100 pM oplossing) of control / medium werd toegediend in de linker en rechter DG's van de hippocampus, respectievelijk 9 maanden oude C57BL / 6J-muizen. Muizen werden 7 dagen overleefden. Hersenen werden serieel coupes bij 20 micrometer per sectie. Hippocampus secties werden gekleurd voor DAPI. Hash merken verbeeldeninjectie tract. Pijlen geven ingestort DG. De schaal bar vertegenwoordigt 200 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Oligomere Aß 1-42 induceert neuron sterfte in de DG en BF. Besturing / medium of Aß 1-42 (4 pl van 100 pM oplossing) werd toegediend in de linker en rechter DG's van de hippocampus, respectievelijk 9 maand oude C57BL / 6J muizen. Muizen werden overleefden hetzij 7 of 14 dagen. Hersenen werden serieel coupes bij 20 micrometer per sectie. (A) 7 dagen na de injectie hippocampus secties gekleurd voor Aß 1-42 (NU4 antilichaam, 1: 2.000). ML, moleculaire laag; GCL, ganglion cellaag; PCL, polymorfe cellaag. De schaal bar vertegenwoordigt 50 um. (B (C) van het voertuig of Aß 1-42 co-geïnjecteerd met Fluorogold (2% oplossing). Fluorogold labeling bepaald BF 7 dagen na injectie. Slides met de BF werden willekeurig gekozen. Fluorogold labeling werd gebruikt om het gebied van belang te bepalen. Wanneer het van belang zijnde geïdentificeerd aangrenzende hersencoupes werden gebruikt om kleur wordt markers plaats. De inzetstukken zijn regio's waar beelden in (D) worden gekozen. De schaal bar vertegenwoordigt 200 pm. (D), 7 of 14 dagen na de injectie BF secties gekleurd voor Chat (1: 100, geit polyklonaal) of TUNEL. *** P <0,001 in vergelijking met 1 week. * P <0,05 in vergelijking met vehikel. Kwantificering werd gedaan op de hele regiovan belang. De grens tussen de mediale septum en de diagonale band afgebakend gebaseerd op de locatie van de voorste commissuur. De schaal bar vertegenwoordigt 100 micrometer. (N = 5 muizen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om een succesvolle Aß 1-42 injectie bereiken van de experimentator of chirurg moet: 1) Gebruik aseptische techniek; 2) juist de hersenen regio van belang met nauwkeurige coördinaten vast te stellen; 3) kunnen de muis goed vast te de stereotactische frame hersenen genivelleerd in de AP en ML as; 4) de mogelijkheid om de micromanipulator werken met precisie; 5) zorgen voor een goede post-operatieve zorg. Als deze belangrijke stappen worden gevolgd met de muis moet de operatie zonder waarneembare infectie overleven.
In overeenstemming met in vitro studies, wij en anderen hebben aangetoond dat Aß 1-42 rechtstreeks toegediend in de hippocampus lokt neuron dood 1,4,9,10, beeltenis van een van de belangrijkste kenmerken van AD. De degeneratie is duidelijk zichtbaar in de buurt van de injectieplaats zoals blijkt uit een daling van het volume van de dentate gyrus die samengaat met een verhoging merkers voor degeneratie 1. Voorts tHij cholinerge neuronen die uitsteken in de hippocampus sterven in een retrograde wijze zoals blijkt uit een afname van cholinerge labeling en een toename van TUNEL-positieve kleuring in de BF 1,10. Vandaar dat dit in vivo model dient als een uitstekend model om de semi-acute effecten van AB 1-42 lokaal te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van dit injectiemodel is continu veranderen: elk hersengebied kan worden ingezet, verschillende oudere dieren worden gebruikt. 9 maanden oude mannelijke muizen werden gekozen in onze experimenten omdat we geloven toenemende Aß 1-42 niveaus in oudere muizen beter simuleert de ziekte die voorkomt bij ouderen. Bovendien willen we de experimenten consistente met behulp van muizen van dezelfde leeftijd te houden. Echter, zou muizen van elke leeftijd worden gebruikt voor de injectie. In het verleden hebben we geëxperimenteerd op muizen die 16 maanden oud waren en anderen hebben gebruikt muizen die 2 maanden oud 9,10 waren. Alleen mannelijke muizen worden gebruikt in studies als vrouwelijke muizen vertonen estrogen schommelingen en oestrogeen niveau is bekend dat neuroprotectieve effecten 20 hebben. Hoewel veel onderzoek belangen centrum rond de pathologische effecten van AB 1-42, is er ook aanwijzingen dat lage of fysiologische Aß 1-42 niveaus nodig zijn voor de normale functies voor leren en geheugen 21,22. In deze studies verlaagde onderzoekers de concentratie van Aß 1-42 ingespoten geïnfundeerd deze in de hippocampus 22,23 effectief onthullen een ander voorbeeld van de dynamische aard van het nut van dit paradigma. Andere verbindingen die met succes stereotaxically zijn toegediend omvatten geneesmiddelen, virussen, siRNA, antilichamen en peptiden 1,22-26 diverse effecten, van celdood / overleving diergedrag onderzoeken. Zo zijn er tal van toepassingen voor het gebruik van deze infusie paradigma.
