Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening Coxiella burnetii Transposon-Mutanten

Die Schwellen, endemische Bakterium Coxiella burnetii ist für große Ausbrüche von Q-Fieber, eine schwächende Grippe-ähnliche Zoonose mit schweren gesundheitlichen und wirtschaftlichen Auswirkungen ¹ verantwortlich. Die wichtigsten Lagerstätten von Coxiella sind Haus- und Nutztieren, und es wird geschätzt, dass mehr als 90% der Milchviehhaltung in den USA durchzuführen C. burnetii ^2. Der Mensch ist ein versehentliches Hosts, die durch Inhalation kontaminierter Aerosole infiziert sind. Menschen Q-Fieber manifestiert entweder als akute oder chronische Krankheit, die tödlichen Komplikationen mit einer Mortalitätsrate erreichte 65% ^1,3 haben. Mit einer infektiösen Dosis von 1 - 10 Organismen ist Coxiella das infektiöse Pathogen bekannt und es hat sich als potentielle biologische Waffe ⁴ untersucht worden. Die jüngste explosive Ausbruch von Q-Fieber in den Niederlanden (2007 - 2010), mit Fällen Eskalation von 182 auf mehr als 2.000 pro Jahr, steht als Beispiel für die schwere Virulenz des Erregers^5.

Die bemerkenswerte Effizienz Coxiella Infektionen wird wahrscheinlich mit seiner Resistenz gegen Umweltstress, kombiniert mit seiner einzigartigen Anpassung an Wirtszellen verbunden. Tatsächlich ist Coxiella in der Umgebung, in der Form von metabolisch inaktiven kleinzelligem Varianten (SCV), das bemerkenswert beständig gegenüber mehreren harten Bedingungen (Austrocknung, Temperatur, etc.) vorhanden sind. SCVs werden von Fresszellen via α _V β ₃ Integrin ⁶ genommen, während Invasion nicht-Fresszellen wird durch die Coxiella Adhäsion / Invasion OmpA ⁷ und einer noch nicht identifizierten Rezeptor vermittelt. Im Anschluss an die Aufnahme, wohnt Coxiella in eng anliegenden Vakuolen, positiv für den frühen endosomalen Marker Rab5 und EEA1 ^8. Bakterien reagieren auf endosomalen Ansäuerung durch die Umstellung auf metabolisch aktiven großen Zellvarianten (leichte Nutzfahrzeuge) und Aktivieren eines Dot / Icm Sekretionssystem vom Typ 4 (T4SS) ⁹, Hoch homolog zu der Legionella pneumophila ^10. Die Sekretion von Dot / Icm Effektoren ermöglichen Coxiella, um eine große, LAMP1-positive sauren Raum mit aktiven lysosomalen Enzymen in denen sich Bakterien gedeihen können und aktiv infizierte Zellen vor Apoptose ¹¹ zu erzeugen. Daher wird die intrazelluläre Zyklus Coxiella vom Dot / Icm vermittelte bakterielle Translokation Effektoren ¹² gesteuert werden jedoch die mikrobielle Faktoren in Wirtszellinvasion, bakterielle Replikation und Verbreitung der Infektion beteiligt sind heute noch weitgehend unbekannt.

Kombinieren Transposon-Mutagenese und Fluoreszenz-basierte Assays, entwickeln wir unvoreingenommene Ansätze zur gleichzeitigen Identifizierung von bakteriellen Faktoren in den Hauptschritten des Coxiella Infektionen beteiligt: ​​1) Internalisierung in Wirtszellen, 2) die intrazelluläre Replikation, 3) Zelle-zu-Zell-Ausbreitung und 4) Ausdauer. Bis heute haben wir mehr als 1.000 m geschirmtutations in 500 Coxiella kodierenden Sequenzen, die uns mit noch nie da gewesenen Einblick in die Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Coxiella Pathogenese ⁷ zu regulieren. Zu beachten ist, kann dieser Ansatz auf die Untersuchung von anderen intrazellulären Krankheitserreger, die Zellbiologie Funktionen mit Coxiella gemeinsam angewendet werden.

1. Erzeugung einer Bibliothek von GFP-markierten Coxiella Transposonmutanten

Manipulieren Coxiella burnetii RSA439 NMII in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) in einer mikrobiellen Sicherheitsschrank (MSC) in Übereinstimmung mit den lokalen Vorschriften. Wenn mit der Bakterienmodell kompatibel, wiederholen Sie die Schritte von 1.4.1 auf 1.4.4 die Wahrscheinlichkeit, klonalen Mutanten zu erhöhen. Eine typische Mutantenbibliothek besteht (mindestens) einer Reihe von Mutanten, die gleich dem Dreifachen der Anzahl von kodierenden Sequenzen in das Genom des Organismus bezeichnet ist.

