Abstract
Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die Alterung der Bevölkerung. Ein wesentliches Merkmal der neuropathologischen Erkrankungen ist die Überproduktion von Amyloid-beta und die Ablagerung von Amyloid-beta-Plaques in Hirnregionen der betroffenen Individuen. Im Laufe der Jahre haben Wissenschaftler zahlreiche Alzheimer Mausmodelle, die die Amyloid-beta-Pathologie zu replizieren versuchen generiert. Leider sind die Maus-Modellen nur selektiv imitieren die Krankheitsmerkmale. Neuronalen Tod, ein bekannter Effekt im Gehirn von Alzheimer-Patienten wird spürbar fehlt in diesen Mäusen. Formen von Amyloid-beta, die nachweislich die meisten Neuronen toxisch zu sein - - stereotaktisch in das Gehirn Daher haben wir und andere ein Verfahren zum direkten Infusion löslichen oligomeren Spezies von Amyloid-beta beschäftigt. In diesem Bericht verwenden wir männliche C57BL / 6J-Mäusen, diese Operationstechnik zur Erhöhung Amyloid-beta Ebenen in einer ausgewählten Region des Gehirns zu dokumentieren. DieInfusions Ziel dem Gyrus dentatus des Hippocampus, weil diese Gehirnstruktur, zusammen mit dem basalen Vorderhirns, die durch das cholinerge Schaltung verbunden ist, für einen der Bereiche der Degeneration bei der Krankheit. Die Ergebnisse der Hebe Amyloid-beta im Gyrus dentatus über stereotaktischen Infusions offenbaren Steigerungen Verlust von Nervenzellen im Gyrus dentatus innerhalb von 1 Woche, während es einen entsprechenden Anstieg in Zelltod und cholinergen Neuronenverlust in der vertikalen Schenkel des diagonalen Bandes von Broca des basalen Vorderhirns. Diese Effekte werden bis zu 2 Wochen beobachtet. Unsere Daten weisen darauf hin, dass die aktuelle Beta-Amyloid-Infusion Modell bietet eine alternative Maus-Modell zu Region spezifische Neuronen Tod in einem kurzfristig anzugehen. Der Vorteil dieses Modells ist, dass Amyloid-beta in einer räumlichen und zeitlichen Weise erhöht werden.
Introduction
Amyloid Plaque-Ablagerungen, die von Amyloid-beta (1-42 A & bgr;) zusammengesetzt sind, sind ein wesentliches Merkmal der Pathologie der Alzheimer-Krankheit (AD). Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass hohe oder toxischen Mengen von rekombinantem oligomeren Aß 1-42 entlocken neuronalen Tod, synaptic Dystrophie, Verlust und Funktionsstörung; sowie Lern- und Gedächtnisdefizite 1-4. Hirnregionen betroffen sind der Hippocampus, die Rinde, und subkortikalen Strukturen wie dem basalen Vorderhirns und der Amygdala 5,6. Bis heute gibt es mehrere transgene Mausmodelle, die den A & bgr; 1-42 Pathologie von AD zu simulieren versucht. Je nach Belastung diese Tiere als nützlich erweisen bei der Prüfung wählen pathologischen Merkmale von AD zu sein. Leider mit Ausnahme von 2 transgenen Linien, APP23 und 5XFAD, diese Mäuse nie vollständig replizieren Neuronenverlust, ein wichtiger Aspekt der AD. Auch mit dem in APP23 und 5XFAD beobachtet Neuronenverlust, der neuronalen Tod Observed war subtil, altersabhängig und isoliert, um ein paar ausgewählte Regionen 7,8.
Die direkte Infusion von oligomeren Aß 1-42 in den Wildtyp-Maus Gehirn bietet eine hervorragende In-vivo-Modell, das die neuronalen Tod Aspekt amyloidopathy 1,9,10 repliziert. Im Gegensatz zu den üblicherweise verwendeten transgenen Mausmodellen die oligomere Aß 1-42 Infusions Modell ist ideal für akut erheb Aß 1-42 Ebenen in einem räumlichen und zeitlichen Weise. Der Vorteil der Verwendung von Wildtyp-Mäusen für dieses Modell vermeidet Potentialausgleich oder Nebenwirkungen von den in transgenen Mauslinien eingeführten Mutationen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Infusion toxischen Mengen von Aß 1-42 in den Hippocampus auslöst Neuron Tod in der Nähe der Injektionsstelle innerhalb von 1 Woche 1. Darüber hinaus, in Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass A & bgr; 1-42 ist giftig für cholinerge Neuronen des basalen Vorderhirns 11cholinergen Neuron (BFCN) Bevölkerung, die zum Hippocampus projiziert wird 20-50% innerhalb von 7-14 Tagen folgende Beta-Amyloid-Infusion 1,10 in Mäusen verringert, so dass effektiv für die Prüfungen von isolierten neuronalen Schaltkreise im Gehirn. Da BFCN Projekt ipsilateral zu der Gyrus dentatus des Hippocampus 12, zum größten Teil Steuer- / Fahrzeug und oligomeren A & bgr; 1-42-Lösungen können auf jeder Seite des Gehirns erlaubt Vergleiche zwischen den linken und rechten Hemisphären 1 erfolgen injiziert werden.
