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Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

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DOI:

10.3791/52854

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11. Juni 2015

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1Department of Biology, San Diego State University, 2Computational Science Research Center, San Diego State University, 3Bioinformatics and Medical Informatics Research Center, San Diego State University, 4Department of Mathematics and Statistics, San Diego State University, 5Department of Computer Science, San Diego State University, 6Mathematics and Computer Science Division, Argonne National Laboratory, 7SPARC Committee, Broad Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir phänomische Ansätze zur funktionellen Charakterisierung von mutmaßlichen Phagengenen. Zu den Techniken gehören ein entwickelter Assay, der in der Lage ist, den anabolen Metabolismus des Wirts zu überwachen, die Multi-Phenotype Assay Plates (MAPs), zusätzlich zu der etablierten Methode der Metabolomik, die in der Lage ist, Auswirkungen auf den katabolen Metabolismus zu messen.

Zusammenfassung

Aktuelle Untersuchungen in den Phagen-Wirt-Interaktionen sind abhängig von Extrapolation Wissen aus (meta) Genome. Interessant ist, dass 60 bis 95% aller Phagensequenzen teilen keine Homologie zu aktuellen kommentierten Proteinen. Als Ergebnis sind ein großer Teil der Phagen-Gene als hypothetisch annotiert. Diese Realität stark wirkt sich auf die Annotation von beiden strukturellen und Hilfsstoffwechselgene. Hier präsentieren wir Phenomic Methoden entwickelt, um die physiologische Reaktion (n) einer ausgewählten Wirts während der Expression eines dieser unbekannten Phagen-Gene zu erfassen. Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten) werden verwendet, um die Vielfalt der Host Substratverwertung und die anschließende Bildung von Biomasse zu überwachen, während Metabolomik bietet bi-Produktanalyse durch die Überwachung Metabolit Fülle und Vielfalt. Beide Werkzeuge werden gleichzeitig verwendet, um eine phänotypische Profil mit Expression eines einzelnen putative Phagen offenen Leserahmen (ORF) verbunden sind. Repräsentative Ergebnisse für beide Methoden verglichen werden, highlighting die phänotypischen Unterschiede Profil eines Hosts, die entweder mutmaßlichen strukturellen oder metabolischen Phagen-Gene. Darüber hinaus sind die Visualisierungstechniken mit hohem Durchsatz Rechen Pipelines, experimentelle Analyse vereinfacht dargestellt.

Einleitung

Viren, die Bakterien (aka Bakteriophage oder Phage) befallen sind schätzungsweise bei mehr als 10 31 virusähnlichen Partikeln (VLPs) global in einer Umgebung vorhanden sind und 1,2 überwiegen alle anderen Organismen. Die erste metagenomic Studie zur Untersuchung der viralen Gemeinden mit Meeresumgebungen konzentrierte sich auf die Quantifizierung der Vielfalt innerhalb der Virusfraktion 3 zu sehen. Zusätzlich Breitbart und Kollegen festgestellt, dass mehr als 65% der viralen Sequenzen gemeinsam Gemeinschaft keine Homologie zu irgendwelchen Sequenzen in öffentlichen Datenbanken. Nachfolgende metagenomic Studien fanden ähnliche Beweise: Metagenomen aus marinen Sedimenten in San Diego, Kalifornien enthalten 75% unbekannt viralen Sequenzen 4; Metagenomen von hypersaliner Seen des Salton Sea enthalten 98% unbekannt viralen Sequenzen 5; und Korallen-assoziierten Metagenomen enthalten 95 bis 98% unbekannt viralen Sequenzen 6. Diese Anhäufung von unkommentierte Informationen führte zuPhagen genetischen Materials, "der dunklen Materie des biologischen Universums" 7.

Genoms von Phagen beruht auf der Identifizierung Sequenzähnlichkeit durch Vergleich mit bestehenden Nukleinsäure und Protein-Datenbanken. Weil Phagen-kodierte genetische Information ist in erster Linie bekannt ist, sind Homologie-basierte Methoden unwirksam. Innerhalb ihres Genoms, Phagen kodieren typischerweise drei großen Gen-Typen: Transkription und Replikation Genen, Stoffwechsel-Genen und Strukturgene. Die Transkription und Replikation Gene (Klasse I / II-Gene 8) schließen Polymerasen, Primasen, endo / exo-Nukleasen und Kinasen. Diese Gene sind hoch wegen ihrer Bedeutung in Phageninfektion konserviert, Transkription und Replikation von Phagen genetischen Materials. Phagen-Polymerasen werden leicht unter Verwendung von herkömmlichen Methoden, Sequenzhomologie identifiziert durch ihre globale Erhaltung 9 und ist gezeigt worden, als wirksame phylogenetischen Markierungen 10 dienen.Demgegenüber Phagen metabolischen und Strukturgenen (Klasse II / III-Gene 8) zunehmend divergent und oft als hypothetische Gene gekennzeichnet.