1. Herstellung von elektro Coxiella RSA439 NMII:
   1. 1fach ACCM-2 ^13: 13,4 mM Zitronensäure, 16,1 mM Natriumcitrat, 3,67 mM Kaliumphosphat, 1 mM Magnesiumchlorid, 0,02 mM Calciumchlorid, 0,01 mM Eisensulfat, 125,4 mM Natriumchlorid, 1,5 mM L-Cystein, 0,1 g / L Bacto Neopeptone, 2,5 g / L Casaminosäuren, 1 g / l Methyl-beta-cyclodextrin, 125 ml / l RPMI. Der pH-Wert auf 4,75 und Filter zu sterilisieren (nicht im Autoklaven). Hinweis: Flüssigkeit ACCM-2 ist für ca. 1 Monat bei 4 ° C stabil.
   2. Inokulieren von 100 ml ACCM-2 mit 2 x 10 ⁶ Genom-Äquivalent (GE) / ml von Coxiella RSA439 NMII (aus einer Bakterien Lager zuvor erzeugt und, wie in Schritt 1.5 quantifiziert) von -80 ° C Aktien und verteilen die Bakteriensuspension in 75 cm ² Zellkulturflaschen mit belüfteten Kappen (10-15 ml Bakteriensuspension pro Kolben). Wachsen für 7 Tage bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ und 2,5% O _2.
   3. Bündeln die resultierende Bakteriensuspension in 50 ml Tuben und Zentrifuge bei 3.900 × g für 1 h bei 4 ° C.
   4. Überstand verwerfen und das Pellet in 30 ml 10% Glycerin. Zentrifuge bei 3.900 × g für 1 h bei 4 ° C.
   5. Resuspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von 10% Glyzerin (typischerweise 2 ml) und 50 ul Aliquots in 500 ul Röhrchen. Halten Sie resuspendierten bacteria auf Eis während des gesamten Prozesses. Anmerkung: In diesem Stadium sind Bakterien elektro und ein Teil wird ausreichen, um eine Elektroporation auszuführen. Die Bakteriensuspensionen können bei -80 ° C für 6 Monate gelagert werden oder direkt für die Elektroporation von Plasmid-DNA verwendet werden.
2. Elektroporation von zuständigen Coxiella mit transposon- und Transposase-kodierende Plasmide:
   Anmerkung: Für den folgenden Protokolls sind transposable Element und das Transposase von zwei verschiedenen Plasmiden codiert (PITR-CAT-GFP und pUC19-Himar1C9 bezeichnet) ^7. Beide Plasmide fehlt Coxiella spezifische Replikationsursprung, wodurch sie Selbstmord Plasmide, wenn sie in Coxiella elektroporiert. Dies stellt sicher, stabil Transposoninsertionen. Das transposable Element eine Chloramphenicol-Resistenzkassette unter der Regulation des Promotors Coxiella p1169 für die Selektion und das GFP-Gen unter der Regulation des Promotors Coxiella p311, die erzeugten Mutanten mit GFP zu markieren.
   1. PrE-kühlen ein 0,1 cm Elektroporationsküvette für 10 Minuten auf Eis. Mischungs 50 ul elektrokompetente Coxiella mit 10 ug Transposon-Plasmid und 10 & mgr; g Plasmid-Transposase ^7. Sicherzustellen, dass Plasmid Konzentration höher als 500 ug / ml der Verdünnung des Glycerins zu minimieren.
   2. Elektroporieren mit dem folgenden Aufbau: 18 kV, 500 Ω, 25 & mgr; F. Sicherzustellen, daß die resultierende Zeitkonstante ist zwischen 9 und 13 msec liegt.
   3. Sofort im 950 & mgr; l RPMI, Resuspendieren der Elektroporation von Bakterien und Transfer zu einem Schraubverschluss Rohr und halten bei Raumtemperatur.
   4. Oder 200 & mgr; l der Bakterien elektroporiert und in den 3 ml ACCM-2 mit 1% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) in 6-Well-Platten. Hinzuzufügen 88 ul DMSO zu dem verbleibenden Volumen von elektroporiert Bakterien und bei -80 ° C (bis zu einer Endkonzentration von 10% DMSO zu erreichen).
3. Auswahl der Transposon-Mutanten:
   1. Incubate der 6-Well-Platten, wie oben (1.2.4) beschrieben, über Nacht bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ und 2,5% O _2. Fügen Sie die entsprechenden Antibiotika (375 ug / ml Kanamycin oder 3 ug / ml Chloramphenicol). Inkubieren der Bakterienkultur für 3 weitere Tage in den oben beschriebenen Bedingungen.
4. Isolierung von Einzelmutanten:
   1. Herstellung der festen ACCM-2-Platten und Beschichtung von Coxiella Transposon-Mutanten
      Hinweis: Nach Anweisungen gelten für 1 Petrischale, haben verschiedene Verdünnungen von Bakterienkulturen getestet, um die optimale Impfung Volumen für Kolonieisolierung zu bewerten.
      1. Erhitzen 10,5 ml 0,5% Agarose in einer Mikrowelle und abkühlen lassen in einem 55 ° C Wasserbad. Erwärmen 11,25 ml 2x ACCM-2 (pH 4,75) bei 37 ° C.
      2. Bereiten Sie unten Agarose:
         1. Mischen Sie 10 ml geschmolzenem 0,5% Agarose mit 10 ml 2x ACCM-2 und fügen Sie die entsprechenden Antibiotika (375 ug / ml Kanamycin oder 3ug / ml Chloramphenicol).
         2. Gießen Sie sofort in die Petrischale. Halten Sie die Petrischale unlidded, lassen Sie das Medium kühlen 30 Minuten und der Luft trocknen für 20 min.
