Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Sandra Meyer; Philipp Wörsdörfer; Katharina Günther; Marc Thier; Frank Edenhofer

doi:10.3791/52831

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Methodenartikel

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

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DOI:

10.3791/52831

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29. Juli 2015

Sandra Meyer¹^,² , Philipp Wörsdörfer¹ , Katharina Günther¹ , Marc Thier²^,³ , Frank Edenhofer¹^,²

¹Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Würzburg, ²Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn, ³German Cancer Research Center, Heidelberg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Zusammenfassung

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus adulten Hautfibroblasten und nachfolgende Differenzierung in somatische Zellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten, die Histocompatibility Barrieren zu umgehen. , Die Progression durch einem pluripotenten Zustand und anschließende vollständige Differenzierung in die gewünschten Linien bleibt jedoch ein Hindernis für die klinische Umsetzung von iPS-Technologie wegen der damit verbundenen neoplastischen Potential und genomische Instabilität. Vor kurzem haben wir und andere zeigten, dass Körperzellen kann nicht nur in iPSCs sondern auch in verschiedene Arten von multi somatischen Stammzellen mit definierten Faktoren, wodurch Umgehung Progression durch den pluripotenten Zustand umgewandelt werden. Insbesondere die direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten zu induzierten neuronalen Progenitorzellen (iNPCs) kündigt die Möglichkeit eines neuen autologen Zellquelle für verschiedene Anwendungen, wie beispielsweise Zell-Ersatz, Krankheitsmodelleund Wirkstoff-Screening. Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten humanen primären Fibroblasten durch Hautbiopsie und deren effiziente direkte Umwandlung in iNPCs durch rechtzeitige beschränkte Expression von Oct4, Sox2, Klf4, sowie c-Myc. Sox2-positive neuroepithelialen Kolonien erscheinen nach 17 Tagen der Induktion und INPC Linien effizient durch monoklonale Isolation und Expansion geschaffen werden. Genaue Einstellung der virale Multiplizität der Infektion und Ergänzung Leukämiehemmfaktor während der Induktionsphase stellen kritische Faktoren Umwandlungswirkungsgrade von bis zu 0,2% zu erreichen. Bisher konnte patientenspezifischen INPC Linien für mehr als 12 Durchgänge expandiert werden und zeigen morphologische und molekulare Merkmale von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, wie die Expression von Nestin und Sox2 gleichmäßig. Die INPC Linien können in Neuronen und Astrozyten differenziert werden, wie durch Färbung gegen TuJ1 und GFAP bzw. beurteilt. Zusammenfassend haben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung und dire meldenct Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in stabiler Weise erweiterbar neuralen Vorläuferzellen, die eine Zellquelle für biomedizinische Anwendungen, wie beispielsweise autologe neuronalen Zell-Ersatz und Krankheitsmodelle liefern könnten.

Einleitung

Im Jahr 2006 Yamanaka und Kollegen zum ersten Mal zeigen, könnte die Möglichkeit der Reprogrammierung von somatischen Zellen in einem pluripotenten Zustand ^1. Diese Dedifferenzierung wurde durch Überexpression von vier Transkriptions Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc in murinen Fibroblasten erreicht Faktoren. Die erzeugten sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zeigen funktionale Äquivalenz zu embryonalen Stammzellen (ESC) und können so in alle Zelltypen des erwachsenen Organismus differenziert werden. Ein Jahr später Umprogrammierung zu iPSCs könnte auch für die menschliche Fibroblasten ² erreicht werden. Experimente in Tiermod....