Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Zusammenfassung

Langzeit-kultivierten Interferon-γ enzymgebundenen immunospot Assay wird als Maß der zentralen Speicher-Antworten verwendet, und korreliert mit Schutz antimykobakteriellen Impfstoff Antworten. Mit diesem Test werden die peripheren mononukleären Blutzellen mit mycobakteriellen Antigene und IL-2 für 14 Tage, so dass die Differenzierung und Expansion des zentralen Gedächtnis-T-Zellen stimuliert.

Zusammenfassung

Effektor-und Gedächtnis-T-Zellen werden durch Entwicklungs Programmierung von naiven Zellen nach Antigenerkennung erzeugt. Wenn die Infektion bis zu 95% der T-Zellen während der Expansionsphase erzeugt gesteuert werden eliminiert (dh., Kontraktionsphase) und Gedächtnis-T-Zellen bleiben, manchmal ein Leben lang. Beim Menschen wurden zwei funktionell unterschiedliche Teilmengen von Gedächtniszellen basierend auf der Expression von Lymphknoten Homing-Rezeptoren beschrieben. Zentralen Gedächtnis-T-Zellen exprimieren CC-Chemokinrezeptor 7 und CD45RO und werden hauptsächlich in T-Zellbereichen von sekundären lymphatischen Organen entfernt. Effektor-Memory-T-Zellen exprimieren CD45RO fehlt CCR7 und Display-Rezeptoren mit Lymphozyten-Homing, um periphere oder entzündeten Geweben verbunden. Effektor-T-Zellen nicht exprimieren entweder CCR7 oder CD45RO aber bei Zusammentreffen mit Antigen produzieren Effektor Zytokine wie Interferon-γ. Interferon-γ Release Assays für die Diagnose der bovinen und humanen Tuberkulose underfassen in erster Linie Effektor und Effektor-Memory-T-Zellantworten. Zentralen Gedächtnis-T-Zell-Antworten von CD4 ⁺ T-Zellen auf die Impfung, andererseits verwendet werden, um die Wirksamkeit des Impfstoffes vorherzusagen, da mit Affen-Immunschwächevirus-Infektion von nicht-menschlichen Primaten, der Tuberkulose bei Mäusen und Malaria in Menschen nachgewiesen. Mehrere Studien an Mäusen und Menschen als auch unveröffentlichte Daten am Rind, haben gezeigt, dass Interferon-γ-ELISPOT-Assays messen zentralen Gedächtnis-T-Zell-Reaktionen. Mit diesem Test werden periphere mononukleäre Blutzellen in abnehmender Konzentration des Antigens für 10 bis 14 Tage (Langzeitkultur), so dass Reaktionen Effektor-zu-Spitze und abnehmen kultiviert; zentralen Speicher T-Zellen zu erleichtern, zu differenzieren und in der Kultur zu erweitern.

Einleitung

Effektor-und Gedächtnis-T-Zellen werden durch Entwicklungs Programmierung von naiven CD4 + T-Zellen nach Antigenerkennung erzeugt. Die Differenzierung von naiven CD4 + T-Zellen in Cytokin-produzierenden Zellen erfordert Pathogenerkennung von Zellen des angeborenen Immunsystems, Antigenpräsentation gegenüber T-Zellen, co-Stimulation und transkriptionale Veränderungen zur polarisierten Cytokinproduktion. Zum Beispiel: Antigen-präsentierende Zellen produzieren Interleukin (IL) -12 in Reaktion auf intrazelluläre Pathogene, die zusammen mit der Antigenerkennung, fördert die Differenzierung von T-Zellen in T-Helfer 1 (Th1) -Zellen ^1,2 durch Signalisierung über Signalwandler und Aktivator Transkriptions 4 (STAT4) und T-Box exprimiert in T-Zellen (T-bet), was zu Zell-Aktivierung, IL-2-Produktion, die klonale Expansion und Interferon (IFN) -γ Herstellung ^3,4. Wenn die Infektion kontrolliert werden bis zu 95% der T-Zellen während der Expansionsphase erzeugt wird beseitigt (dh KontraktionPhase) und Gedächtnis-T-Zellen bleiben, manchmal ein Leben lang ^5. Sallusto et al. ⁶ ergab zwei funktionell unterschiedliche Teilmengen von Gedächtniszellen bei Menschen basierend auf der Expression von Lymphknoten Homing-Rezeptoren. Zentralen Gedächtnis-T-Zellen (TCM) exprimieren CC-Chemokin-Rezeptor (CCR) -7 und CD45RO und werden hauptsächlich in T-Zellbereichen von sekundären lymphatischen Organen entfernt. Tcm haben Effektor-Funktion, eine niedrige Aktivierungsschwelle und behalten hohe IL-2-Produktion und proliferative Kapazität begrenzt. Effektor-Memory-T-Zellen (TEM) auszudrücken CD45RO fehlt CCR7 und Display-Rezeptoren für die Referenzfahrt auf periphere oder entzündeten Geweben. Effektorzellen weder CCR7 oder CD45RO exprimieren aber umgehend produzieren Effektor-Zytokine wie IFN-γ, bei der Antigen-Erkennung.

