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Methodenartikel

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

12.2K Aufrufe

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DOI:

10.3791/52808

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5. Oktober 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, pathogenspezifische T-Zellen in klinischer Qualität herzustellen, indem ein automatisiertes Zellanreicherungsgerät der zweiten Generation verwendet wird, das ein geschlossenes Zytokin-Capture-System enthält und kein spezielles Personal oder die Verwendung einer GMP-Einrichtung erfordert. Die erzeugten pp65-spezifischen T-Zellen des Cytomegalievirus können direkt an Patienten verabreicht werden.

Zusammenfassung

Der adoptive Transfer von Pathogen-spezifische T-Zellen können verwendet werden zur Vorbeugung und Behandlung opportunistischer Infektionen, wie Cytomegalievirus (CMV) nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation auftritt. Viral-spezifischen T-Zellen von allogenen Spendern, einschließlich Dritter Spender kann ex vivo vermehrt werden in Übereinstimmung mit den geltenden Guten Herstellungspraxis (cGMP) und beschäftigt wiederholte Runden von Antigen-angetriebenen Stimulation, um die gewünschten T-Zellen selektiv zu verbreiten. Die Identifizierung und Isolierung von Antigen-spezifischen T-Zellen kann auch auf der Grundlage der Zytokin-Capture-System der T-Zellen, die aktiviert wurden, um gamma-Interferon (IFN-γ) sekretieren vorgenommen werden. Doch weit verbreiteten Menschen Anwendung der Zytokin-Capture-System (CCS) zur Wiederherstellung der Immunität wurde begrenzt, wie der Produktionsprozess ist zeitaufwendig und erfordert einen erfahrenen Bediener. Die Entwicklung einer zweiten Generation Zellanreicherung Vorrichtung wie CliniMACS Prodigy jetztermöglicht Ermittler viral-spezifischen T-Zellen unter Verwendung eines automatisierten, weniger arbeitsintensiv System zu erzeugen. Diese Vorrichtung trennt magnetisch von unmarkierten Zellen durch magnetische Zellsortierung Technologie klinischem Produkte erzeugen markierten Zellen wird als ein geschlossenes System konstruiert und zugegriffen werden kann und gegen die Arbeitsfläche betrieben werden. Wir demonstrieren die Funktionsweise dieser neuen automatisierten Zellanreicherungsvorrichtung zur CMV pp65-spezifischen T-Zellen, die aus einer stationären Apherese Produkt von einem CMV-seropositiven Spender erhalten erhalten herzustellen. Diese isolierten T-Zellen können dann direkt in einen Patienten unter institutionellen und bundesstaatlichen Regulierungsaufsicht infundiert werden. Alle Bio-Verarbeitungsschritten einschließlich der Entfernung der roten Blutkörperchen, die Stimulation von T-Zellen, die Trennung von Antigen-spezifischen T-Zellen, Reinigung und Waschen sind voll automatisiert. Geräte wie dies die Möglichkeit, dass T-Zellen für die Anwendung beim Menschen kann außerhalb gewidmet guten Herstellungspraxis (GMP hergestellt werden) Einrichtungen und stattdessen in Blutbanken Einrichtungen, in denen Mitarbeiter können automatisierte Protokolle überwachen, um mehrere zu produzieren werden.