      3. Vorbereitung Top-Agarose:
         1. Mischen 1,25 ml 2x ACCM-2 mit 0,75 ml Wasser in einem 5 ml Polystyrolröhrchen, fügen Sie die entsprechenden Antibiotika (375 ug / ml Kanamycin oder 3 ug / ml Chloramphenicol) und bei 37 ° C.
         2. Fügen Sie die Bakterienkultur (in der Regel 1 bis 100 & mgr; l) und Vortex für 5 Sekunden.
         3. In 0,5 ml geschmolzener Agarose, mischen und sofort auf der Unterseite Agarose gießen.
         4. Lassen Sie für 20 Minuten abkühlen, ersetzen Sie den Deckel auf die Petrischale und Inkubation bei 4 ° C für 20 min, um Agarose Erstarrung zu erleichtern.
         5. Luft trocknen für 20 min in einem MSC unlidded. Wachsen Platten bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ und 2,5% O ₂ für 6 bis 7 Tage.
   2. Hinzuzufügen DMSO zu den verbleibenden Bakterienl Kulturen, um eine Endkonzentration von 10% DMSO und bei -80 ° C zu erreichen.
   3. Beurteilen Sie die optimale Verdünnung wie folgt: sicherzustellen, dass Kolonien sind 0,5 bis 1 mm Durchmesser und richtig isoliert, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Auftauen verbleibenden Bakterienkulturen von Punkt 1.4.2 und Platte bei der geeigneten Verdünnung auf ACCM-2-Agar nach 1.4.1.2 und 1.4.1.3 beschrieben. Inkubation für 6 bis 7 Tagen in 1.4.1.3.5 beschrieben.
   4. Sobald Kolonien nachweisbar sind, sammeln sie, indem das Ende einer 1 ml Spitze, nahm den Stecker enthalten isolierte Kolonien und Dispergieren der Kolonie durch Pipettieren in 1,5 ml ACCM-2 mit den entsprechenden Antibiotika (375 ug / ml Kanamycin oder 3 ug / ml Chloramphenicol) in einer 24-Well-Platte. Verstärken einzelnen Kolonien für 6 Tage in den in 1.3.1 beschriebenen Bedingungen. Am 3. Tag der Inkubation, zerstreuen die Bakterienklumpen durch Pipettieren von jeder Kultur.
   5. Speicherung jeder Mutante Suspension in 2D Barcode versehene Schraubdeckelröhrchen in 96-Well-Platten in 10% DMSO bei -80 ° C.
5. Bewertung der Bakterienkonzentration:
   Anmerkung: Die folgenden Protokoll angewandt, um die Wachstumskurven von bakteriellen Mutanten Replikation in axenischen Medium (siehe 1.4.4) zu erhalten.
   1. Standardkurve der Zubereitung:
      1. Vorbereitung einer 2 & mgr; g / ml Stammlösung von dsDNA (typischerweise eine zufällige Plasmid bekannter Größe und Konzentration) in 1x Tris-EDTA (TE). Bereiten Sie das 10-fache serielle Verdünnungen der Stammlösung auf Konzentrationen im Bereich von 2 ug / ml bis 2 ng / ml zu erhalten. Geben Sie 50 ul jeder Konzentration auf einzelne Wells einer 96-Well-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und dem Boden (siehe Tabelle der Materialien).
      2. Verdünnen Sie die dsDNA Quantifizierung Reagenz 1: 200 in 1x TE-Puffer und fügen Sie 55 ul der verdünnten Reagens zu jeder Probe in der Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen. Gut mischen mit einem Plattenschüttler inkubieren für 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur, in der Dunkelheit.
      3. Messen Sie die Proben mit Hilfe eines Fluoreszenz fluoreszierennce Mikroplatten-Reader und Filter für Standard-Fluoreszenzwellenlängen (Anregung ~ 480 nm, Emissions ~ 520 nm).
      4. Zeichnen Sie die Plasmid-Konzentrationsbereich gegen die Fluoreszenzintensität Lesungen.
   2. Bakteriensuspension Quantifizierung:
      1. Verzichtet werden 5 ul 10% Triton X-100 auch in einer 96-Well-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und dem Boden (siehe Tabelle der Materialien). Dann werden 50 ul der Bakteriensuspension in jede Vertiefung und Inkubation 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler.
      2. Verdünnen Sie die dsDNA Quantifizierung Reagenz 1: 200 in 1x TE-Puffer und fügen Sie 55 ul der verdünnten Reagens zu jeder Probe in der Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen. Gut mischen mit einem Plattenschüttler inkubieren für 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur, in der Dunkelheit.
      3. Messen Sie die Proben-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroplatten-Reader und Filter für Standard-Fluoreszenzwellenlängen (Anregung ~ 480 nm, Emissions ~ 520 nm).
      4. Um die bakterielle DN erhaltenEine Konzentration, zeichnen die Fluoreszenzmesswerte in der in Nummer 1.5.1.4 erhalten Chart. Teilen die DNA-Konzentration von der Masse des Coxiella Genom (2,2 fg) an Bakterienkonzentrationen zu erhalten. Express-Ergebnisse in Genome Equivalent / ml.
      5. Discard-Mutanten einen signifikanten Wachstumsdefekt in ACCM-2 zeigt.