In diesem Bericht werden wir eine detaillierte chirurgische und Einspritzmethode für Erwachsenen-Wildtyp C57BL / 6J-Mäusen. Dieser Mausstamm ist wegen seiner breiten Einsatz in der Forschung ausgewählt. Technisch gesehen kann jeder Hirnregion Infusionsrichtet sein, aber hier werden wir den Gyrus dentatus des Hippocampus als Ziel verwenden, um die Technik zu veranschaulichen.
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Protocol
Hinweis: Für alle Tierversuche, institutionelle und nationale Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren wurden befolgt.
1. Bereiten Sie Chirurgische Instrumente und Lösungen für die Chirurgie
- Autoklaven alle chirurgischen Instrumenten aus Edelstahl.
- Bereiten Sie 70% Ethanol durch Verdünnen 200 proof absolutes Ethanol mit sterilem molekularen Grad entionisiertem, destilliertem Wasser.
- Bringen Sie die 29 G Nadel auf die Hamilton-Spritze. Das Innere des Hamilton-Spritze und Nadel reinigen durch die Ausarbeitung und Auswerfen nanoreinem Wasser wiederholt für 1 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit 70% Ethanol.
- Entfernen Sie den Kolben und Nadel von der Hamilton-Spritze. Luft trocknen die Teile in einer Steril O / N.
- Bestrahlen die Nadel und Spritze mit UV-Licht für 30 Minuten vor dem Gebrauch.
- Vorbereitung Salzlösung durch Auflösen von NaCl in Wasser UPW auf ein Endgewicht zu-Volumen-Konzentration von 0,9%. Sterilizie die Lösung durch Filtrieren über 0,2 um Porenfilter.
2. Bereiten Sie oligomere Aß 1-42
- Monomerize resuspendieren rekombinante menschliche Aß 1-42 in DMSO bis 5 mM genau wie in der Veröffentlichung der Fa 'und andere, 13 beschrieben.
- Verdünne 5 mM Aß 1-42 mit sterilem (1x) PBS auf 100 & mgr; M am Tag vor der Operation.
- Mischen Sie die Lösung gut durch Verreiben.
- Inkubieren Aß 1-42 Lösung für 12 Stunden bei 4 ° C.
Anmerkung: Die Steuerlösungen wie DMSO verdünnt in PBS oder verschlüsselt / Rückwärts Aß 1-42 Peptids sollte die gleiche Weise wie A & bgr; 1-42, hergestellt werden.
3. Bestimmen Injection Koordinaten
- Mithilfe der erwachsenen Maus-Gehirn-Atlas, den genauen anterior-posterior (AP), medial-lateral (ML) zu bestimmen, und dorsal-ventral (DV) Koordinaten für die Hirnregion von Interesse 14.
Neinte: Um die Technik, die wir mit den folgenden Koordinaten vom Bregma abgeholt Gyrus dentatus des Hippocampus als Ziel zu veranschaulichen: AP, -2.00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2.2 mm. Das negative Vorzeichen vor dem P-Wert zeigt an, dass es 2,00 mm posterior des Bregma. Die ± Zeichen vor der ML Wert zeigt nach links und rechts von der Mitte. Schließlich das negative Vorzeichen vor dem DV zeigt es ventral von der Oberfläche des Gehirns bewegen.
4. stereotaktischen Rahmen-Setup
- Tragen eine Chirurgische Gesichtsmaske, sauberen Kittel und sterile OP-Handschuhe.
- Wischen Sie stereotaktischen Instrument und Maus-Adapter mit 70% Ethanol.
- Lay down sterile Operationstuch auf den Tisch.
- Setzen Sie den stereotaktischen Instrument mit Maus-Anschluß auf der Oberseite des sterilen Operationstuch.
- Wischen Sie die Maus Heizkissen mit 70% Ethanol. Positionieren Sie das Heizkissen auf den stereotaktischen Rahmen Bett. Verwenden Sie für allgemeine Zwecke laboratory Kennzeichnung Band zu Band auf der Heizkissen über die Maus-Anschluß Bett.
- Befestigen Sie das Heizkissen auf den Warmwasserrückführpumpe nach den Anweisungen des Herstellers.
- Schalten Sie den Warmwasserrückführpumpe und die Temperatur auf 37 ° C, und warten Sie, bis es erreicht hat.