Einleitung

Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) 1 kann mit Adoptiv-T-Zell-Therapie kombiniert werden, um Graft-versus-Tumor-Wirkung zu verbessern und Immunität gegen opportunistische Infektionen 2 bereitzustellen. Erzeugung von Antigen-spezifischen Spender abgeleiteten T-Zellen für die Infusion hat historisch erforderlichen Fachkräfte und die Verwendung von spezialisierten Einrichtungen, die GMP-konform sind. Die Lieferung solcher T-Zellen wurde in der Entschließung des opportunistischen Infektionen 3 sowie Behandlung der zugrunde liegenden malignen 4 geführt. Vor kurzem haben Forscher gezeigt, dass der adoptive Transfer von nur wenigen tausend Virus-spezifischen T-Zellen (~ 1 x 10 4 bis 2,5 x 10 5 Zellen / kg Körpergewicht des Empfängers) opportunistische CMV Infektionen nach alloHSZT 5-9 erfolgreich zu behandeln. Eine begrenzte Anzahl von GMP-Anlagen mit zugehörigen Fachfertigungsanforderungen und der hohen Kosten, die mit der Zellproduktion assoziiert hat jedoch restricted Patienten den Zugang zu vielversprechenden T-Zelltherapien 10. Ein Ansatz zum Isolieren von antigenspezifischen T-Zellen basiert auf den CCS Verwendung eines bispezifischen Reagenzes an CD45 und IFN-γ erkennt beruht. Wie gezeigt ist, kann diese Methode verwendet werden, um klinische Studien zu CMV-spezifische T-Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zellanreicherung CCS Einrichtung (1B) zu erzeugen.

CMV-spezifische T-Zellen werden durch Inkubation von überlappenden Peptiden von CMV pp65 Antigens mit Leukapherese Gesamtkernzellen (TNC) von CMV-seropositiven Spendern erzeugt. Diese Peptide im Kontext von Human-Leukozyten-Antigen (HLA) angezeigt wird, aktivieren die CMV pp65-spezifischen T-Zellen innerhalb der TNC zu IFN-γ sezernieren. Diese T-Zellen können dann "eingefangen" werden und magnetisch getrennt. Der Betrieb der ersten Generation Zellanreicherungseinrichtung (1A) unter GMP-Bedingungen erforderliche Personal Mann Zellkultur, und die Koordination der Mitarbeiter, um die Mehrfach s verpflichtenTEPs notwendig, eine "eingefangen" Produkt zu erzeugen.

Das Verfahren in der Regel erforderlich, 10 bis 12 h Dauerbetrieb, und damit Personal wahrscheinlich benötigen, um mehr als zwei Schichten in der GMP-Anlage zu arbeiten. Diese Beschränkungen werden nun durch die Durchführung einer zweiten Erzeugungsvorrichtung (in 1B gezeigt) vermieden. Diese Vorrichtung übernimmt magnetische Anreicherung, ähnlich zu der ersten Erzeugungseinrichtung, aber automatisiert andere Aspekte der CCS in einem unbreached Ansatzes. Dies reduziert die Belastung für die GMP-Team als die meisten Schritte können unbeaufsichtigt von Mitarbeitern durchgeführt werden. Da ferner die Vorrichtung arbeitet als geschlossenes System, können die Antigen-spezifischen T-Zellen, aufgenommen und gegen die Arbeitsfläche mit Ausnahme der Schritte in Leukapherese Isolierung und Herstellung von Materialien vor dem Starten des Instruments eingebundenen verarbeitet werden. Details des kompletten Instrumentierung und Funktionalität dieser zweiten Generation Zellanreicherungsvorrichtung wurden published 11.

Hier beschreiben wir die Schritte zum CMV pp65-spezifischen T-Zellen aus einer stationären Aphereseprodukt Verwendung des automatischen Zellanreicherung CCS-System anzureichern. Nachdem sie isoliert wurde, kann diese CMV-spezifische T-Zellen sofort in einen Patienten infundiert werden.

