Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-

Alzahra J. Al Omran; Hannah C. Saternos; Tongyu Liu; Surya M. Nauli; Wissam A. AbouAlaiwi

doi:10.3791/52853

Methodenartikel

Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-

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DOI:

10.3791/52853

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1. Juni 2015

Alzahra J. Al Omran¹ , Hannah C. Saternos¹ , Tongyu Liu² , Surya M. Nauli³ , Wissam A. AbouAlaiwi¹

¹Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, ²Life Sciences Institute, University of Michigan, ³Department of Biomedical & Pharmaceutical Sciences, Chapman University, School of Pharmacy, Rinker Health Science campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mit hochauflösenden Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie wird eine ex vivo Beobachtung des schlagenden motiler ependymaler Zilien innerhalb der Maus Hirnkammern entfernt von Live-Bildgebung nachgewiesen. Die Technik ermöglicht eine Aufnahme von der einzigartigen Zilienschlag Frequenz und Schlagwinkel sowie deren intrazellulären Calcium-Oszillation Stimulationseigenschaften.

Zusammenfassung

Multiciliated Ependymzellen säumen die Ventrikel im erwachsenen Gehirn. Abnormale Funktion oder Struktur ependymaler Zilien ist mit verschiedenen neurologischen Defiziten assoziiert. Die aktuelle ex vivo Echtzeit-Bildgebung von beweglichen ependymaler Zilien Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Dynamik ciliary folgenden mehreren Schritten. Diese Schritte umfassen: Mäuse Euthanasie mit Kohlendioxid nach Protokollen der University of Toledo Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC); Kraniektomie gefolgt von Gehirnentfernung und sagittal Gehirn Dissektion mit einem Vibratom oder scharfe Klinge sehr dünne Schnitte durch die Hirn Seitenventrikel, wo die ependymaler Zilien visualisiert werden können erhalten. Inkubation der Scheiben des Gehirns in einem angepassten Glasbodenplatte, die Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / Hoch Glucose bei 37 ° C in Gegenwart von 95% / 5% O ₂ / CO _{2 -Gemisch} ist wichtig, um das Gewebe am Leben zu halten währenddas Experiment. Ein Video der Zilien schlagen wird dann mit Hilfe eines hochauflösenden Differentialinterferenzkontrastmikroskop erfasst. Das Video wird dann Bild für Bild analysiert, um die Zilienschlag Frequenz zu berechnen. Auf diese Weise können unterschiedliche Einstufung der Ependymzellen in drei Kategorien oder Arten auf der Grundlage ihrer Zilienschlag Frequenz und Winkel. Weiterhin ermöglicht diese Technik die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzbildanalyse, um die einzigartigen intrazellulären Calciumschwingungseigenschaften Ependymalzellen sowie die Wirkung von pharmakologischen Mitteln auf den Calcium Schwingungen und Zilienschlag Frequenz charakterisieren. Außerdem eignet sich dieses Verfahren für Immunfluoreszenz-Bildgebung zum ziliaren Struktur und ciliary Proteinlokalisationsstudien. Dies ist besonders wichtig bei der Krankheitsdiagnose und Phänotyp Studien. Die Hauptbeschränkung der Technik wird auf die Abnahme in lebenden motile Zilien Bewegung zurückzuführen, wie das Hirngewebe und sterben ab.

Einleitung

Cilien sensorischen Mikrotubulus-basierten Organellen, die von der Zelloberfläche an die extrazelluläre Umgebung zu verlängern. "9 + 0" oder "9 + 2" - je nach ihrer Mikrotubuliorganisationszentrum kann Zilien in zwei Typen eingeteilt werden. Funktionell bezogen auf ihre Beweglichkeit, so können diese als bewegliche oder unbewegliche Zilien ¹ eingestuft werden. Primäre Zilien ist ein Begriff allgemein verwendet, bezeichnen "9 + 0" unbewegliche Zilien. Diese haben neun parallelen Dublett Mikrotubuli (hergestellt von "9" bezeichnet) und einer zentralen Paar von Mikrotubuli abwesend innerhalb der zentralen Hülse (durch "0" bezeichnet). , Einige "9 + 0" Zilien,....