- Befestigen Sie das 50 ul Hamilton-Spritze mit einer 29 G-Nadel auf den stereotaktischen Rahmen durch Aufschrauben auf den motorisierten vertikalen Einspritzwelle nach den Anweisungen des Herstellers.
- Schalten Sie die Perle Sterilisator und warten, bis es vom Hersteller voreingestellte Temperatur erreicht.
Hinweis: Dies ist für die Sterilisation Edelstahlinstrumente zwischen Tieren verwendet. Es dauert Einrichtungen 20 sec Berührung mit den Kügelchen für die Sterilisation. - Schalten Sie Kochplatte und setzen Sie ihn auf 42 ° C und legen Sie ein sauberes leeren Käfig oben.
- Während die Hamilton-Spritze ist auf der stereotaktischen Rahmen fixiert verwenden Sie die motorisierte stereotaktischen injector der Erstellung des Aß 1-42-Lösung.
Hinweis: Erstellen Sie mehr als 4 & mgr; l der Lösung in die Spritze und dann mit dem stereotaktischen Injektor, um den Einspritzvolumen eingestellt. Betreiben Sie das Einspritzventil nach den Anweisungen des Herstellers.
5. Vorbereitung der Tiere
- Bestimmen Sie das Gewicht der Maus mit der Waage.
- Betäuben Maus mit Ketamin / Xylazin Cocktail an 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin durch Injektion intraperitoneale (IP). Überwachung der Narkosetiefe durch den Verlust von toe Prise Reflex.
- Nachdem die Maus sediert nehmen Sie die Haarschneidemaschine und den Kopf zu rasieren, um die Haut über den Schädel freizulegen.
- Platzieren Sie die Maus auf dem Heizkissen auf der Oberseite der stereotaktischen Bett.
- Verwenden Sie den Spachtel, um den Mund in den Zähnen Wache öffnen und legen Sie die Schneidezähne. Sichern Sie das Mundstück über das Gesicht der Maus. Klemmen Sie es vorsichtig nach unten, und nicht zu eng.
- Position die bilateralen Ohr Querstangen in Gehörgang, um den Kopf zu sichern. Verschieben Sie jede Querstange, bis sie den Schädel schlägt, und dann drehen Sie die Schraube, bis sie einrastet.
- Um sicherzustellen, dass der Kopf befestigt ist, mit dem Zeigefinger sanft nach unten drücken auf den Kopf. Wenn der Kopf richtig gesichert wird es nicht geben, oder zu verschieben, wenn sie gedrückt.
- Einen Tropfen Augencreme oder Augentropfen für die Augen, um sie feucht zu halten. Stellen Sie sicher, die Augen sind in der gesamten chirurgischen Eingriffs feucht.
- Zur Desinfektion der Operationsstelle zu verwenden sterile Wattestäbchen zu Betadin-Lösung auf die Haut über den Schädel, gefolgt von 70% igem Ethanol gelten. Führen Sie die Wechsel Betadin und 70% Ethanol Reinigung 2 weitere Male.
6. Chirurgie und Infusion
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 2-3 mm Inzision in der Mittellinie der Kopfhaut zu machen, und dann mit einem geraden feinen Schere, um die Schnittführung auf 1,0 bis 1,5 cm zu verlängern, um die Pfeilnaht, Bregma und Lambda des Schädels, Sehenswürdigkeiten aussetzens, die die stereotaktischen Koordinaten basieren. Verwenden Sie Mikroschellen, um die Haut auseinander zu halten.
Hinweis: Die Bregma und Lambda-Positionen sind in den Maus-Gehirn-Atlas "Gehirn der Maus in Stereotaktische Koordinaten" 14 erklärt. - Nehmen Sie ein Wattestäbchen, legen Sie ihn in steriler Kochsalzlösung, und es verwenden, um den Schädel zu reinigen. Dann mit einem sauberen trockenen Wattestäbchen, um den Schädel zu trocknen.
- Verwenden Sie eine sterile feinen Kugelschreiber, um einen Punkt auf dem Bregma markieren. Verwenden die stereotaktische Mikromanipulator, um die Hamilton-Spritze zu positionieren, so dass die Spitze der Nadel gerade berührt den Punkt auf dem Bregma.
- Nehmen Sie das DV zu koordinieren.
- Um zu überprüfen, ob der AP-Achse des Schädels Niveau bewegen Sie den Hamilton-Spritze nach hinten, so dass die Spitze der Nadel des Lambdapunkt berührt.
- Notieren Sie die DV Position. Sicherstellen, dass die DV-Koordinaten Bregma und Lambda sind innerhalb von 0,5 mm.
Anmerkung: Das Ziel ist es, die Differenz DV Bregma und Lambda minimieren.