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Protokoll

1. Herstellung des Materials unter sterilen Bedingungen (siehe Materialien und Geräte Tabelle)

  1. Vorbereitung 3 l PBS / EDTA-Puffer mit humanem Serumalbumin (HSA) ergänzt, um eine Endkonzentration von 0,5% (w / v).
  2. Bereiten Sie 1 L Tasche von klinischen Grade 0,9% Natriumchlorid (NaCl) -Lösung und 2 l GMP Grade-Zellkulturmedium.
  3. Bereiten Sie 60 nmol von CMV-spezifischen Peptid-Antigen-Cocktail durch Rekonstitution eines Fläschchens CMV pp65 mit 8 ml sterilem Wasser.
  4. Bringen CMV pp65-Peptid-Cocktail in ein 50 ml Volumen Gefrierbeutel mit einem Luer / Spike Verbindungsleitung und klemmen mit Sicherungszange an nachfolgende Verteilung der Cocktail in das Schlauchsystem zu vermeiden. Offene Zellanreicherung Schlauchsatz (TS 500) unter sterilen Bedingungen.
  5. Mit einer sterilen Schlauchschweißgerät, schließen Peptidcocktail Gefrierbeutel in Rohranschluss für Ventil 2 der Schlauchsatz TS 500, die das Peptid-Cocktail Beutelklemme zu diesem Zeitpunkt nicht öffnen.
  6. 1 Entfernen x 10 9 TNC aus Ausgangszellprodukt und setzt in PBS / EDTA-Puffer, enthaltend 2,5% HSA mit einem Gesamtvolumen von 50 ml. Spritzen Sie das Zellprodukt in einen 150 ml Transferbeutel.

2. Herstellung und Einsatz von automatisierten Zellanreicherung System (siehe Materialien und Geräte Tabelle)

  1. Schalten Sie den Zellanreicherungssystem (1B), und wählen Sie das Programm "CCS_IFN-γ Enrichment". Beobachten eine Benutzerschnittstelle, die Siebe mit Anweisungen und Abbildungen Führung der Bedienungsperson durch das Verfahren.
  2. Geben Sie den Parameter "Operator" und "Tubing Set P / N Nein". Als nächstes installieren Sie das Tubing Set 500 um automatisierten Zellanreicherung Gerät gemäß den Anweisungen auf dem interaktiven Bildschirm angezeigt.
  3. Befolgen Sie die Anweisungen Schritt für Schritt auf dem Bildschirm angezeigt, um das Medium und Puffer an das Gerät anschließen. Nehmen Sie Katalognummer und Chargennummer der Reagenzien vor connecting an das Instrument.
  4. Nach der letzten Überprüfung der Schlauchsatz, öffnen Sie die Klemme des Peptids Cocktail Tasche. Öffnen Sie das Medium Tasche und initiieren automatischer Entlüftung des Schlauchsets.
  5. Nach dem Entlüftungsschritt abgeschlossen ist, ergänzen HSA (2,5%) in NaCl-Puffer in der Reservoirbeutel (200 ml) mit Hilfe der sterilen Schlauchschweißgerät. Übertragen Sie die Ausgangszellprodukt in die Verwendung der sterilen Schlauchschweißgerät "Application-Tasche".
  6. Schließen CCS (IFNy) Reagenzien in entsprechende Rohr über Adapter. Geben Sie bevorzugte Zeit, um eine Fraktion von Zellmaterial vor dem Anreicherungsprozess zu sammeln. Bewertung und Überprüfung der Richtigkeit aller Daten / eingegebenen Parameter. Starten Sie den Prozess.
  7. Vor dem Start der automatisierten Zellanreicherungsprozess, entfernen Sie die Qualitätskontrolle Bag (QCB, original Fraktion (ori) enthält etwa 1,3 ml von 100 ml Inhalt Kammer mit PBS / EDTA-Puffer verdünnt). Dichten Sie das QCB, wiegen, und bei 4 ° C.
  8. Starten Sie den enrichment-Prozess. Am Ende des Prozesses werden die Zielzellen mit einem ungefähren Volumen Elutionspuffer aus dem Reservoirbeutel eluiert werden.
  9. Dichten Sie das Nichtzielzelle Bag (NTCB, negative Fraktion = neg) und Zielzelle Bag (TCB, positive Fraktion = pos) und wiegen jede Tasche. Die Gewichte werden später für die Berechnung der Zellzahl verwendet werden.
  10. Unmittelbar nach dem Anreicherungsverfahren sammeln zwei Aliquots pro Fraktion für die Durchflußzytometrie-Analyse, und der Rest der Proben bei 4 ° C. Verwenden Sie eine Probenaliquot zur Zellzahlbestimmung und die andere Probenaliquot zur Anreicherung Performance-Analyse (Tabelle 1).
  11. Entfernen Sie den Schlauch von der Zellanreicherung Instrument festgelegt. Übertragen Sie die Protokolldatei auf einem USB-Laufwerk für die zukünftige Verwendung.
    HINWEIS: Alle Reagenzien werden unter sterilen Bedingungen hergestellt werden. Die Verwendung eines Biosafety Typ-II-Haube ist sehr zu empfehlen. Verwenden stationären Apherese Zellprodukt (nicht mobilisiert) von einem gesunden isoliertCMV-seropositiven Spender zum CMV-Antigen-spezifischen T-Zellen anzureichern. Nur FDA lizenziert HSA verwendet werden. Der Puffer für Zellpräparation sollte +19 ° C bis +25 ° C, niedrigere oder höhere Umgebungstemperaturen führt zu verminderter Reinheit und einer reduzierten Ausbeute der Zielzellen führen, gehalten werden.