De beschreven infusie methode, terwijl vertonen verschillende mogelijkheden voor in vivo bestudeert met behulp van deze techniek, komt ook met inherente beperkingen. Eerst Dit model tracht alleen de effecten van AB 1-42 reproduceren in een geïsoleerd gebied hersenen. Ten tweede wordt de injectieplaats beschadigd door het inbrengen van een naald in de hersenen. Dit draagt bij aan extra celdood en gliosis. Daarom analyse worden uitgevoerd vanaf de injectie darmkanaal. Met de juiste controle over het voertuig aan de contralaterale zijde van dezelfde hersenen dit geen probleem, omdat de geïnjecteerde voertuig en Aß 1-42 oplossingen uitbreiden tot omliggende weefsel moet worden. Ten derde, omdat BF cholinerge neuronen projecteren naar de hippocampus, de fysieke schade van de hippocampus als duidelijk door de ineenstorting van de DG door de naald (Figuur 1B) kunnen per ongeluk doden sommige BFCNs. Gelukkig is het onderzoeken van de neuronale circuits op de korte termijn - binnen 1 week van een enkel-shot infuus - geen probleem aangezien onze gegevens blijkt dat de toegenomencholinerge dood in de basale voorhersenen is het resultaat van Aß 1-42 en niet van het trauma van de naald; controle injecties zorgen voor de juiste analyse. De gegevens suggereren dat de degeneratie van de DG is ook noodzakelijk voor het verlies van BF cholinerge neuronen deze neuronen verliezen hun synaptische doelen (Figuur 2B). Helaas, voor dieren overleven tot 2 weken het voertuig geïnjecteerd kant toont significante verhoging van BFCN dood over 1 week post-voertuig geïnjecteerde dieren die lijkt te zijn deels te wijten aan de degeneratie en dunner worden van de dentate gyrus als gevolg van de fysieke trauma van de naald. Zelfs in dit stadium gegevens suggereren er aanzienlijk meer dood in de BF ipsilaterale het Aß 1-42 -injected plaats. Ten vierde, het identificeren van subtiele anatomische grenzen kan moeilijk te bereiken zijn. Zo werd de grens tussen de mediale septum en de diagonale band bepaald op basis van de locatie van de voorstecommissure, een techniek die voorheen beschreven 27. Mede vanwege de ipsilaterale BF cholinerge neuronale projectie - vooral van de mediale septum en het verticale been van de diagonale band (MS / DB) - aan de dentate gyrus van de hippocampus 12,28,29 we besloten om een halve bol met Aß injecteren 1-42 en gebruik het andere halfrond controle ter vergelijking. Het is denkbaar dat een zorg voor dit paradigma de correcte identificatie van de grens tussen linker en rechter MS / DB zijn. Terwijl de MS in de middellijn regio DBS zijn laterale. Voor deze huidige werk en onze meest recente publicatie 1 waren we in staat om comfortabel te onderscheiden links en rechts DB. De kwantificering toont ChAT (+) neuronen verminderen met ongeveer 25% in de OB in de Aß 1-42 -injected side. Echter, we hebben geen significante veranderingen in de chat (+) neuronen te detecteren in de MS-1. Door de zijdelingse locatie van de DB en de veranderingen waargenomen voelden we ons gerechtvaardigd om voertuig en Aß 1-42 injecties in dienst binnen hetzelfde dier. Verder testen 2 verschillende experimentele condities in hetzelfde dier maximaliseert niet alleen het gebruik van het dier, maar vermindert ook de potentiële dier per dier variabiliteit. Terwijl onze experimentele opzet stelt ons in staat om links en rechts hersenhelften te vergelijken is het denkbaar deze vergelijking techniek kan niet haalbaar in de toekomst studies, dat wil zeggen, als de mediale septum is de belangrijkste focus van de studie. In dat geval zal elk dier moeten dienen als experimentele conditie. Derhalve wordt de toepassing van de dieren is ter beoordeling van de onderzoekers. Ten vijfde kan de stroominjectie model voor andere uitlezen zoals gedrag? Ons doel in dienst van de huidige Aß 1-42 injectie model was om de neuropathologische gevolgen van Aß 1-42 te evalueren in vivo en vergelijk het met in vitro bevindingen 1 (Figuur 1B en 2B) wanneer we richten de injectienaald in of nabij het DG na 7 dagen de vernietiging van het DG kunnen leiden tot onbedoelde gedragsafwijkingen geven. Dus als een onderzoek vereist onderzoek van het effect van Aß 1-42 op hippocampus-afhankelijke gedrag, dan is de injectie doelwit kan waarschijnlijk worden verplaatst nabij de hippocampus plaats van rechtstreeks erin en laat Aß 1-42 te diffunderen in de hippocampus. Dat gezegd, het gebruik van de stroominjectie paradigma voor gedrag testen is mogelijk, maar vereist meer testening en karakterisatie, en de uiteindelijke experimentele strategie wordt bepaald door de eindgebruiker. Interessant is dat er voorafgaand knaagdieren gedrag studies dat de externe levering van Aß 1-42 betrekken direct in de hersenen zijn. Samen 22,30 genomen, moeten deze beperkingen worden overwogen bij het ontwerpen van in vivo muis studies gebruik van dit model.
Aangezien er geen enkele muis-model in het bestaan vangt de volledige pathologische effecten van AD de stereotaxisch Aß 1-42 infusie techniek biedt onderzoekers met een alternatief in vivo Aß 1-42 muismodel. Wanneer uitgevoerd door een goed opgeleide persoon dit model het meest geschikt voor korte termijn studies gericht op het effect van Aß 1-42 op een bepaald hersengebied of circuits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke verlenen NS081333 (tot CMT), Alzheimer's Association subsidie NIRG-10-171721 en het National Institute of Mental Health subsidie MH096702 (tot UH), en het National Institute on Aging gefinancierde Alzheimer's Disease Research Center aan de Columbia University pilot-subsidie AG008702 (naar YYJ en JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Second edn, Academic Press. (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