IFN-γ Release Assays (IGRA) für die Diagnose der bovinen und humanen Tuberkulose ⁷ verwendet. Mycobacterium bovis ist das Hauptmittel der Rindertuberkulose (bTB), während menschliche cases der Tuberkulose werden hauptsächlich durch Mycobacterium tuberculosis verursacht wird. Mit diesen Tests wurde Vollblut oder peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) mit mycobakteriellen Antigene für 16 bis 24 h und IFN-γ Produktion innerhalb der Überstand wird durch ELISA oder durch die Detektion von Zellen, die IFN-γ-ELISPOT-Verwendung Techniken gemessen stimuliert. Als Ergebnis der kurzen Stimulationsperiode (dh., Von 16 bis 24 h) und eine schnelle Produktion von Zytokinen, ex vivo Assays weisen hauptsächlich Effektor- und Tem Antworten. Dies wurde durch durchflusszytometrische Analyse von Zellpopulationen in diesen Kulturen ^8-10 bestätigt.

Ex vivo IFN-γ-Antworten werden routinemäßig im Rahmen der Immunantwort Platte Bewertung der Tuberkulose-Impfstoffe, auch verwendet werden, um Antworten, die von Rindern zu bewerten inbegriffen. Effektivste Rindertuberkulose Impfstoffe entlocken spezifischen IFN-γ-Antworten, aber nicht alle Impfstoffe, die IFN-γ-Antworten induzieren protective. Auch Niveaus von IFN-γ ausgelöst durch Impfung, wie vor der Infektion gemessen wird, müssen nicht korrelieren mit Schutz. Zum Beispiel können verschiedene BCG-Stämme unterschiedliche Kapazitäten aufweisen, um ex vivo IFN-γ-Antwort zu induzieren, trotz ähnlicher Schutzstufen ^11. So sind ex vivo IGRAs wertvoll für Tuberkulose Diagnose und für den Zugriff auf Impfstoff Immunogenität; jedoch ist die Verwendung als Prädiktoren der Impfstoffwirksamkeit begrenzt. Tcm Reaktionen auf die Impfung, andererseits verwendet werden, um die Wirksamkeit des Impfstoffes vorherzusagen, da mit Affen-Immunschwächevirus (SIV) Infektion in nicht-menschlichen Primaten ^12,13, Tuberkulose bei Mäusen ¹⁴ und Malaria bei Menschen ^15,16 demonstriert.

Nach einer effektiven Immunantwort, die Pathogen-Clearance, Tcm beibehalten werden und bieten Schutz für eine eventuelle zweite Infektion mit dem gleichen Mittel. Eine bemerkenswerte Ausnahme zu diesem Szenario ist M. Tuberkulose infeRésol des Menschen, in denen Patienten, die kurative antimykobakteriellen Therapie sind anfällig für Reinfektion ^17,18. Darüber hinaus werden Ereignisse über immunologische Gedächtnis bei chronischen Infektionen, wobei das antigene Stimulation weiterhin besteht, sind nicht gut verstanden ^19. Während chronische Infektionen, wie zum Beispiel mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und Tuberkulose wird eine signifikante Tcm Antwort mit einem positiven Ergebnis (zB Latenz mit Tuberkulose und subklinische Erkrankung mit HIV) ^20,21 verbunden. Mehrere Studien an Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass die Langzeit kultiviert IFN-γ-ELISPOT-Assays messen Tcm Antworten ^16,20-22. Mit diesem Test werden PBMCs in abnehmender Konzentration des Antigens für 10 bis 14 Tage, so dass Reaktionen Effektor-zu-Spitze und abnehmen kultiviert; Erleichterung Tcm zu differenzieren und in der Kultur zu erweitern.

Langzeit-kultivierten IFN-γ-ELISPOT-Assays sind auch in der Veterinärmedizin verwendetForschung, noch der Phänotyp der reagierenden Zellen wurde aufgrund des Fehlens von kritischen Reagenzien, insbesondere eines Antikörpers gegen CCR7 schwer zu beurteilen. Effektive Rindertuberkulose Impfstoffe [eg. Verwendung einer Einzeldosis von M. bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), gefolgt von BCG-Impfstoff-Virus-Antigen vectored 85A Untereinheit oder abgeschwächt M. bovis ΔRD1] entlocken langfristig kultiviert IFN-γ ELISPOT Reaktionen nach der Impfung, die mit dem Schutz korrelieren (dh niedrigere Mykobakterien Belastung und verminderte TB-assoziierten Pathologie) gegen eine nachfolgende Herausforderung mit virulenten M. bovis ^23,24. Weiterhin sind die Anzahlen von Antigen-spezifischen IFN-γ sezernierenden Zellen in der Langzeit PBMC Kulturen höher bei 12 Monaten, jedoch verringern sich mit 24 Monate nach BCG-Impfung von Neugeborenen Kälber, korreliert mit dem Grad der Schutz nachweisbaren Beitrag M. bovis Herausforderung ^25. In diesem Szenario ist das gezüchtete IFN-γ ELISPOT an wichtiges Instrument für die Vorhersage Wirksamkeit des Impfstoffs, ein Mittel, um Impfstoff-Kandidaten für hohe Kostenwirksamkeitsstudien zu priorisieren. Zusätzlich können kultivierte ELISPOT Techniken für verschiedene Wirte, Pathogene und Zytokinen durch Verändern Antigene oder Antikörper für eine Vielzahl von Zwecken in verschiedenen Forschungsbereichen angepasst werden.