3. Zellzahlbestimmung

  1. Nehmen die Portionen von QCB, NTCB und TCB für Zellzahlen, wie in Tabelle 1 gezeigt. In CD45-VoBlue zu jedem Aliquot (Titer 1,11) und Inkubieren im Dunkeln für 10 min bei 4 ° C.
  2. 1,5 ml frisch hergestelltem Lyse der roten Blutkörperchen-Lösung (1x) auf die ursprüngliche Fraktion und negativen Fraktion, 450 & mgr; l frisch hergestellte Lyse roter Blutkörperchen Lösung der positiven Fraktion und Inkubieren aller Fraktionen für 15 min bei RT.
  3. Gerade vor der Analyse hinzuzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml (1: 100 Verdünnung von 100 ug / ml). Verwenden Sie die automatische Zellzähler auf Zellzahl und vi zu bestimmenFähigkeit. Verwenden Sie Zellzähler Gerät empfohlene Software für die Durchflusszytometrie-Analyse. Bestimmen Sie die absolute Zählungen von Leukozyten für original, negative und positive Fraktionen.
    HINWEIS: Die Zellzahl der lebensfähigen Leukozyten pro ml der Proben zur Analyse entnommen Zellzahl wird unter Verwendung des Zellanalyse empfohlene Software bestimmt.
  4. Stellen Sie den Bereich, wie in Abbildung 2 (Bereich 5, lebensfähigen Leukozyten) gezeigt. Verwenden Sie die folgenden Gating-Strategie zur Zellzahl zu bestimmen. Ein lebensfähiger Leukozyten in Original Fraktion wird in Abbildung 2 dargestellt.
  5. Die genannten Bereiche (2, 1-6) sind hierarchisch, wie folgt:
    1: Zeit Gate → 2: Einzelzellen → 3: CD45 + Zellen → 4: Leukozyten (Ablagerungen ausgeschlossen) → 5: Lebensfähige Leukozyten → 6: Lebensfähige Lymphozyten
  6. Wiederholen Sie die gleichen Schritte, um Zellzahlen für negative und positive Fraktionen zu bestimmen. Berechnung der Zellzahl von der gesamten Fraktionunter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors der Probe, und das Gesamtvolumen der Fraktion (Tabelle 2).