2. Einzel Primer Colony PCR, Sequenzierung und Annotation

Anmerkung: Die folgenden Protokoll ist für die DNA-Amplifikation von 96 Proben wird ein Mehrkanalpipette für die folgenden Schritte empfohlen. Säulenreinigung von PCR-Produkten unter Verwendung von Magnetkügelchen und DNA-Sequenzierung mit einem Transposon-spezifischen Primers (2,3) sind mit einer externen Firma vergeben.

1. Sicherzustellen, dass die Amplifikationsprimer um bestimmt ist, zwischen 100 und 200 Basenpaare stromaufwärts von dem invertierten Tandem Repeat (ITR), um PCR-Produkte für das Transposon Insertionsstelle auf Coxiell erhalten hybridisierenein Genom. Bereiten Sie 3 ml PCR-Mix (1x High-Fidelity-Puffer, 200 uM dNTPs, 1 uM Amplifikationsprimer, 20 U / ml High Fidelity DNA-Polymerase) und verzichten 29 ul pro Vertiefung in einer 96-Well PCR-Platte auf Eis gesetzt. Übertragungs 1 ul jeder Mutante in der stationären Phase in ACCM-2 an die PCR-Mix.
2. Lauf PCR mit anfänglicher Denaturierung (98 ° C, 1 min), 20 Zyklen mit hoher Stringenz (98 ° C, 10 sec; 50 ° C, 30 sec; 72 ° C, 90 sec), 30 Zyklen mit niedriger Stringenz (98 ° C, 10 sec; 30 ° C, 30 sec; 72 ° C, 90 sec) und 30 hoher Stringenz Zyklen (98 ° C, 10 Sek, 50 ° C, 30 sec; 72 ° C, 90 sec), gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 7 min.
3. Reinige PCR-Produkte unter Verwendung von magnetischen Kügelchen und Sequenz-DNA mit einem Transposon-spezifischen Primer. Entwerfen der Transposon-spezifischen Primer mit einem vorhergesagten Schmelztemperatur zwischen 50 ° C und 75 ° C, einen GC-Gehalt zwischen 40% und 60%, einer Länge zwischen 18 und 25 Nukleotiden und einer Annealing Si bestehendete abwärts des Amplifikationsprimers Hybridisierungsstelle und mindestens 100 Basenpaare stromaufwärts von dem ersten Basenpaar der Transposon-ITR.
4. Verwenden von Sequenzanalyse-Software, laden Sie das vollständige, kommentierte Genom von Coxiella burnetii 493 NMI. Mit der Funktion "ausrichten, um Referenz" zu laden und zu richten (blastn) die Sequenzierungsergebnisse und bestimmen den Ort der Umsetzung. Entsorgen Mutanten mit nicht passenden und / oder Anzeige von Doppel reads.To Überwachung der Sättigung des Mutantenbibliothek, eine Aufzeichnung des Auftretens von mehreren Transposoninsertionen an der gleichen Stelle.

3. eukaryotischen Zellen Challenge mit Coxiella Mutanten und Überwachung von intrazellulären Wachstum

Hinweis: Ein Mehrkanal-Pipette für die folgenden Schritte zu empfehlen. Infektionen wurden dreifach in sterile 96-Well-Mikroplatten mit schwarzen Wänden und flachen transparenten Boden durchgeführt. Gew Coxiella burnetii, die GFP ¹⁴ wwie von Dr. Robert Heinzen vorgesehen.

1. Wachsen Vero-Zellen in RPMI ohne Phenolrot mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in der Abwesenheit von Antibiotika (vollständiges RPMI Medium).
2. Am Tag vor der Infektion, waschen Vero-Zellen aus einem konfluenten oder subkonfluenten Zellkulturflasche mit 10 ml PBS.
3. Lösen Vero-Zellen durch Zugabe von 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung zu der Zellkulturflasche und Inkubation für 3 bis 5 min bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _2.
4. Die Zellen in 10 ml vollständigem RPMI-Medien. Zählen von Zellen und bereiten eine Zellsuspension von 10 ⁵ Zellen pro ml.
5. Verteilen von 100 & mgr; l der Zellsuspension in jede Vertiefung einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen mit flachem transparentem Boden.
6. Zentrifuge 5 min bei 400 · g bei RT zur Adhäsion der Zellen auf dem Boden der Vertiefungen zu erleichtern, und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _2.
7. Auftauen der 96-Well-Platten, die die Coxiella Mutanten bei RT und verdünnter 150 ul Bakteriensuspension in 300 ul RPMI ohne Phenolrot und FBS in einer tiefen und 96-Well-Platte.
8. Entfernen Sie das Medium aus dem Mikroplatten enthalten Vero-Zellen und Verteilen von 100 ul / Vertiefung verdünnt Coxiella Mutanten (MOI von 100). Verwenden Vertiefung A1 negativ (nicht infizierten Zellen) Steuerung und Vertiefungen A2 und A3 als positive Kontrolle (Zellen mit wt Coxiella GFP ¹⁴ an Multiplizitäten der Infektion (MOI) von 100 und 200 infiziert).
9. Zentrifugieren Sie die Platte für 10 Minuten bei 400 × g bei RT mit einem aerosoldichte Zentrifugenschildhalter.
10. Inkubieren bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ für 2 Stunden, dann ersetzen bakterienhaltigen Medium mit 100 ul / Vertiefung frisches, komplettes RPMI Medium.
11. Messen Sie jeden Tag GFP-Fluoreszenz für 7 Tage mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroplatten-Reader und Filter für Standard-Fluorescein-Wellenlängen (Anregung ~ 480 nm, Emissions ~ 520 nm). VermeidenStörungen aufgrund von Kondensation und Signaldispersion in dem Kulturmedium verwendet unteren Anregungs- und Emissions Aufzeichnung auf dem Mikroplattenleser.