Protokoll

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen

1. Vorbereitung komplettem RPMI (cRMPI) durch Zusatz fötalem Rinderserum (FBS) in einer Konzentration von 10% (Volumen / Volumen), Glutamin (2 & mgr; M), Natriumpyruvat (1 uM), nicht-essentiellen Aminosäuren (0,1 uM), Penicillin -streptomycin (100 Einheiten / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin) und 2-Mercaptoethanol (50 mM) in RPMI 1640.
2. Vorbereitung 2 X Säurecitratdextrose durch Mischen Natriumcitrat (77 uM), Zitronensäure (38 uM) und Dextrose (122 uM) in destilliertem Wasser.
3. Vorbereitung Ca ²⁺ Mg ²⁺ freies Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7.2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na ₂ HPO ₄ (dibasisches, 10 mM), KH ₂ PO ₄ (einbasischen, 2 mM) in destilliertem Wasser; den pH-Wert auf 7,2.
4. Vorbereitung PBS 1% (PBS 1% BSA) durch Zugabe von Rinderserumalbumin in PBS (Volumen / Gewicht, 1 g / 100 ml PBS).
5. Vorbereitung PBS + 0,05% Tween 20(PBST) durch Zugabe von 0,05% Tween 20 in PBS (v / v, 500 & mgr; l Tween 20/1 l PBS).
6. Vorzubereiten 100 mM Tris HCL pH 8,2-Puffer durch Mischen Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) in destilliertem Wasser.
7. Vorbereitung 35% Ethanol-Lösung, die durch Verdünnen Ethylalkohol (Reinheit ≥99.5%) in destilliertem Wasser (Volumen / Volumen, 35 ml Ethylalkohol / 100 ml destilliertes Wasser).
8. Filter sterilisieren cRPMI, 2 x Säurecitratdextrose, PBS, PBS 1% BSA mit 0,22 um Filter.

2. Langfristige kultivierten Zellen (14 Day Protocol)

(Tag eins)

1. Bereiten Antigenlösungen mit der doppelten Endkonzentration in cRPMI. Antigen Wahl ist kritisch und sollte für den Zweck der Untersuchung angepaßt werden.
2. Verdünnen rekombinanten M. Tuberkulose-Antigene und Antigen TB10.4 Ag85A bis 2 & mgr; g / ml (jedes Antigens; Endkonzentration von 1 ug / ml).
3. Verdünnter M. bovis gereinigten Proteinderivat(PPD-B, Prionics AG) auf 10 ug / ml (Endkonzentration von 5 ug / ml).
4. Verdünne das rekombinante frühe sekretorische gene Target 6 (ESAT-6) und Kulturfiltrat Protein 10 (CFP-10) Fusionsprotein (Reşat-6: CFP10) bis 2 & mgr; g / ml (Endkonzentration von 1 ug / ml).
   Hinweis: Diese Antigene sind immun IFN-γ induzieren Antigene von tuberkulösen Mykobakterien und eingeschlossen werden, um PBMC von M. stimulieren bovis infizierten Tieren. BCG oder M. bovis ΔRD1 geimpften Tieren nicht zu Reşat-6 reagieren: CFP10, wie die Region diese Antigene kodieren (dh RD1) wird in diesen Stämmen gelöscht. Reşat-6: CFP10 in dieser Studie verwendet wurde, war ein freundliches Geschenk von Dr. C. Minion, Iowa State University. TB10.4 und Antigen Ag85A sind immundominanten Antigene vorhanden in virulent und Impfstoff M. bovis-Stämme ^37. PPDB, als ein gereinigtes Protein-Derivat, ein Komplex aus mehreren Antigene, einschließlich Antigenen mit nicht-tuberkulösen Mycobakterien geteilt. Infec(: TB10.4, Ag 85A, Reşat-6: nämlich CFP10 und PPDB) ted Tiere potenziell auf alle Antigene reagieren, während geimpften Tieren sollte nicht auf Reşat-6 reagieren: CFP10 ^11.
5. Platte 500 ul / Vertiefung Antigenlösung vierfach für jedes Tier in einer 24 Well-Platte. Aus diesem Protokoll, verwenden Antigene als Pool; so nutzen alle Vertiefungen haben alle Antigene und keine Steuerelemente (wie, null oder Mitogen) dieser Schritt. Inkubieren Platte bei 39 ° C / 5% CO _2. Die normale Temperatur des Viehs ist 39 ° C; Daher haben einige Forscher verwenden 39ºC Kultur von Rinderzellen. Auch in bestimmten Fällen mit menschlichen Zellen, Zellkultur bei 39 ° C liefert zusätzlichen Vorteil ^26,30.
6. Vorlast Spritzen mit 6 ml 2 X Säure-Citrat-Dextrose-Verbindung mit 16 oder 18 G Injektionsnadeln; und sammeln Sie 60 ml Rinderblut durch Jugularvenenpunktur.
7. Isolieren PBMC durch Standard Dichtegradientenzentrifugation der peripheren Blut Leukozytenmanschette FraktionenEinstellen der Zellkonzentration auf 4 x 10 ⁶ Zellen / ml, wie durch Maue et al. ²⁷
8. In Zellen (500 ul / Vertiefung) in Antigen vorinstalliert Platte mit 24 Vertiefungen, in vierfacher Ausfertigung für jedes Tier (Schritt 2.5). Inkubieren Platte bei 39 ° C / 5% CO _2.

(Drei bis sieben Tage)

9. Unter Einhaltung steriler Techniken vorsichtig 500 ul des Überstands aus jeder Vertiefung, ohne die Zellschicht zu stören.
10. Aufzufüllen Vertiefungsvolumen durch Zugabe von 500 ul / Vertiefung cRPMI enthaltenden IL-2 (30 U / & mgr; l, das heißt, 15 U / well rekombinantes humanes IL-2 Sigma I7908). Inkubieren Platte bei 39 ° C / 5% CO _2.

(Tage 10 und 12)

11. Unter Einhaltung steriler Techniken zu entfernen 750 & mgr; l Überstand aus jeder Vertiefung. Tanken Sie die Lautstärke mit 750 ul / Vertiefung cRPMI (ohne IL-2). Inkubieren Platte bei 39 ° C / 5% CO _2.