- Benutze sieicromanipulator die Hamilton-Spritze Nadelspitze zurück zum Bregma Punkt zurückzukehren.
- Nehmen Sie die Startposition AP.
- Berechnen Sie die Endung AP Position durch Subtraktion 2,00 mm von der Ausgangs AP koordinieren.
- Verwenden Sie die Mikromanipulator, die Hamilton Spritzennadel auf die endgültige AP neu zu koordinieren.
- Nehmen Sie das aktuelle ML koordinieren.
- Berechnung der linken und rechten endet ML Koordinaten durch Addieren oder Subtrahieren von 1,3 mm von der Ausgangs ML koordinieren.
- Verwenden Sie die Mikromanipulator, die Hamilton Spritzennadel, um entweder die Endung ML-Koordinate zu bewegen.
- Tippen Sie auf die Nadelspitze auf die Oberfläche des Schädels an beiden enden ML Koordinaten und notieren Sie die DV-Koordinaten und sicherzustellen, dass die Werte innerhalb von 0,5 mm.
Hinweis: Das Ziel ist, den DV Unterschied zwischen den beiden enden ML Koordinaten minimieren. - Während bei einem Ende zu koordinieren ziehen Sie die Nadel bis 0,5-1 cm über den Schädel. Werfen Sie einen sterilen feinen Kugelschreiber, um einen Punkt auf th markierene Oberfläche des Schädels. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Gegenseite des Schädels.
- Tippen Sie auf die Nadelspitze auf die Oberfläche des Schädels an beiden enden ML Koordinaten und notieren Sie die DV-Koordinaten und sicherzustellen, dass die Werte innerhalb von 0,5 mm.
- Schwenken Sie die Hamilton-Spritze klar aus dem Weg.
- Bringen 0,8 mm Bohrkopf auf den Bohrer. Nehmen Sie die Bohrmaschine mit beiden Händen, setzen die Ellbogen auf der Oberfläche der Tabelle für die Stabilität, und positionieren Sie den Bohrkopf leicht über dem Sharpie Punkt auf der linken oder rechten ML koordinieren. Aktivieren Sie den Bohrer, senken Sie die Bohrerspitze auf die Schädeloberfläche, um ein Loch in den Schädel einzuführen. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Gegenseite.
Hinweis: Einige Blutungen können von den neu eingeführten Löcher auftreten. Wenn es dann Blutungen mit einem sauberen trockenen Wattestäbchen, um das Blut abtupfen. - Bewegen Sie den Hamilton-Spritze wieder in Position über eine der neu eingeführten ML Löcher. Senken Sie die Nadel Hamilton direkt hinter dem Schädel. An dieser Stelle darauf achten, nicht, um das Gehirn zu durchstechen. Um sicherzustellen, dass die Nadel übergeben der Schädel nehmen Sie den Zeigefinger und sanft drücken Sie die Nadel gegen den Schädel, um sure die Nadel das Loch nicht zu verlassen.
- Nehmen Sie die Start DV koordinieren.
- Berechnen Sie die Endung DV-Koordinate durch Subtraktion 2,2 mm von der Ausgangs DV koordinieren.
- Senken Sie die Nadel bis zum Angebotsende DV koordinieren.
- Aktivieren Sie den stereotaktischen Injektorpumpe bis 4 & mgr; l von Aß 1-42 in den Gyrus dentatus mit einer Rate von 0,5 ml / min zu pumpen.
- Wenn die Infusion beendet ist lassen sich die Nadel an Ort und Stelle bleiben für eine weitere 1 min auf Rückfluss der Lösung aus der Injektionsstelle zu minimieren.
- Bewegen Sie die Nadel auf die andere Seite des Gehirns, und wiederholen Sie die Schritte von 6,13 bis 6,18.
7. Tier Removal und Nachsorge
- Lösen Sie die Ohr Bars und Gesicht / Nasenschutz. Entfernen Sie die Maus aus dem Gerät.
- Verwenden Sie ein Student Standardmuster einer Pinzette zu ziehen in der Nähe der Kopfhaut und dann verschließen die Wunde mit Naht.
- Injizieren Sie 1 ml steriler Kochsalzlösung in die Maus über IP für Trink.
- InProjekt Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan, Schmerzen zu lindern.
- Pflegen Sie die Maus in die sauberen leeren Käfig auf der Oberseite der 42 ° C heißen Platte gesetzt, bis er aufwacht, dann lege sie in ihre Gehäusekäfig mit ausreichend Nahrung und Wasser.
- Verwalten Buprenorphin subkutane Injektion alle 12 Stunden für 3 Tage zur Schmerzlinderung.
8. Fadenzieh
- Betäuben Maus mit Ketamin / Xylazin Cocktail an 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg xlyazine von IP. Hinweis: Dies ist 7-10 Tage nach der Operation durchgeführt.