4. Herstellung von Proben für die automatisierte Bildaufnahme

Hinweis: Die Vorgehensweise ist für eine Platte mit 96 Vertiefungen, Scale-up Volumen entsprechend. Nur wenige Schritte vom 4.2 kann es ein Plattenwäscher nehmen.

1. Am ^7. Tag nach der Infektion zu entfernen Medium aus Platte und ersetzen Sie es mit 50 ul / Vertiefung frisches, komplettes Medium, das eine Zelle durchlässigen fluoreszierenden Farbstoff an der geeigneten Verdünnung (in der Regel 1: 1000, die gemäß der verwendeten Zelllinie optimiert werden ). Zellen 30 inkubieren - 60 min bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _2.
2. Medium ersetzen mit 50 ul / Vertiefung von 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS, Inkubation 30 Min bei Raumtemperatur (RT) und nehmen Sie die PFA-enthaltenden Puffer und waschen 3 Mal mit PBS.
3. Entfernen PBS und dispensE 50 & mgr; l / Vertiefung Blockierungslösung (0,5% Rinderserumalbumin, 50 mM NH ₄ Cl in PBS, pH 7,4) mit 0,05% Saponin ergänzt. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
4. Ersetzen Blockierungslösung mit 40 ul / Vertiefung frisch mit Saponin ergänzt Blockierungslösung (wie oben) und mit einem Anti-LAMP1 Antikörper in einer 1: 500 Verdünnung. Inkubieren Platte für 30 min bei RT.
5. Blocking-Lösung entfernen und waschen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen 5 mal mit 100 ul / Vertiefung PBS.
6. Verzichtet werden 40 ul / Vertiefung Blockierungslösung, ergänzt mit Saponin (wie oben), den entsprechenden fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper (in einer Verdünnung von 1: 1000), um die anti-LAMP1 Antikörper in Schritt 4.4 aufgebracht offenbaren und mit Hoechst 33258 bei 5 & mgr; / ml. Inkubieren Platte für 30 min bei RT.
7. Blocking-Lösung entfernen und waschen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen 5 mal mit 100 ul / Vertiefung PBS. Verlassen das Volumen PBS entsprechend dem letzten Waschschritt in der 96-Well-Platte, wie die fixierten Zellen nicht austrocknen sollte.
8. Bild die Platte sofort oder lagern Platte bei 4 ° C, vor Licht geschützt, für die spätere Analyse.

5. Image Acquisition

1. Erwerben Bilder in dem GFP (488 nm, Bakterien), Hoechst 33258 (350 nm, Wirtszellkerne), rot (~ 555 nm, Zellmembranmarker) und fern roten (~ 615 nm, LAMP1) Kanäle mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop ausgestattet automatisierten mit einem 20x-Objektiv. Erwerben Sie 21 unabhängige Felder pro Vertiefung, um Bild ein Minimum von 5.000 Zellen pro Probe. Gelten Autofokussierung unter Verwendung der Wirtszellkerne Kanal als Referenz. Beim Arbeiten mit bakteriellen Krankheitserregern infiziert einen geringen Prozentsatz an Wirtszellen kann der Benutzer die Anzahl der unabhängigen Feldern abgebildet pro Vertiefung anzupassen, um ein Minimum von 500 infizierten Zellen zu erhalten, um zu analysieren.

6. Bildverarbeitung

Anmerkung: Die folgenden Schritte sind spezifisch für die Verwendung der Bildanalyse-Software CellProfiler. In allen Fällen ist die optimale algorithm zur Segmentierung muss experimentell bestimmt werden, und die Objekte berühren den Rand des Bildes sollte mit der entsprechenden Funktion eliminiert werden.