4. Prüfung der Trennleistung

  1. Mit vorgekühlten PBS / EDTA-Puffer / 0,5% AB-Serum Waschen Sie die Teilmengen von QCB, NTCB und TCB Bruchzellen. Zentrifugieren der Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
  2. Die Zellen in 100 & mgr; l Antikörper-Fluorochrom-Färbung Mischung enthaltend: CD3-FITC, CD4-APC CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue und anti-IFN-PE (Titer 1,11) und Inkubieren im Dunkeln für 10 min bei 4 ° C.
  3. 1 ml frisch hergestelltes Lyse der roten Blutkörperchen-Lösung (1x) und Inkubation für 15 min bei RT. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C und saugt den Überstand. Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen von PBS / EDTA-Puffer / 0,5% AB-Serum.
  4. Hinzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml unmittelbar vor der Analyse (1: 100 dilutiauf 100 & mgr; g / ml). Zuführen Durchflusszytometrie, um die Reinheit der Probe zu bewerten.
  5. Verwenden Sie die folgenden Gating-Strategie, um die CD3 + T-Zellen in lebensfähiger Leukozyten-Gating-Strategie zur Bestimmung der CD3 + T-Zellen in positiven Fraktion nach CCS Anreicherungsprozess gezeigt, zu berechnen. Die angegebenen Bereiche (3A und 3B, 1-6) sind hierarchisch wie folgt verbunden:
    1: Zeit Gate → 2: Einzelzellen → 3: CD45 + Zellen → 4: Zellen (Ablagerungen ausgeschlossen) → 5: Lebensfähige Leukozyten → 6: Lebensfähige CD3 + Zellen Bevölkerung
  6. Bestimmen die Frequenz von CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + und CD8 + IFN-γ + T-Zellen nach CCS Anreicherungsverfahren (Tabelle 2).
  7. Verwenden die Gating-Strategie, die Frequenzen der CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + und CD8 + IFN-γ + T-Zellen unter f dargestellten bestimmenoder ein Original und angereicherten (gefangenen) positive Fraktion nach CCS-Verfahren. Die angegebenen Bereiche sind hierarchisch verknüpft und wie folgt benannt:
    1: Zeit Gate → 2: Einzelzellen → 3: CD45 + Zellen → 4: Zellen (Ablagerungen ausgeschlossen) → 5: Lebensfähige Leukozyten → 6: Lebensfähige CD3 + Zellen → 7: CD4 + -Zellen → 7a: CD4 + IFN-γ + Zellen (box) → 8: CD8 + -Zellen → 8a: CD8 + IFN-γ + Zellen (Kasten)

HINWEIS: Die ersten 6 angegebenen Regionen der Hierarchieverbindungen sind die gleichen wie in Figur 3, (1-6) und zuletzt 2-Regionen sind in Abbildung 4 (6-8a) gezeigt.

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Ergebnisse

In dieser Studie wurde eine automatisierte Zellanreicherung CCS System zur automatisierten Erzeugung von CMV pp65-spezifischen T-Zellen verwendet. CMV-spezifische T-Zellen wurden aus drei Apherese Zellprodukten angereichert. Die Steady-State-Apherese-Produkt wurde über 2 Stunden von einem CMV-seropositiven Spender 10 10 Gesamtkernzellen (TNC) geerntet und erzeugt. 10 9 TNC wurden dann mit CMV pp65 abgeleitete Peptide (60 nmol) für 4 Stunden und die IFN-γ sezernierenden T-Zellen wurden mit Hilfe der...

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Diskussion

Adoptive T-Zell-Therapie hat sich als praktikable Option, um B-Zell-Malignitäten 4 Behandlung entstanden. Sein therapeutisches Potential ist abhängig von der Infusion der gewünschten Anzahl von Ziel-Antigen spezifischen T-Zellen, die replikative Seneszenz 2 fehlt. Dies kann durch Aussortieren eine reine Population von Antigen-spezifischen T-Zellen aus expandierten T-Zellen in Übereinstimmung mit den geltenden guten Herstellungspraxis erreicht werden kann. Zwei Sortierverfahren sind weit verbreitet,...