- Verwenden Sie ein Student Standardmuster einer Pinzette und gerade feinen Schere, um die Naht zu entfernen.
- Injizieren Sie 1 ml steriler Kochsalzlösung in die Maus über IP für Trink.
- Pflegen Sie die Maus in einem sauberen leeren Käfig an der Spitze von 42 ° C heiße Platte gesetzt, bis er aufwacht, und lege sie in ihre Gehäusekäfig mit ausreichend Nahrung und Wasser.
9. Tieropfer und Gewebeverarbeitung
- Betäuben die Maus und perfuse es mit 4% Paraformaldehyd 15, entfernen Sie das Gehirn, und verarbeiten sie für Kryoschneiden 16.
Anmerkung: Der Zeitpunkt des Tieropfer hängt vom Experimentator. Für unsere Untersuchungen haben wir uns für 7 und 14 Tage nach der Operation.
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Representative Results
Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von humanem rekombinantem oligomeren A & bgr; 1-42 ergibt lösliche oligomere Spezies, bestehend aus Monomeren, Dimeren, Trimeren und Tetrameren (1A). Diese niedermolekularen Aß 1-42 Spezies, aber nicht die Fibrillen und Plaques wurden in zahlreichen Einstellungen gezeigt, die meisten Neuronen toxisch 1,4,9,17-19 sein. Um festzustellen, ob oligomeren Aß 1-42 induziert Neuron Tod im Gehirn der Maus Aß 1-42 (4 ul 100 uM Stammlösung) wurde in die DG des Hippocampus in einer Hemisphäre von 9 Monate alten Wildtyp C57BL infundiert / 6J-Mäusen. Das Gewicht eines Hippocampus für C57BL / 6J wird auf etwa 0,018 g betrug und somit die Lieferung von A & bgr; 1-42 betrug etwa 100 ug / g. Die aus gleichen Volumen DMSO Auflösen Aß 1- verwendet wurde, bestand - die kontralaterale DG des gleichen Maushirn wurde mit einer Kontroll / Vehikellösung infundiert42 in (1x) PBS - zum Vergleich. Wie bereits erwähnt Rührei oder Rückwärts Aß 1-42-Peptid kann als Kontrolle zum Vergleich herangezogen werden, da wir bisher keine Auswirkungen auf Neuronen im Hippocampus 1 gefunden. Die Einführung der Nadel in das Gehirn erstellt lokale Gewebeschäden (1B) und verursacht eventuelle DG Zusammenbruch wir entschieden Nacheinspritzung Analysen neben dem Injektionswege, wo das Gewebe noch intakt ist. Innerhalb 1 Woche nach der Injektion wurde die A & bgr; 1-42 DG zeigten erhöhte Aß 1-42 Ebenen in der Molekularschicht und der polymorphen Zellschicht in der Nähe der Injektionsstelle (2A). Bei 7 und 14 Tagen Aß 1-42 ausgelöst Steigerungen TUNEL-positive Färbung und nimmt in DG Stärke, Bestätigung der neurodegenerative Effekte von Aß 1-42 (2B).
Da BF cholinergen Neuronen projizieren auf die DGdes Hippocampus wir festgestellt, wenn die nächste Verlust von Nervenzellen in der DG löst BF-Degeneration. Für diese Studie eine retrograde Tracer Fluorogold (2% Suspension) wurde gemeinsam injiziert zusammen mit A & bgr; 1-42 in der DG. 7 Tage nach der Injektion Fluorogold wurde in der BF (2C), was retrograden Transport des Etiketts über cholinergen Neuronen nachgewiesen. Daher ist für den Zweck der Quantifizierung in der BF wählten wir Fluorogold-positiven Neuronen, weil dies anzeigt, daß die neuronalen Terminals wurden Aß 1-42 im DG belichtet. An beiden 1 und 2 Wochen nach DG Aß 1-42 Infusion der Nukleus des diagonalen Bandes - ein Teilbereich der BF wo die cholinergen Neuronen ragen zu der GD - ipsilateral zur Aß 1-42 -injected Webseite sind Erhöhungen der TUNEL-Färbung und Abnahme der cholinergen Neuronen (Figur 2D). Der beobachtete Verlust von Nervenzellen in der BF bestätigt vergangenen Studien, die die zerstörerischeEffekte von Aß 1-42 zum BF-Hippocampuswegs 1,10. Es ist auch wichtig zu beachten, dass aus dem Vergleich der 2-Wochen-Zeitpunkt aus 1-Wochen-Zeitpunkt auf der Seite des Kerns des diagonalen Bandes, wo die Steuer / Vehikellösung wurde in der GD injiziert waren weitere Erhöhungen der TUNEL-Färbung und verringert im cholinergen Neuronen (2D, Tabelle). Diese Ergebnisse spiegeln eine signifikante Abnahme in der GCL Dicke und steigt in TUNEL-positive Kennzeichnung (2B, Tabelle) in der Generaldirektion des Fahrzeugs injiziert Seiten Vergleich zwischen den 2 Nacheinspritzung Zeitpunkte, was bedeutet, dass die körperliche Traumata durch die Nadel verursachten trägt zur Degeneration über die Zeit. Selbst mit dieser unerwünschten Nebenwirkung der Nadel, sind die Wirkungen von neurodegenerativen Aß 1-42 noch signifikant höher als die der Kontrolle / Vehikel-Lösung (2D). Zusammengenommen die aktuelle Infusions Modell effectively gibt die toxischen Effekte von Aß 1-42 im Gehirn der Maus innerhalb von 7 Tagen, damit diese zur attraktives Modell zur kurzfristigen Aß 1-42 Stimulation zu studieren.