3. ELISPOT Assay (Three Day Protocol)

(Tag eins (12 ^th Tag der Langzeitkultur-Protokoll))

1. Beschriften Sie die ELISPOT Platte richtig für jeden Probensatz, um Fehler zu vermeiden, wenn Plattierzellen: Langzeit-Zellen plus Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), Langzeit-Zellen ohne APCs und ex vivo / kurzfristige Zellen (Abbildung 1). Wiederholungen für jede Behandlung (dh antigene Stimulation) sollte mindestens in zweifacher Ausführung durchgeführt werden.
2. Vorbereitung Einfangantikörper durch Verdünnen Maus-anti-Rinder-IFN-γ-Antikörper (MCA2112 Klon CC330) in PBS (8 & mgr; g / ml).
3. Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette vorbefeuchtende die Vertiefungen der ELISPOT-Platte mit 15 ul / Vertiefung von 35% Ethanol für 1 min. Membranschäden zu vermeiden, den Boden der Wells mit Pipettenspitzen berühren Sie nicht zu jedem Zeitpunkt während des Tests.
4. Waschplatte sechsmal mit 300 ul / Vertiefung PBS. Waschflüssigkeit sollte Platte Inversion verworfen werden. Wäschen sollte rasch erfolgen, ohne dass sich Plattenvertiefungen, um zu trocknen.
5. Je 100 & mgr; l / Vertiefung von Erfassungs anti-IFN-γ-Antikörper (aus Schritt 1 oben). Inkubieren bei 4 ° CO / N (halten Sie die Platte in einer Aufbewahrungstasche mit Reißverschluss).

(Zwei Day ^(13. Tag der Langzeitkultur-Protokoll))

6. Bereiten Antigenlösungen mit der doppelten Endkonzentration. Behandlungen sind: keine Stimulation (cRPMI), PPD-B (20 ug / ml, Endkonzentration: 10 ug / ml), Proteincocktail TB10.4 und Ag85A (2 ug / ml von jedem Protein, Endkonzentration: 1 ug / ml eines jeden Proteins) Reşat-6: CFP10 (von M. bovis-Infektion, 2 ug / ml, Endkonzentration: 1 ug / ml), und einer positiven Kontrolle, wie Pokeweed (20 ug / ml, Endkonzentration: 10 ug / ml). Andere Mitogen anstelle PWM (zB Concanavalin A) verwendet werden.
   HINWEIS: Für diesen Schritt Antigene komponieren vier verschiedenen Behandlungen und sind not verwendet als Pool (wie in Schritt 2.5). Die vier Behandlungen sind: NS, PPDB, Protein-Cocktail (TB10.4 und Ag85A bilden eine Behandlung) und PWM.

4. Kurzfristige Zellkultur und adhärenten Zell (APCs) Isolierung

1. Sammeln Sie 60 ml Blut aus den gleichen Tieren an Tag 1 (unter: Langzeitkultur, 14 Tage-Protokoll) Blut entnommen und zu isolieren PBMCs wie zuvor.
2. Einzustellen Zellkonzentration auf 2 × 10 ⁶ Zellen / ml. Label Rohre eindeutig Fehlallokationen zu vermeiden, wenn Plattierzellen. Diese Zellen werden für APCs Isolierung verwendet werden und auch als Kurzzeitzellkultur (Schritt 6.5). Etikett Rohre sowohl mit der Nummer des Tieres und der Art der Kultur (in diesem Fall: ex vivo, kurzfristige oder frische Zellen).
3. Entfernen Sie überschüssiges Capture-Antikörper aus der ELISPOT durch Platte Inversion. 6 mal mit 300 ul PBST Waschplatten.
4. Entfernen Sie so viel wie möglich PBST. Je 50 ul der Zellsuspensionen in die Vertiefungen als langfristige Zellen plus APCs markiert. Block anderen wells mit 200 ul / Vertiefung cRPMI. Inkubieren Sie 90 Minuten bei 39 ^° C oder Pre-warmen cRPMI oder 39 ^° C (für die nachfolgenden Schritte erforderlich). Frische PBMCs nicht adhärenten Zell (APCs) Isolierung verwendet wird in nachfolgenden Schritten benötigt werden und gespeichert werden.

5. kultivierten Zellen

1. Während der 90-minütigen Inkubation (Schritt 4.4, Kurzzeitkultur und adhärenten Zellisolierungsschritt), Ernte langfristig kultivierten Zellen.
2. Unter Verwendung von 5 oder 10 & mgr; Pipetten, Pipetten Medien mit Zellen nach oben und unten, um Zellen zu lösen, verbinden die vierfacher Wiederholungen von jedem Tier zu einem einzigen 15-ml-Tube. Zentrifugieren der Röhrchen 5 Minuten bei 400 g.
3. Nach dem Zentrifugieren den Überstand verwerfen durch Rohr Inversion. Verdrängen Zellpellet. 5 ml PBS vorsichtig resuspendieren Pellet, falls erforderlich. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Überstand verwerfen mit der U-Inversion und sanft resuspendieren Zellen in 1 ml cRPMI. Passen Zellkonzentrationbis 2 × 10 ⁵ Zellen / ml.