Phage metabolischen Gene beeinflussen die Stoffwechselkapazität der Host und sind für die virale Replikation nicht unbedingt erforderlich. Diese Gene, die häufig als Hilfs metabolischen Gene 11 (AMGs) bezeichnet wird, scheinen Wirtsstoffwechsel modulieren und ermöglichen einen optimalen Verlauf der Infektion und den Erfolg der Virion-Reifung. AMGs haben mit der Nutzung und Aufnahme von Nährstoffen oder die Begrenzung der Energieproduktion Wege in Verbindung gebracht. Einige Beispiele sind Photo Gene in den Genomen verschiedener cyanophage 12-16 gefunden, Gene verbunden ist und durch Phosphatstoffwechsel 17,18 und Ausnutzung des Pentosephosphatwegs Phagen dNTP Biosynthese 18,19 geregelt. Im Vergleich dazu sind Strukturgene unter den mittleren bis späten Gene während der Infektion hergestellt und unterscheiden sich in den verschiedenen Phagen-host Systeme. Die Herstellung von Strukturproteinen sind abhängig von der Verfügbarkeit der viralen dNTP, und Energie-Pools für die Transkription, Translation und Anordnung 8. Das Kapsid und Schwanzfaserstrukturproteine ​​werden als die divergier aller viralen Protein-codierenden Genen erachtet und werden für eine erfolgreiche -Virionproduktion erforderlich. Ihre Divergenz wird in der Regel auf die aktive Rolle, die sie bei der Gestaltung der Virus-Wirt-Koevolution 20 spielen zurückzuführen. Divergier Proteinen, unabhängig von der Gen-Klasse, werden ohne weiteres bei Verwendung der herkömmlichen Homologie und Sequenzausrichtungstechniken übersehen. Ein Versuch, für die Beschränkungen mit strengen Sequenzvergleiche gesehen zu korrigieren hat in der Bioinformatik in der Lage, unter Verwendung von Sequenz Eigenschaften Verein, wie künstliche neuronale Netze 21 bestimmen geführt. Künstliche Neuronale Netze (KNN) ermöglichen die Vorhersage der strukturellen und metabolischen Gene erfordern jedoch stromabwärts experimentelle Validierung direkt zu charakterisierenGenfunktion.

Das Ziel dieses Manuskript einem phenomic Protokollen zur Überwachung sowohl katabolischen und anabolischen Metabolismus eines Wirtsbakteriums während der Expression eines neuen Phagen-Gen bereitzustellen, funktionell durch ANNs vorhergesagt. Das Feld der Phenomics, die Biologie mit zellulären Phänotypen verbunden sind, ist in der Systembiologie gegründet, um bei der Untersuchung von Proteinen mit unbekannten oder pleiotrope Funktion unterstützen. Phenomic-Tools verwendet werden, um phänotypische Informationen genotypische Informationen zu verknüpfen. Wir stellen die Hypothese für putative Phagen Genen, deren Funktion (en) kann durch Beobachtung Host physiologischen Wirkungen während Phagen Genexpression bestimmt werden. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden zwei quantitative Methoden gewählt. Multi-Phänotyp-Assayplatten (MAPs) wurden verwendet, um Wirtssubstratverwertung und die anschließende Bildung von Biomasse zu überwachen, während metabolomics gemessen Host Metabolit Vielfalt und relative Häufigkeit während des Wachstums in bestimmten environmentale Zustände. Mutmaßlichen strukturellen und metabolischen Proteine ​​wurden in Escherichia coli überexprimiert und repräsentative Ergebnisse aus beiden Experimenten verglichen. Zahlreiche visuelle Techniken und Hochdurchsatz-Verarbeitungspipelines werden präsentiert, um experimentelle Replikation zu erleichtern. Schließlich sind die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der vorgestellten Methoden im Rahmen der erwarteten physiologischen Effekte für eine kommentierte Kapsidprotein und Phagen metabolischen Protein Thioredoxin, plus zwei putative AMGs diskutiert.