Abbildung 1. Oligomere Aß 1-42 Vorbereitung und Mäusehirn Pritztrakt Visualisierung. (A) 2 uM oligomere Aß 1-42 auf 10-20% Tricin-Gel aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran übertragen. Die Membran wurde mit A & bgr; 1-42-Antikörper 6E10 (: 1,000 1) geblottet. (B) A & bgr; 1-42 (4 & mgr; l von 100 & mgr; M Lösung) oder Steuer / Vehikel wurde in der linken und rechten GDs des Hippocampus Infusion bzw. von 9 Monate alte C57BL / 6J-Mäusen. Mäuse wurden für 7 Tage überlebten. Die Gehirne wurden in Serie bei 20 & mgr; m pro Sektion geschnitten. Hippocampus-Schnitte wurden für DAPI gefärbt. Hash-Zeichen zeigendie Einspritzwege. Pfeile zeigen zusammengebrochen DG. Der Maßstab entspricht 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Oligomere Aß 1-42 induziert Neuron Tod in der DG und der BF. Steuerung / Fahrzeug oder Aß 1-42 (4 & mgr; l von 100 & mgr; M-Lösung) wurde in den linken und rechten Generaldirektionen des Hippocampus infundiert, jeweils von 9 Monate alten C57BL / 6J-Mäusen. Mäuse wurden entweder 7 oder 14 Tage überlebten. Die Gehirne wurden in Serie bei 20 & mgr; m pro Sektion geschnitten. (A) 7 Tage nach der Injektion Hippocampus-Abschnitte für Aß 1-42 gefärbt (NU4 Antikörper, 1: 2000). ML, molekularen Schicht; GCL, Ganglienzellschicht; PCL, polymorphe Zellschicht. Der Maßstab entspricht 50 & mgr; m. (B (C) bzw. Fahrzeug-Aß 1-42 coinjiziert. Fluorogold Kennzeichnung in der BF 7 Tage nach der Injektion bestimmt. Objektträgern mit BF wurden zufällig ausgewählt. Fluorogold Markierung wurde verwendet, um den interessierenden Bereich zu bestimmen. Sobald der interessierende Bereich identifiziert benachbarten Gehirnscheiben wurden verwendet, um für Marker von Interesse färben. Die Einschübe sind Regionen, in denen Bilder in (D) ausgewählt sind. Der Maßstab entspricht 200 um. (D) 7 oder 14 Tage nach der Injektion BF Abschnitte für ChAT gefärbt (1: 100, polyklonalen Ziegen) oder TUNEL. *** P <0,001 im Vergleich zu 1 Woche. * P <0,05 im Vergleich zum Träger. Quantifizierung wurde auf die gesamte Region gemachtvon Interesse. Die Grenze zwischen dem medialen Septum und im diagonalen Band wird auf der Grundlage der Lage des vorderen Kommissur abgegrenzt. Der Maßstab entspricht 100 & mgr; m. (N = 5 Mäuse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Um eine erfolgreiche Aß 1-42 Injektion erreichen der Experimentator oder Chirurg muss: 1) Verwenden Sie aseptische Technik; 2) richtig das Gehirn Region von Interesse mit genauen Koordinaten zu identifizieren; 3) in der Lage sein, um die Maus richtig zu sichern in der stereotaktischen Rahmen mit dem Gehirn in den AP und ML-Achse nivelliert; 4) die Fähigkeit, den Mikromanipulator mit Präzision zu arbeiten; 5) eine ordnungsgemäße post-operative Betreuung. Wenn diese Taste Schritte befolgt werden die Maus sollte die Operation ohne beobachtbare Infektion überleben.