6. Plating Frisch und Cultured PBMCs

1. Nach 90 min Inkubation, schütteln Platten auf Plattenschüttler für 30 Sekunden. Entfernen Sie nicht anhaftende Zellen durch Platte Inversion. Pipette 150 ul / Vertiefung warmen cRPMI (aus Schritt 4, unter: Kurzfristige Zellen und adhärenten Zell (APCs) Isolationsschritt).
2. Schütteln Sie Platten und entsorgen Waschflüssigkeit. Wiederholen Sie 3x waschen. Geben Sie 100 ul / Vertiefung jedes Antigen in die entsprechenden Wells (pre-markierten).
3. Um Zellen Platte Pipette 100 ul / Vertiefung der langfristigen kultivierten Zellsuspension (2 x 10 ⁵ Zellen / ml) in die Vertiefungen als langfristige Zellen plus APCs markiert. Sicherzustellen, dass die Langzeit-Zellen in diesem Schritt hinzugefügt werden, aus dem gleichen Tier wie der APC ist schon in dem Bohrloch. Mischen Sie nicht von APC und langfristige kultivierten Zellen von verschiedenen Tieren.
4. Je 100 & mgr; l / Vertiefung des Langzeit kultivierten Zellsuspension (2 x 10 ⁵ Zellen / ml) in Vertiefungen ohne APCs für die Beurteilung der APC Anforderung an die Langzeitkultur Antwort.
5. Fügen Sie 100 ul / Vertiefung von kurzfristigen Zellen (frisch isolierte und auf 2 × 10 ⁶ Zellen / ml eingestellt) für Ex-vivo-Reaktion Beurteilung. Platten O / N Inkubieren bei 39 ^° C / 5% CO ₂ -Inkubator. Stellen Sie sicher, dass die Platten flach und nicht Platten stapeln.
   HINWEIS: Wenn eine Analyse der Zell-Phänotyp gewünscht wird, Durchflusszytometrie als Neben Assay durchgeführt werden. Zellen werden in 96-Loch U-Boden-Platten (anstatt ELISPOT-Platten) wie für ELISPOT-Assay beschrieben plattiert. Einfangantikörper Adsorption (Schritte 3,4-3,5) übersprungen werden sollte. Zellen werden dann inkubiert, O / N bei 39 ° C / 5% CO 2 durchgeführt und eine Standardzelle Färbeprotokoll. Zellfärbung Reagenzien sind in den Reagenzien Tabelle enthalten.

Drei Tage ^(14. Tag der Langzeitkultur-Protokoll)

6. Verdünnen Nachweis-Antikörper (Maus-Anti-Rinder-IFN-γ, Klon CC302) zu 5 & mgr; g / ml in PBS 1% BSA. Verwerfen Flüssigkeiten aus den Vertiefungen und Waschplatten: sechsmal mit PBST (300 ul / Vertiefung), indem auf einem Schüttler jedesmal für 10 Sekunden vor und zwischen wäscht einmal mit dH ₂ O (300 ul / Vertiefung), weitere 6 Male mit PBST (300 ul / Vertiefung) und zweimal mit PBS (300 ul / Vertiefung). Nachdem die Zellen von den Platten entfernt, und wenn keine biologischen Sicherheit Bedenken gelten, Verfahren außerhalb biologische Sicherheitswerkbänke durchgeführt werden.
7. Discard Waschflüssigkeit. Entfernen Sie so viel Waschwasser wie möglich durch Tippen auf Platte auf Papierhandtücher. Hinzuzufügen Nachweisantikörper (100 ul / Vertiefung).
8. Inkubation erfolgt während 120 min bei 39 ^° C oder Während dieser Inkubation Schritt vorzubereiten alkalische Phosphatase-Lösung nach Herstelleranweisungen. Dreißig Minuten vor der Anwendung (das heißt, 90 min nach Zugabe des Detektionsantikörpers an Wells) verdünnt das Reagenz in PBST. Kehren Sie die Röhre vorsichtig, um Reagenzien zu mischen und bei RT inkubiert.
9. Nachdem der 120 min Inkubation verwerfen überschüssige Detektions-Antikörper durch Platte Inversion. Waschplatte 6 mal mit PBST (300 ul / Vertiefung). Entfernen Sie so viel Waschwasser wie möglich durch Tippen auf Platte auf Papierhandtücher.
10. Füge 100 ul / Vertiefung von mit alkalischer Phosphatase-Lösung (Schritt 3 oben). Inkubation erfolgt für 45 Minuten bei RT. Entsorgen Flüssigkeit und waschen jeder Platte 6 mal mit PBST (300 ul / Vertiefung).
11. Bereiten Sie die Substratlösung nach den Anweisungen des Herstellers (Vector Blau AP Substrat III): Verdünnen Reagenzien in 100 mM Tris-HCl pH 8,2 Puffer. Je 50 & mgr; l / Well der Substratlösung.
12. Inkubation bei RT bis blaue Farbe beginnt (ca. 30 min) zu entwickeln. Entsorgen Flüssigkeit und Waschplatten mit reichlich dH ₂ O. Bodenplatte entfernen, um Membran freizulegen, zurück von Brunnen waschen und lassen Sie die Platte an der Luft trocknen.
13. Lesen Platten auf immunospot Bildanalysator oder ELISPOT-Lesegerät (Tabelle 1), oder manuell mit Hilfe eines Stereomikroskops. Alternativ halten Plattenin Dunkelheit bei RT bis zum Lesen. Aufgrund der hohen Stabilität des Reaktionssubstrats ist Qualität für mehrere Jahre haltbar.
    Hinweis: Zellen und Antigen-Konzentrationen wurden optimiert, um Vertiefungen mit unzähligen Flecken ^23,24,27,37 vermeiden. Es ist möglich, dass unzählige Flecken-Bildung in verschiedenen Einstellungen oder durch biologische Variabilität auftritt. Wenn das der Fall ist, sollte die Zellkonzentration optimiert, eine lesbare Antwort Punktzählung erhalten werden.