Protokoll

1. Herstellung von Multi-Phänotyp-Assay-Platte (MAP) Substrate, Grundmedien, Pre-Wachstumsmedien und Buffer

  1. Machen Sie 50 ml von 1,0 bis 1,25% Substrat Aktien.
    1. Aufzulösen 1,0-1,25% (w / v) festes Substrat in sterilem Wasser (Wärme falls erforderlich). Filter sterilisieren Lösungen mit einem 0,22 um-Filtereinheit und Speicherbestände bei RT. Beispiele für Substrate, die in diesen Experimenten sind in Tabelle 2 bereitgestellt.
  2. Bilden 250 ml 3x Basalmedien für alle Substratklassen (Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor). MOPS (3-morpholinopropan-1-sulfonat) basierend Basalmedium 22 enthält die folgenden: 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricin), 0,4% Glycerin *, 9,5 mM NH 4 Cl *, 0,25 mM NaSO 4 * 1,0 mM MgSO 4 *, 1,32 mM K 2 HPO 4 *, 10 mM KCl, 0,5 & mgr; M CaCl 2, 5 mM NaCl, 6 & mgr; M FeCl 3, und 0,1% (w / v) L-Arabinose ** (Tabellen 1 und 2) .
    Anmerkung: * Diese Verbindungen werden nicht in Abhängigkeit von der Grundmedien enthalten. Zum Beispiel ist 0,4% Glycerin in den Kohlenstoffgrundmedien und in der Schwefel Basalmedien 1,0 mM MgSO 4 1,0 mM MgCl 2 ersetzt wurde. ** L-Arabinose ist spezifisch für die Induktion der Promotorvektor pBAD, pEMB11, die in ein ara umgewandelt wurde - E. coli K-12-Stamm (BW 27784) 23.
    1. Fügen jede Komponente der Grundmedien in einen sterilen Kolben und bringen Lösung zu Volumen. Gut mischen. Mit einer 0,22 um Filtereinheit Filter sterilisieren jeweils Basalmedien in eine sterile Flasche.
  3. Stellen Sie 500 ml MOPS pre-Wachstumsmedien. MOPS basierte Vorswachstumsmedien 22 enthält folgende Komponenten: 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricin), 0,4% Glycerin, 9,5 mM NH 4 Cl, 0,25 mM NaSO 4, 1,0 mM MgSO 4, 1,32 mM K 2 HPO 4, 10 mM KCl, 0,5 & mgr; M CaCl 2, 5 mM NaCl und 6 & mgr; M FeCl 3.
    1. In jederKomponente des Pre-Wachstumsmedien in einen sterilen Kolben und bringt zu Volumen. Filter sterilisieren mit einer 0,22 um Filtereinheit, dann fügen Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml. Speicher-Lösung bei 4 ° C.
  4. Bilden 500 ml 0,5x Luria-Bertani (LB) Agarplatten. In ein steriles Gefäß umgießen, LB-Komponenten, um ein 0,5-fach-Konzentration (1,25 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl, 2,5 g Trypton, 7,5 g Agar) zu machen. Gut mischen und im Autoklaven zu sterilisieren.
    1. Kühlen Agar, dann mit 100 ug / ml des Antibiotikums Ampicillin mit Mischen. Gießen ~ 25 ml Agar in Petrischalen, stehen lassen, und bei 4 ° C bis zum Gebrauch.
  5. Bilden 250 ml 10 mM Tris (pH 7,4) plus 10 mM MgSO 4 Pufferlösung. Filter zu sterilisieren mit einem 0,22 um-Filtereinheit und Speicher-Lösung bei RT.

2. Herstellung von Bakterienzellsuspension

  1. Bereiten Sie frische Kolonien. Von einem 12,5% Glycerin gefrorenen Lager, Teller Frische E. coli clones auf 0,5x LB-Agar, enthaltend 100 ug / ml Ampicillin. Inkubieren bei 37 ° C für 24 Std.
  2. Bereiten Flüssigkulturen:
    1. Pipette 3 ml vorgeWachstumsMedium, das 100 ug / ml Ampicillin in Kulturröhrchen. Für jeden Klon, benutzen biologischen Triplikaten.
    2. Impfen unabhängige Kolonien von Abschnitt 2.1 in vorbereitete Kulturröhrchen. Bei 37 ° C unter Schütteln für 22 Stunden.
  3. Pellets und waschen Bakterienzellen:
    1. Transfer O / N Kulturen in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (16.900 × g) für 2 min in einer Mikrozentrifuge. Dekantieren und wäscht die Zellen durch Resuspendieren in 500 ul 10 mM Tris / 10 mM MgSO & sub4; -Puffer. Wiederholen.
    2. Wieder Pellet Zellen Dekantieren und resuspendieren Zellen in 1 ml 10 mM Tris / 10 mM MgSO & sub4; -Puffer.
  4. Messung der Zelldichte und Konzentrat-Zellen (falls erforderlich):
    1. Verdünnte Zellen aus Abschnitt 2.3.3 10-fach indie 10 mM Tris / 10 mM MgSO4 Puffer und übertragen diese Verdünnung in eine Küvette. Die optische Dichte (OD 600 nm) dieser Verdünnung und aufzeichnen.
    2. Konzentrieren Sie sich Zellen zu einer Endkonzentration von 0,07 (OD 600 nm) in die Karten (die Zellen 15-fach verdünnt werden, wenn sie auf den Karten hinzugefügt, also Zellen müssen bei einer anfänglichen Konzentration von OD 600 nm = 1,05) zu erreichen. Übertragen Sie konzentrierten Zellsuspension in ein Reservoir und speichern (bei RT) bis Schritt 3.5 von MAPs Vorbereitung.