1. Laden Sie alle Bilder in CellProfiler.
2. Mit dem Modul "ImageMath", um die GFP-Kanal von der Hoechst Kanal subtrahiert, um den Nachweis von Coxiella Kolonien (ebenfalls von Hoechst) und beliebig Wirtszellkerne in den folgenden Schritten zu vermeiden.
3. Verwenden Sie das Modul "IdentifyPrimaryObjects" zu segmentieren Wirtszellkerne aus dem resultierenden Bild der Schritt 6.2. Nennen Sie die segmentierten Objekte "Nuclei".
4. Verwenden Sie das Modul "IdentifySecondaryObjects" zu segmentieren Wirtszellen von den 555 nm Bilder mit den in Schritt 6.3 als Keime nachgewiesen Kernen. Nennen Sie die segmentierten Objekte "Cells".
5. (Optional) Verwenden Sie das Modul "IdentifyTertiaryObjects", um Kerne in Schritt 6.3 aus Zellen in Schritt 6.4 identifiziert identifiziert subtrahieren. Nennen Sie die segmentierten Objekte "Zytoplasma221 ;.
6. Verwenden Sie das Modul "EnhanceOrSuppressFeatures" auf den 615 nm Bilder in den Hintergrund zu entfernen und die folgende Identifizierung LAMP1-positive Fächer erleichtern.
7. Verwenden Sie das Modul "IdentifyPrimaryObjects" auf der in Schritt 6.6 erhaltene Bild zu LAMP1-positive Fächer zu identifizieren. Nennen Sie die segmentierten Objekte "Lysosomen".
8. Verwenden Sie das Modul "IdentifyPrimaryObjects" auf der 488 nm Bild, um Coxiella Kolonien zu identifizieren. Nennen Sie die segmentierten Objekte "Kolonien".
9. Verwenden Sie das Modul "IdentifySecondaryObjects" auf den 615 nm Bildern zu Coxiella enthaltenden Vakuolen mit den Coxiella Kolonien in Schritt 6.8 als Keime nachgewiesen identifizieren. Nennen Sie die segmentierten Objekte "CCV".
10. Verwenden Sie das Modul "MaskObjects" zu CCVs auf Zellen nachgewiesen wählen (wie Zellen berühren den Rand des Bildes werden eliminiert, können einige CCVs "draußen" Zellen nachgewiesen werden). Nennen Sie die reseratung Objekte "Filtered CCVs".
11. Verwenden Sie das Modul "MaskObjects", um Kolonien auf Zellen nachgewiesen wählen (wie Zellen berühren den Rand des Bildes werden eliminiert, können einige Kolonien "draußen" Zellen nachgewiesen werden). Nennen Sie die resultierenden Objekte "Filtered Kolonien".
12. Verwenden Sie das Modul "MaskObjects" zu Lysosomen, um Zellen zu verknüpfen. Nennen Sie die resultierenden Objekte "Filtered Lysosomen".
13. Verwenden Sie das Modul "MaskObjects", um Zellen mit Coxiella Kolonien auszuwählen. Nennen Sie die resultierenden Objekte "infizierten Zellen".
14. Verwenden Sie das Modul "Relate Objects", um die Objekte "Filtered CCVs", wie Kinder der übergeordneten Objekte "Cells" gesetzt. Dies ermöglicht das Zählen der Anzahl von CCV / Zelle.
15. Verwenden Sie das Modul "Relate Objects", um die Objekte "Filtered Kolonien" als Kinder der übergeordneten Objekte "Cells" gesetzt. Dies wirdermöglichen Zählen der Anzahl von Kolonien / Cell.
16. Verwenden Sie das Modul "Relate Objects", um die Objekte "Filtered Lysosomen", wie Kinder der übergeordneten Objekte "Cells" gesetzt. Dies ermöglicht das Zählen der Anzahl der Lysosomen / Zelle.
17. Verwenden Sie das Modul "MeasureObjectSizeShape", um eine morphologische Analyse der Zellkerne, Zellen, gefilterte CCVs, gefilterte Kolonien und Filtered Lysosomen zu erhalten
18. Verwenden Sie das Modul "MeasureObjectIntensity", um die GFP-Fluoreszenz mit Filtered CCVs zu quantifizieren und zu schätzen die Effizienz der Replikation innerhalb Coxiella CCVs.
19. Mit den Modulen "OverlayOutlines" und "SaveImages" überlagern die Segmentierungsergebnisse und das ursprüngliche Bild für die Qualitätskontrolle.
20. Verwenden Sie das Modul "ExportToSpreadsheet", um alle oder eine Auswahl der Bildanalyseergebnisse exportieren.
21. (Optional) Verwenden Sie das Modul "ExportToDatabase", um Ergebnisse zu analysierenVerwendung der Software CellProfiler Analyst.

7. Datenanalyse

1. Für jeden Parameter erhalten wird, zu identifizieren und zu beseitigen Ausreißer (aufgrund von Fehlern bei der Bildsegmentierung) berechnet dann die Mittelwerte pro Mutante.
2. Verwenden Sie Z-Scores zu erheblichen Phänotypen identifizieren. Betrachten Phänotypen mit einem Z-Score> -2 als nicht signifikant, Phänotypen mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 als mild und Phänotypen mit einem Z-Score ≤ -4 so stark.
3. Plot Kombinationen von Parametern nach experimentellen Anforderungen.

Nach Isolierung der Transposon-Mutanten, ist Einzelprimer-Kolonie-PCR eine robuste, Hochdurchsatzverfahren, um die Website von Transposoninsertion für jede Mutante zu identifizieren. Dieser Ansatz beruht auf einem typischen nested PCR-Protokoll aber hier ein einzelner Primer hybridisiert spezifisch und / oder unspezifisch an der Matrizen-DNA in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur (1A). Die typischen PCR-Produkte bestehen aus mehreren DNA-Fragmenten, von denen die meisten spezifisch sind (1B). Die Verwendung eines unterschiedlichen Sequenzierungsprimer, die direkt stromaufwärts des Transposons ITR, und stromabwärts des durch den Amplifikationsprimer erkannte Sequenz annealt bietet Spezifität für die Sequenzierungsschritt (Figur 1C). Automatisierte Software für die Sequenzanalyse richtet die erhaltenen Sequenzen an die Coxiella Genom Bereitstellung der genaue Ort der Transposoninsertionen (Abbildung 1c). Alle Transposoninsertionen kann dann annauf der Coxiella Genom (1D) otated.