In Übereinstimmung mit in-vitro-Studien, die wir und andere haben gezeigt, dass A & bgr; 1-42 direkt in den Hippocampus infundiert auslöst Neuron Tod 1,4,9,10, der Darstellung einer der wichtigsten Features von AD. Die Degeneration ist klar ersichtlich, in der Nähe der Injektionsstelle von einem in dem Volumen des Gyrus dentatus, der durch einen Anstieg der Marker für Degeneration 1 ergänzt wird verringert dargestellt. Weiterhin ter cholinergen Neuronen, die den Hippocampus projizieren sterben retrograd, wie durch eine Abnahme der cholinergen Kennzeichnung und einer Erhöhung der TUNEL-positive Färbung in der BF 1,10 gezeigt. Somit dient dieser in vivo-Modell als hervorragendes Modell, um die halb akute Wirkung von Aß 1-42 vor Ort zu untersuchen. Der entscheidende Vorteil dieses Modells ist seine Injektion Dynamik: jede Gehirnregion kann zielgerichtet sein und verschiedenen alten Tieren verwendet werden. 9 Monate alten männlichen Mäusen wurden in unseren Experimenten gewählt, weil wir glauben zunehmende Aß 1-42 Ebenen in älteren Mäusen besser simuliert die Krankheit, die bei älteren Menschen auftritt. Darüber hinaus wollen wir die Versuche im Einklang mit Hilfe Mäusen gleichen Alters zu halten. Jedoch könnte Mäusen jeden Alters für die Injektion verwendet werden. In der Vergangenheit haben wir an Mäusen, die 16 Monate alte waren experimentiert und andere haben Mäuse, die 2 Monate alt 9,10 verwendet. Nur männliche Mäuse sollten in Studien als weibliche Mäuse zeigen estro verwendet werdengen Pegelschwankungen und Östrogen ist bekannt, neuroprotektive Effekte 20 haben. Obwohl viele Forschungsinteressen drehen sich um die pathologischen Wirkungen von Aß 1-42, wird es auch Anzeichen dafür, dass niedrige oder physiologische Aß 1-42 Ebenen sind für normale Funktionen für Lernen und Gedächtnis 21,22 erforderlich. In diesen Studien Ermittler senkte die Konzentration von A & bgr; 1-42 injiziert und infundiert in die Hippocampus 22,23 effektiv offenbart noch ein weiteres Beispiel des dynamischen Charakters der Nützlichkeit dieses Paradigmas. Andere Verbindungen, die erfolgreich stereotaxically wurde infundiert haben, gehören Drogen, Viren, siRNA, Antikörper und Peptide 1,22-26, um verschiedene Effekte, die von Zelltod / Überleben auf das Verhalten der Tiere zu untersuchen. Somit gibt es zahlreiche Anwendungen für die Verwendung dieser Infusions Paradigma.
Die beschriebene Infusions Methodik, während sie verschiedene Potenziale für in vivo Studien unter Verwendung dieser Technik kommt auch mit inhärenten Einschränkungen. Erste Versuche dieses Modell nur die Wirkungen von A & bgr; 1-42 in einer isolierten Hirnregion zu reproduzieren. Zweitens wird die Injektionsstelle von der Einführung einer Nadel in das Gehirn beschädigt. Dies trägt zu einer weiteren Zelle den Tod und Gliose. Daher weist Analyse von der Injektionswege entfernt durchgeführt werden. Mit entsprechenden Fahrzeugsteuerung auf der Gegenseite aus dem gleichen Gehirn sollte dies kein Problem, da die injizierten Fahrzeug und Aß 1-42 Lösungen Ausbreitung des umliegenden Gewebes sein. Drittens, weil BF cholinergen Neuronen projizieren zum Hippocampus, die körperliche Schäden des Hippocampus als offensichtlich von dem Zusammenbruch der DG durch die Nadel (1B) versehentlich töten einige BFCNs. Glücklicherweise Prüfung der neuronalen Schaltkreise, die kurzfristig - innerhalb von 1 Woche von einem Single-Shot-Infusion - kein Problem dar, da unsere Daten legen nahe, dass die erhöhtecholinerge Tod im basalen Vorderhirn ist das Ergebnis von A & bgr; 1-42 und nicht vom Trauma der Nadel; Steuereinspritzungen bieten die entsprechende Analyse. Die Daten legen nahe, dass die Degeneration des DG ist auch für den Verlust von BF cholinergen Neuronen notwendig, da diese Neuronen verlieren ihren synaptischen Targets (2B). Leider ist für Tiere, die die bis zu 2 Wochen die Fahrzeugseite eingespritzt zeigt signifikante Erhöhung von BFCN Tod über 1 Woche nach der Fahrzeug injizierten Tieren, die durch sein scheint teilweise auf die Degeneration und Ausdünnen des Gyrus dentatus von der physischen Trauma des resultierenden Nadel. Jedoch