7. Platten Lesen und Datenanalyse

1. Führen Analyse nach der Cellular Technology Limited (CTL) ELISPOT-Plattenleseführung (Tabelle 1). Nachdem die Flecken Zählungen werden für jede der Vertiefungen erhalten, die Berechnung der Mittelwert zwischen Duplikate. Die spezifische Immunantwort auf jedes antigene Stimulus wird durch Subtrahieren der durchschnittlichen Anzahl von Punkten in nicht-stimulierten Vertiefungen von der Antigen-stimulierten Vertiefungen berechnet.

Ergebnisse

Etwa ein Monat nach der Aerosol-Infektion mit M. bovis (10 ⁴ koloniebildende Einheiten), die von infizierten PBMCs (n = 8) und Kontrolltiere (n = 8) wurden in Gegenwart von Antigenen und IL-2 für 13 Tage kultiviert. Entwicklung der TCM Reaktionen nach der Infektion wurde mit IFN-γ ELISPOT-Assay bestimmt. Vertreter TCM (in der Gegenwart oder Abwesenheit von APCs) und ex vivo IFN-γ ELISPOT Antworten von infizierten Tieren (drei Tiere) und einem nicht infizierten Tier (ein Tier) sind in Abbildung 1 dargestellt. Eine langfristig erfolgreiche IFN-γ ELISPOT-Assay führt zu Zellen, die IFN-γ (Spot-bildenden Zellen, SFC) unter stimulierten Bedingungen und das fast vollständige Fehlen einer Antwort von nicht-infizierten Tiere und unter nicht-stimulierten Bedingungen. Ferner sollte eine starke T-Zell-Antwort in Reaktion auf PWM auftreten. Spezifische Reaktionen auf M. CFP10 Antigenstimulation: bovis wurden von PPD-B oder Reşat-6 bewertet. Wie in Abbildung gezeigt1, robust Tcm und Ex-vivo-Reaktionen auf PPD-B und Reşat-6: CFP10 wurden von allen drei M. erkannt bovis infizierten Tieren. Minimale bis keine Tcm und ex vivo-Antworten wurden aus dem Kontrolltier nachgewiesen. Außerdem wurde die Anwesenheit von APCs für eine optimale Tcm Antworten durch infizierte Tiere erforderlich ist, wie durch eine stark eingeschränkte Antworten nachgewiesen durch lange Zellen in Abwesenheit von autologen APCs kultiviert. IFN-γ Antwort durch PBMCs von M. bovis infizierten und nicht-infizierten Tiere sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Anzahl der SFCs von jedem Tier wurde als die durchschnittliche Anzahl der SFCs in doppelten Proben in Reaktion auf PPD-B minus der jeweiligen Reaktion auf Medium allein berechnet. Die Antworten wurden für 10 ⁶ Zellen geschätzt. Reaktionen unterschieden (P <0,05), basierend auf den Infektionsstatus, der Anwesenheit oder Abwesenheit von APCs und Kulturdauer (dh., Die Langzeitkultur gegen ex vivo-Kultur).

Erfassen von Bildplatten
1.	Stellen Sie das Gerät
2.	Open "Immuno-Capture" Version 6.3 Software.
3.	Schritt 1: Wählen Plattentyp.
4.	Schritt 2: Lastplatte.
5.	Schritt 3: Wählen Sie die Scanoptionen.
6.	Schritt 4: Starten des Prüfvorgangs.
7.	Erhalten Sie Übersichtsbild der Platte.
8.	Auswurfplatte.
9.	Beenden Sie Software "Immuno-Capture".
Zählen der Spot-bildenden Einheiten
1.	Öffnen Sie "Immuno Spot-Aufnahme" 5.0 Software Version.
2.	Wählen objec t-Art: Normales.
3.	Wählen Zählmodul: smart Zahl.
4.	Schritt 1: Lastplatte.
5.	Schritt 2: Definieren Zählen Parameter: Testgenauigkeit von Spot-Erkennung auf Wells mit verschiedenen Spots.
6.	Starten Sie Autozahl.
Qualitätskontrolle
1.	Open "Immunospot Aufnahme" Version 5.0 Software.
2.	Wählen Zählmodul: Qualitätskontrolle.
3.	Schritt 1: Lastplatte.
4.	Schritt 2: Analysieren markierten Wells einzeln.
5.	Beenden Sie die Qualitätskontrolle.

Tabelle 1 - Autoimmun Diagnostika ELISPOT Bildleser Erwerb und Zellzählung Verfahren.

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Abbildung 1. Bild von Brunnen aus einer langfristigen kultiviert IFN-γ ELISPOT-Assay. Cultured IFN-γ ELISPOT-Assay wurde approximatelyone Monat nach der Herausforderung mit virulenten M. durchgeführt bovis (drei Tiere). Nicht-infizierten Tiere wurden als Kontrollen (ein Tier) enthalten Langzeitzelllinien wurden durch Stimulation PBMC mit einem Cocktail von rekombinanten Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml) generiert, Reşat-6.: CFP10 (1 ug / ml) und PPD-B (5 & mgr; g / ml) für 13 Tage, gefolgt von Transfer auf ELISPOT-Platten in Gegenwart oder Abwesenheit von autologen APC. Kurzfristige Zellen bestand aus PBMC isoliert am Tag 13 und direkt in ELISPOT Platten plattiert. Langfristige und kurzfristige Zellen wurden mit PPD-B (10 ug / ml), Reşat-6 stimuliert: CFP10 (1 ug / ml), Medium allein oder Kermesbeerenmitogen (5 &# 956; g / ml) für 24 h.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus einer langfristigen kultiviert IFN-γ ELISPOT Reaktion auf M. bovis gereinigtes Proteinderivat (PPD-B). Cultured IFN-γELISPOT Assay wurde approximatelyone Monat nach der Herausforderung mit virulenten M. durchgeführt bovis (acht Tiere). Nicht-infizierte Tiere wurden als Kontrollen eingeschlossen (acht Tiere Langzeit Zellen wurden durch Stimulation PBMC mit einem Cocktail von rekombinanten Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml), erzeugt Reşat-6: CFP10 (1 ug / ml) und PPD-B (5 & mgr; g / ml) für 13 Tage, gefolgt von Transfer auf ELISPOT-Platten in Gegenwart oder Abwesenheit von autologen APCs. Kurzfristige Zellen bestand aus PBMC isoliert am Tag 13 und direkt in den ELISPOT-Platte plattiert . Die langfristigen und short Zeit Zellen wurden mit PPD-B (10 ug / ml) oder nur Medium für 24 h stimuliert. Spezifische Reaktionen von jedem Tier (SFC / 10 ⁶ Zellen) als Reaktion auf PPD-B (Durchschnitt von Doppelproben) minus der Reaktion auf die Medien einzeln aufgemacht.