Jedes Coxiella Mutante isoliert und axenisch in ACCM-2-Medium entweder vor der Lagerung oder Screening amplifiziert. 2 zeigt ein Beispiel eines 38-Transposon-Mutanten in 16 Punkten / ICM Coxiella Gene (2A). Um die Lebensfähigkeit von Coxiella Mutanten zu beurteilen, werden axenischen Wachstumskurven durch Abtasten Bakterienkulturen für 7 Tage nach der Inokulation und Anwenden des in 1.5 (Figurie 2B) beschriebenen Bakterienkonzentration Assay erhalten. Amplifizierten Mutanten werden dann mit Epithelzellen für 7 Tage inkubiert, in dreifacher Platten mit 96 Vertiefungen. Alle Coxiella Mutanten erzeugt, die GFP-markierten, intrazellulären Wachstumskurven werden durch Messung der Fluoreszenzintensität der GFP jeden gut, alle 24 Stunden, und Aufzeichnen der Messwerte als Funktion der Zeit (2C) erhalten.

Intrazellulären Wachstumskurven stellen die quantitative Analyse der Phänotypen mit jedem Transposoninsertion im Coxiella Genom assoziiert. Um qualitative Informationen zu den gleichen Transposonmutanten hinzuzufügen, haben wir uns für die automatisierte Bildaufnahme und Analyse. Sieben Tage nach der Infektion, Platten befestigt sind, verarbeitet für Immunfluoreszenz, wie in 4 beschrieben und mit Hilfe eines automatisierten, Epifluoreszenzmikroskop wie in 5. Automatisierte Bildanalyse-Software beschrieben, wie CellProfiler (Broad Institute, analysiert www.cellprofiler.com ) verarbeitet die erfassten Kanäle unabhängig und Segmente Objekten für eine vergleichende Analyse (Figur 3) identifiziert. Dies ermöglicht die Identifikation und morphologische Charakterisierung von Wirtszellkerne, Zellen Konturen, Lysosomen und Coxiella Kolonien (Abbildung 3 oberen Felder). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellen und ermöglicht die Lysosomen Bestandtauf und spezifische morphologische Analyse von Coxiella enthaltenden Vakuolen (die LAMP1 positive, 3 unteren linken Bereich sind). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Wirtszelle Konturen ermöglicht die Identifizierung und spezifische morphologische Analyse von infizierten Zellen (Abbildung 3 unten Mitte). Schließlich werden die 4 Kanäle zur Veranschaulichung und Qualitätskontrolle (Abbildung 3 unten rechts) zusammengeführt.

Von der automatisierten Bildanalyse erhaltenen Daten können gegeneinander aufgetragen werden, um "Mehr phänotypische Streudiagramme" zu erhalten. Als ein Beispiel in Figur 4A die mittlere Fläche (in & mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Kolonien pro Zelle (4A) aufgetragen wird, um Veränderungen, die die intrazelluläre Replikation des Coxiella (Replikationsphenotyp) und / oder beeinflussen zu identifizieren die Fähigkeit von Bakterien an Wirtszellen eindringen (internasierung Phänotyp). Die statistische Analyse wurde verwendet, um Regionen in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 <Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Mutanten wurden in 3 Hauptcluster beobachtet: Mutationen, die zu einer fehlerhaften intrazelluläre Wachstum von Coxiella Folge wurden in der äußersten linken Teil der Handlung (4A, rosa und rote Punkte) gruppiert sind; Mutationen, die Coxiella Internalisierung in Zellen betroffen waren im unteren Teil des Grundstücks gruppiert (4A, helle und dunkle blaue Punkte) und schließlich grünen Punkten in der äußersten rechten Bereich des Grundstücks entsprechen Mutationen in nicht-signifikanten Phänotypen ( Z-Score> -2). Wichtig ist, dass Mutanten, die zur Replikation ausfallen, aber noch in der Lage, um Wirtszellen eindringen, werden nach 7 Tagen der Infektion als einzelne Bakterien oder kleinen Kolonien, angrenzend an Zellkernen (4C, zweite Grafik) Wirt erkannt. Daher ist die Größe der Coxiella "Colomen "wird erheblich beeinflusst werden, aber die Anzahl der infizierten Zellen werden nicht im Vergleich zu WT Coxiella infizierten Zellen variieren. Im Gegenteil, Mutationen, die die Fähigkeit von Coxiella, Wirtszellen eindringen beeinflussen zu einer Abnahme in der Anzahl von Kolonien / Zelle. Wenn diese Zahl deutlich unterhalb von 1 ist, zeigt dies, dass, im Durchschnitt, gibt es eine Abnahme in der Gesamtzahl der infizierten Zellen. Alternativ kann die Durchschnittsfläche (in & mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Wirtszellen, die die Infektion (4B), aufgetragen werden, um Mutationen, die Zytotoxizität Coxiella (zytotoxische Phänotyp) verleihen identifizieren. Wie oben wurde die statistische Analyse verwendet, um Bereiche in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 <Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Die meisten Mutationen gescreent nicht signifikant auf das Überleben der Zelle, unabhängig von bakteriellen Replikations im WirtsZellen (3B grüne Punkte). 37 Mutationen leicht betroffen Wirtszelle Überleben (3B, leicht rote Punkte) und 7 Mutationen waren besonders schädlich für das Überleben der Zellen (3B, dunkle rote Punkte) hosten. Bitte beachten Sie, dass durch die automatisierte Bildanalyseverfahren erhalten zusätzliche Parameter können verwendet werden, um den übrigen Diagrammen abgeleitet werden, je nach experimentellen Anforderungen.