selbst in diesem Stadium die Daten nahe, gibt es wesentlich mehr Todesfälle in der BF ipsilateral zur Aß 1-42 -injected Ort. Viertens Identifizieren subtilen anatomischen Grenzen kann schwer zu erreichen sein. So wurde beispielsweise die Grenze zwischen dem medialen Septum und im diagonalen Band bestimmt auf der Grundlage der Lage des vorderenKommissur, eine Technik, die zuvor beschrieben 27. Da ferner der ipsilateralen BF cholinergen neuronalen Vorsprung - im Wesentlichen von der medialen Septum und vertikalen Schenkel des diagonalen Bandes (MS / DB) - zu dem Gyrus dentatus des Hippocampus 12,28,29 wir beschlossen, eine Halbkugel mit Aß injizieren 1-42 und verwenden Sie den gegenüberliegenden Hemisphäre als Kontrolle zum Vergleich. Denkbar ist, dass die Sorge um dieses Paradigmas wäre die richtige Identifizierung der Grenze zwischen linken und rechten MS / DB sein. Während sich die MS in dem Mittellinienbereich, sind die DBs mehr lateral. Aus diesem aktuellen Arbeit und unsere jüngste Veröffentlichung 1 konnten wir bequem unterschieden linken und rechten DB. Unsere Quantifizierung zeigt ChAT (+) Neuronen verringern um etwa 25% in der DB in der Aß 1-42 -injected Seite. Aber wir konnten keine signifikanten Veränderungen im Chat (+) Neuronen im MS 1 zu erkennen. Aufgrund der seitlichen location der DBs und die Veränderungen beobachteten wir fühlten uns gerechtfertigt, Fahrzeug und Aß 1-42 Injektionen innerhalb der gleichen Tier beschäftigen. Außerdem testet 2 verschiedene Versuchsbedingungen innerhalb des gleichen Tieres maximiert nicht nur die Verwendung des Tieres, sondern verringert auch potentielle Tier-zu-Tier-Variabilität. Während unsere Versuchsplanung ermöglicht es uns, linken und rechten Gehirnhälften vergleichen es denkbar ist dieser Vergleich Technik nicht durchführbar in zukünftigen Studien, das heißt, wenn die mediale Septum ist der Schwerpunkt der Studie. In diesem Fall wird jedes Tier muss als Versuchsanlage dienen. Daher ist die Verwendung von Tieren in das Ermessen der Experimentatoren. Fünftens kann die Stromeinspeisung Modell für andere Lese-outs wie Verhalten verwendet werden? Unser Ziel bei der Anwendung des aktuellen Aß 1-42 Injektionsmodell war es, die neuropathologische Effekte von Aß 1-42 in vivo zu beurteilen und vergleichen Sie es mit in-vitro-Ergebnisse 1 (1B und 2B), wenn wir gezielt die Injektionsnadel in oder nahe der DG nach 7 Tagen die Zerstörung des DG kann zu unbeabsichtigten Verhaltensabweichungen ergeben. Daher, wenn eine Untersuchung erfordert die Prüfung der Wirkung von A & bgr; 1-42 in der Hippocampus-abhängige Verhalten, dann die Einspritzziel müssen möglicherweise in der Nähe des Hippokampus anstelle repositioniert werden direkt hinein und ermöglichen Aß 1-42 um in den Hippocampus zu diffundieren. Das heißt, die Verwendung des Strominjektions Paradigma für Verhaltenstests möglich ist, erfordert aber mehr TestIng und Charakterisierung sowie die endgültige Versuchsstrategie wird durch den Endbenutzer bestimmt werden. Interessanterweise gab es vor Nagetier Verhalten Studien, die externe Zustellung von Aß 1-42 direkt in das Gehirn betreffen. 22,30 Zusammengenommen müssen diese Einschränkungen bei der Auslegung in vivo Maus-Studien unter Verwendung dieses Modells werden.
Da keine einzige Maus-Modell in Existenz erfasst die vollständige pathologische Wirkungen von AD die stereotaktischen Aß 1-42 Infusionstechnik bietet Experimentatoren eine Alternative in vivo Aß 1-42 Mausmodell. Wenn von einem gut ausgebildeten Person durchgeführt Dieses Modell eignet sich besonders für Kurzzeitstudien mit Schwerpunkt auf den Auswirkungen von Aß 1-42 auf eine bestimmte Gehirnregion oder Schaltungen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall unterstützt gewähren NS081333 (CMT), Alzheimer-Gesellschaft Zuschuss nirgens-10-171721 und National Institute of Mental Health Zuschuss MH096702 (bis UH) und National Institute on Aging geförderte Alzheimer-Forschung Center an der Columbia University Pilot Zuschuss AG008702 (bis YYJ und JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
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