Diskussion

IFN-γ-Produktion in Langzeit kultiviert ELISPOT Assays ist im Allgemeinen auf Tcm beim Menschen, aber wie dieser Reaktion entwickelt sich in Kultur ist schlecht verstanden. Ob Tcm im Umlauf sind vorhanden und in vitro zu erweitern, oder wenn das TCM Reaktionen entstehen durch Differenzierung von Effektorzellen und Tem Zellen in Tcm während der Kultur, ist nicht bekannt. Jedoch Untersuchungen mit Proben, die von Menschen haben gezeigt, dass CD4 ⁺ -T-Zellen aus ex vivo und langfristig kultiviert IFN-γ-ELISPOT-Assays nicht verwandten Epitop-Spezifitäten, was impliziert, dass Tcm Reaktionen nicht von Effektorzellen ²⁸ zu entwickeln. Offensichtlich kann die Dauer der Reaktion variieren, aber wenn Pathogen Clearance erreicht wird, was schließlich sowohl ex vivo als auch Tcm Reaktionen sinken. Auch Reaktionen der Langzeitkulturen frühe und lange nach Antigen Grundierung gemessen (wenn die Effektorantwort niedriger ist) gezeigt, um zu korrelieren, was anzeigt, dass zirkulierende Tcm Populationen frühe und lange nach Antigenen Priming bezogen bleibt in vivo. Andererseits ist der Betrag der ex vivo Ansprechen anscheinend nicht auf die Grße des Speichers als Reaktion ²⁹ bezogen werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Langzeit kultiviert IFN-γ ELISPOT Reaktionen resultieren aus in vitro-Expansion der TCM und einer zugehörigen Schwinden Effektor Reaktionen in der Probe anstelle der Differenzierung von Effektorzellen in Tcm Phänotyp.

Bei Rindern wird der relative Beitrag von Effektorzellen und Gedächtnisteilmengen, um Antworten von den Langzeit-IFN-γ-ELISPOT-Assays nachgewiesen nicht bekannt. Aktuelle Studien zeigen einen Zusammenhang zwischen Impfstoff rief langfristig kultiviert IFN-γ ELISPOT Antworten und Schutz gegen anschließende experimentelle Infektion mit M. bovis ^23-24. Es wurde berichtet, dass schwache langfristig IFN-γ-ELISPOT-Reaktionen auf die Impfung mit dem Fehlen von Schutz ³⁰ zugeordnet. Beide leben und zu töten,ed-Impfstoffe induzieren ähnliche ex vivo IFN-γ ELISPOT Antworten, aber die Impfung mit lebenden BCG entlockt stärker langfristige kultiviert IFN-γ ELISPOT Antworten als nicht getötet Impfstoffzubereitungen. Interessanterweise sind Lebendimpfstoffe Schutz während getötet Formulierungen scheitern, um Schutz gegen Herausforderung mit virulenten tuberkulösen Mykobakterien ^{31-32, 33} bereitzustellen.

Bewertung der Tcm Reaktionen ist auch denkbar, ordnen diese Zellen aus PBMC. Direkt Anreicherung Tcm aus PBMC erfordert jedoch teure Geräte, hoch ausgebildetes Personal, und es ist schwierig, da diese Zellen nicht zahlreich in den Blutstrom. Langfristige Kultur von PBMC bietet Anreicherung Tcm über Tem und Effektorzellen ohne teure Vorrichtungen; Da diese T-Zellpopulationen in vitro expandiert sie weniger repräsentativ für in vivo Speicherantworten sein. Es ist möglich, IFN-γ Speicherantworten zuzugreifen (unter Verwendung der Langzeitkultur oder Tcm Sortiering Strategien) mit Ausnahme des ELISPOT Assays wie: Zytokin-ELISAs ^34, Cytokin Perlenanordnungen (CBA), die intrazelluläre Färbung (ICS) oder Zytokin Proteinarrays (CPA). Diese Methoden; sind jedoch im allgemeinen weniger empfindlich als ELISPOT-Tests ^35.

Ein Vorteil der ELISPOT ist seine Fähigkeit, die sofortige Erfassung des Zytokins kurz nach seiner Freigabeverhinderungs Verdünnung im Überstand und den Abbau durch enzymatische Spaltung oder Zytokin Aufnahme von anderen Zellen erkennen. ELISPOT-Tests erkennen einzelne Zellen produzieren Zytokine eine präzise Ergebnisse auch bei schlechten Signal-Rausch-Szenarien (dh niedrige spezifische Antworten) ^35. Auch mit ICS, Erkennung von vor der Freigabe Cytokine können in falscher Identifizierung von Zellen, Zytokinen führen (z. B. aufgrund von posttranslationalen Modulation vor oder während des sekretorischen Prozesses) ^34. Die mit ICS-Assays zu Zytokinsekretion zu minimieren beschäftigt Transportinhibitorenwährend der Antigen-Stimulation (wie Golgi Anschlag Proteine ​​bekannt) begrenzen die Dauer der Zellstimulation durch die Zelltoxizität dieser Proteine ​​letztlich Auswirkungen auf die Cytokin-Produktion ^35.