Abb. 1: Die Sequenzierung und Annotation von Coxiella Transposon-Mutanten (A) Einzelprimer Kolonie-PCR wird verwendet, um DNA-Fragmente, die die Stelle der Transposon-Insertion zu verstärken. Amplifikationsprimer (Amp) sowohl als spezifische und unspezifische Primer in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur verwendet. (B) Typische Ergebnis der Einzelprimer-Kolonie-PCR. Jede Reactiauf produziert eine Anzahl von Fragmenten unterschiedlicher Größe, von denen einige das Transposon Insertionsstelle enthält; einige andere zufällig als Nebenprodukte der PCR-Zyklus niedriger Stringenz amplifiziert. (C) Die Verwendung eines Sequenzierungsprimer (Seq), der auf einem Transposon-Sequenz hybridisiert, kann die Sequenzierung der Fragmente von Interesse. (D) Die Sequenzanalyse-Software ermöglicht die automatische Annotation von Transposoninsertionen auf das bakterielle Genom. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abb. 2: Axenic und intrazelluläre Wachstum von Coxiella Transposon-Mutanten (A) In der Pilotschirm haben wir in 16 Kern g isoliert, sequenziert und abgeschirmt 38 Transposon-Mutantenenen der Coxiella dot / icm-Sekretionssystem (rot gekennzeichnet). (B) Um die Rentabilität der einzelnen Transposon-Mutante zu bewerten, das Wachstum je Isolat in axenischen Kulturmedium wird über 8 Tage mit einem fluoreszenzmarkierten DNA-Interkalationsmittel überwacht. (C) jede Mutante wird dann verwendet, um Epithelzellen zu infizieren. Wie das Transposon besitzt eine GFP Kassette wird intrazellulären Bakterienwachstum mehr als 7 Tage nach der Infektion, indem Sie die Variationen der GFP-Fluoreszenz mit Coxiella Replikation verbunden ist, unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader überwacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Automatisierte Bildanalyse von Coxiella Infektionen Ein Auto.Zusammengesetzte Epifluoreszenzmikroskop wird zur Abbildung 21 Positionen pro Loch von dreifachen 96-Well-Platten. Die Bildanalyse-Software Segmente Objekten in jeder erworbenen Kanäle für die Quantifizierung und Analyse. In allen Fällen werden die Gegenstände berühren den Rand der Bilder ausgeschlossen. (A) Die Hoechst-Kanal wird verwendet, um Wirtszellkerne zu identifizieren (in grün markiert). (B) Diese werden als Keime verwendet werden, um Wirtszellkonturen im Cy3-Kanal zu identifizieren (die Position der Kerne blau eingekreist sind Zellkonturen in grün). (C) Das Cy5-Kanal wird verwendet, um LAMP1-positive Fächer zu identifizieren (in grün eingekreist); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen (in rot) enthalten Objekte für die Bildanalyse erhalten. (D) Die GFP-Kanal wird verwendet, um Coxiella Kolonien zu identifizieren (in grün markiert). (E) Korrelieren Coxiella Kolonien mit LAMP1 positive Abteilen ermöglicht die Identifizierung von Coxiella (F) Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellkonturen ermöglicht die Identifizierung von infizierten Zellen (pseudocolored). (G) in den 4 Fluoreszenzkanälen erworbene Bilder (entsprechend Coxiella Kolonien (grün), Wirtszellkerne (blau), Wirtszellplasmamembran (grau), LAMP1-positive Fächer (rot)) werden zusammengeführt und für die Darstellung und Qualität verwendet Kontrolle. Maßstabsbalken 10 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Groß Identifizierung von Coxiella Faktoren in Wirts Mitmachen / Pathogen interagierenIonen. (A) Die durchschnittliche Fläche (in & mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die relative Anzahl der Kolonien pro Zelle aufgetragen ist, um die Replikation und Internalisierung Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score> -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa und Hellblau Punkte stehen für die Replikation und Internalisierung Phänotypen jeweils mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rot und dunkelblau Punkte stellen Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). (B) Die mittlere Fläche (in & mgr; m 2) von Coxiella Kolonien wurde an der Gesamtzahl von Zellen (infiziert und nicht infiziert), dass 7 Tage nach der Infektion auf die zytotoxische Wirkung von Transposoninsertionen resultierende Schätzung lebten aufgetragen. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score> -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa Punkte stellen zytotoxische phenotypes mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rote Punkte stehen für zytotoxische Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). Die Pfeile zeigen die Mutanten durch den entsprechenden Kleinbuchstaben in C (C) veranschaulicht repräsentative Bilder der Replikation, Internalisierung und zytotoxische Phänotypen. In allen Fällen sind Wirtszellkerne in rot, sind Coxiella Kolonien in grün. Maßstabsbalken 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.