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Offenlegungen

Sowohl MD Anderson Cancer Center und Dr. Cooper haben ein finanzielles Interesse an ZIOPHARM Oncology, Inc., und Intrexon Corporation. Am 7. Mai 2015 wurde Dr. Cooper als Chief Executive Officer bei ZIOPHARM Onkologie ernannt. Dr. Cooper heute ist er Gastwissenschaftler am MD Anderson. Dr. Cooper gegründet und besitzt InCellerate, Inc. Er hat Patente mit Sangamo BioSciences mit künstlichen Nukleasen. Er berät sich mit Targazyme, Inc. (ehemals amerikanischen Stammzellen, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals und Bristol-Myers Squibb. Er ist auf dem wissenschaftlichen Beirat von Cellectis. Er erhält Honorare von Miltenyi Biotec.

Danksagungen

Wir danken Miltenyi Biotec, Deutschland für die Bereitstellung von Reagenzien und CliniMACS Prodigy-Geräten für Evaluierungsstudien. Wir danken George T. McNamara (Pädiatrische Abteilung, MD Anderson Cancer Center) für das Korrekturlesen des Manuskripts. Unterstützung durch Zuschüsse: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fonds; Institut für Krebsprävention und -forschung von Texas; CLL Globale Forschungsstiftung; Nachlass von Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Stiftung; Harry T. Mangurian, Jr., Fonds für Leukämie-Immuntherapie; Institut für personalisierte Krebstherapie; Gesellschaft für Leukämie und Lymphom; Stiftung für Lymphomforschung; der Schwesterinstitutionen-Netzwerkfonds des MDACC; Miller-Stiftung; Herr Herb Simons; Herr und Frau Joe H. Scales; Herr Thomas Scott; Nationale Stiftung für Krebsforschung; Stiftung für pädiatrische Krebsforschung; William Lawrence und Blanche Hughes Children's Foundation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L BagMiltenyi Biotec GmbH700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500Miltenyi Biotec GmbH130-097-182
5 L AbfallsackMiltenyi Biotec GmbH110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)Miltenyi Biotec GmbH279-01
Albumin (Human) 25% Grifols58516-5216-2
Luer/Spike-InterkonnektorMiltenyi Biotec GmbH130-018-701
0,9 % NaCl-Lösung (1 L)Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65Miltenyi Biotec GmbH170-076-109
Wasser für InjektionszweckeHospira, inc, Lake Forest, ILNDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filtereinheit 0,22 μ M MilliporeSLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L BeutelMiltenyi Biotec GmbH170-076-306
Transferbeutel, 150 ml (für zelluläres Ausgangsmaterial)Miltenyi Biotec GmbH130-018-301
CryoMACS Gefrierbeutel 50Miltenyi Biotec GmbH200-074-400
60 ml Spritzen, sterilBD, Laagstraat, Temse, Belgien309653
CMV-Sero positives AphereseproduktKey Biologics, LLC, Memphis
Durchflusszytometrie-MaterialienHerstellerKatalognummer
AB Serum, GemCellGemini Bio-Products, West Sacramento, USA100-512
CD3-FITCMiltenyi Biotec GmbH130-080-401
CD4-APCMiltenyi Biotec GmbH130-098-033
CD8-APC-Vio770Miltenyi Biotec GmbH130-098-065
CD14-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-072
CD20-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-077
CD45-VioBlueMiltenyi Biotec GmbH130-098-136
aIFN-γ-PE, humanMiltenyi Biotec GmbH130-097-940
CD3-PEMiltenyi Biotec GmbH130-091-374
Propidiumiodid Lösung (100 & mikro; g/ml)Miltenyi Biotec GmbH130-093-233
EquipmentHerstellerKatalognummer
CliniMACS Prodigy Device Miltenyi Biotec GmbH200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec GmbH130-096-343
Software 2.4
Zentrifuge 5415R Eppendorf AG22331
Cellometer K2Nexelom Bioscience, Lawrence, MALB-001-0016
Schweißgerät für sterile Schläuche SCDIIBTerumo Medical Corp., Elkton, MA7811

Referenzen

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