Mit gesagtem - CBA, CPA und ICS und nützliche Techniken zum Messen mehrerer Cytokine gleichzeitig und / oder zur Bestimmung von Zelloberflächenmarker-Expression (dh mit ICS.). Deshalb können diese Verfahren in Kombination mit dem IFN-γ-ELISPOT-Assay ³⁶ verwendet werden. Während frühere bovine TB-Impfstoffwirksamkeitsstudien gemessen Tcm Antworten via ELISPOT-Assay wird die Detektion von Tcm Reaktionen durch andere Techniken wahrscheinlich ergeben vergleichbare Ergebnisse. Wichtiger ist, der ELISPOT-Assay billiger und einfacher durchzuführen als CBA, CPA und ICS Analyseverfahren ^34. Manuelles Zählen der SFC ist eine Alternative zur automatischen Zählung und ELISPOT Platten können bei RT langen Zeitraum ohne Qualitätsverlust gelagert werden, vor oder nach der Stelle contage ^37.

Die langfristige kultiviert IFN-γ ELISPOT Reaktion wurde angelegt, um Speicherantworten von Mensch, Rind und bei der Auswertung zu bewerten Impfstoff gegen Tuberkulose Antworten ^{14-16,31-32,33.} Tcm Antworten werden auch angenommen, um eine bedeutende Rolle in Wirtsreaktionen auf mehrere andere Infektionserreger von Rindern, wie zu spielen:. Mycoplasma mycoides subsp mycoides ^42, Anaplasma marginale ³⁸ und Rinder Respiratory Syncytial Virus ^39. Potentiell könnte die Langzeit ELISPOT-Assay für andere Spezies, Zytokine und Infektionen angepasst werden. Diese breitere Anwendungen wird besonders nützlich für die veterinärmedizinischer Immunologie Anwendungen wegen der gegenwärtigen begrenzten Verfügbarkeit von spezifischen Reagenzien können.

Tcm Antworten sind von entscheidender Bedeutung für den Schutz gegen mehrere Infektionen, aber frühe Mess sie nach der Infektion / Impfung (zum Krankheitsverlauf Vorhersage oder die Wirksamkeit des Impfstoffes) may umständlich. Analyse der Immunantwort unter ex vivo und kurze antigene Stimulation Bedingungen häufiger vertreten Effektor Antworten aufgrund der Überlappung der Speicher und Effektor-Antworten, insbesondere zu Beginn der immunologischen Gedächtnisbildung. Im Rahmen der chronischen Krankheiten, bei denen die Antigenbelastung kontinuierliche wird ex vivo-Antworten Effektor-Zell-Antworten oder eine Kombination von Speicher und Effektor-Zell-Antworten zu bewerten. Die langfristige kultiviert IFN-γ-ELISPOT-Assays hier beschrieben, wahrscheinlicher wird die Messung des Tcm Reaktionen statt Effektorzellen T-Zelle oder kombiniert CD4 ⁺ T-Zell-Antworten. Zusammenfassend stellt die Langzeit kultiviert IFN-γ-ELISPOT-Assay ein wertvoller Ansatz zur Schätzung der Zellenspeicherantworten T und wurde erfolgreich eingesetzt, um Speicherantworten mehrerer Arten in eine Vielzahl von Infektionen Mittel auszuwerten ^{12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Natriumcitrat (Dihydrat)	Verschiedenes
Zitronensäure (Monohydrat)	Verschiedenes
Dextrose	Verschiedenes ELISPOT
PVDF Platten	Verschiedenes
Vectastain ABC – AP KIT Standard	Vector Laboratories	AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-5300
Ag85A	Lionex	LRP-0004.3	23, 24, 25, 37
TB 10.4	Lionex	LRP-0061.6	23, 24, 25, 37
PPDb	Prionics AG	7600055
rESAT-6:CFP10	Freundliches Geschenk Dr. Minion, Iastate		23, 24, 25, 27,  37
Maus Anti-Rinder-IFN-& gamma; Klon CC302	Serotec	MCA1783B	23, 24, 25, 27,  37
Maus anti-bovine IFN-  Biotinylierter Klon CC330	Serotec	MCA2112	23, 24, 25, 27,  37
Maus Anti-Rinder CD4 Klon CC8	Serotec	MCA1653GA
Maus Anti-Rinder CD45RO Klon IL116A	Serotec	MCA2434GA
Ratte Anti-Mensch CCR7 Klon 3D12	Abcam	ab95665
Maus Anti-Rinder IFN-γ-Pe Klon CC302	Serotec MCA1783PE
Ziege Anti-Maus IgG2a- Alexa Fluor 350	Invitrogen	A-21130
Ziege Anti-Maus IgG3 APC-CY7	SouthernBiotechnology	1080-193
Ziege Anti-Ratte IgG-APC	Invitrogen	A10540
BD Cytofix/Cytoperm™	BD Biosciences	554714
BrefeldinA	Sigma-Aldrich	B7651
Pokeweed Mitogen	Sigma-Aldrich	L8777
Rekombinat humanes Interleukin 2	Sigma-Aldrich	I7908