3. Herstellung von Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten)

  1. Beschriften Sie MAPs. Etikett sterile 96-Well-Mikrotiterplatten mit einem E. coli-Klon-Identifikationsnummer und Karte schematische Art.
  2. Aliquot sterilem Wasser in MAPs. Aseptisch Transfer sterilem Wasser in einem Flüssigkeitsreservoir. Pipette 60 ul in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit Hilfe eines Mehrkanalpipette.
  3. Aliquot Basalmedien into MAPs. Aseptisch Transfer 3x Grundmedien in ein Flüssigkeitsreservoir. Pipettieren von 50 ul in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit Hilfe eines Mehrkanalpipette. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 für jede in der MAP schematische Grundmedien verwendet.
  4. Aliquot Substrate in MAPs. Übertragen Sie 30 ul jedes Substrat in die entsprechende Vertiefung der MAPs.
  5. In Bakteriensuspension zu den Karten. Transfer 10 ul Bakterienzellen aus dem Abschnitt 2.4.2 in jede Vertiefung der Karte mithilfe eines Mehrkanalpipette. Ändern Sie Tipps vor Wiedereinführung Pipette wieder in die Kultur Lager.
  6. Cover MAPs mit Klebefolie. Decken Sie jede Platte mit einem einzigen Klebeplatte Film. Filmpresse fest oben auf den Vertiefungen der Platte und entlang der Kanten, um eine gleichmäßige und dichte Abdichtung zu schaffen. Entfernen überschüssigen Films von den Rändern der Mikrotiterplatte mit einer sterilen Rasierklinge.
  7. Die optische Dichte der MAPs:
    1. Zeigen vorbereitet MAPs in der "Input" Hülse einer Lamellen spectroPhotometer-Plattenlesegerät. Open-Plattenlesegerät-Software und erstellen Sie ein Protokoll, das die Absorption (OD 600 nm) alle 30 Minuten, misst insgesamt 32 h, mit 60 Sekunden Schütteln zwischen liest.
    2. Eingestellten Temperatur in der Apparatur auf 37 ° C. Starten Protokoll einmal Karten haben, um ins Gleichgewicht Temperatur einzustellen.
    3. Nach 32 Stunden, entfernen Sie Karten aus dem "Output" Hülse des Plattenlesegerät. Beschriften Sie jedes Datentextdatei zu schließen: die E. coli-Klon-Identifikationsnummer, Datum der MAP lief, und die MAP schematische Art.

4. Multi-Phänotyp-Assay-Platten (MAPs) Verarbeitung und Parametrierung

  1. Beurteilen Wachstumskurven mit Hilfe eines automatisierten Qualitätssicherungsprozess, beispielsweise PMAnalyzer 24.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Wachstumskurven haben OD 600 nm <0,20 in den ersten 2 Stunden. Verwenden keine Absorption bei der Anfangszeitpunkt (t 0) in die Filter Artefakte aufgrund von Kondenswasser, das typischerweise bei behebent 1 (30 min).
    2. Entfernen Wachstumskurven, die QA-Filter zu verletzen. Sparen Kurve Informationen (Probenname, auch Nummer und OD 600 nm-Werte) in einer separaten Ausgabedatei für die Zukunft. Fahren Sie mit Analyse, wenn Wachstumskurve verläuft QA-Filter.
  2. Berechnen Sie mittlere Wachstumskurven. Verwendung repliziert Daten, pro Vertiefung, die Berechnung der mittleren Wachstumskurve, indem man die mittlere optische Dichte (OD 600 nm) Wert zu jedem Zeitpunkt. Nehmen resultierende mittlere Wachstumskurven in einem separaten Ausgabedatei für die zukünftige Verwendung.
  3. Berechnen Sie die am besten passenden logistischen Modell für jede Wachstumskurve mit einer Anpassung der durch Zwietering 25 vorgeschlagenen Gleichung. Die logistischen Gleichung weist drei Parameter beschreiben das Wachstum von Bakterien: die Verzögerungszeit, λ (h), die maximale Wachstumsrate μ max (OD 600 nm 100 -1), und die endgültige Ausbeute an Biomasse, α (OD 600 nm). Verwenden Sie Daten zur Zeit = 30 min (y 1) als Anfangswert aufgrund von Artefakten von Kondenswasser.
    figure-protocol-1 [1]
    1. Berechnen Sie die maximale Wachstumsrate unter Verwendung einer Direktsuche. Nehmen Sie den größten Veränderungsrate über einen 90 Minuten-Intervall innerhalb der Daten.
      figure-protocol-2 [2]
    2. Schätzen Sie die endgültige Biomasseertrag durch die Suche nach der oberen asymptotischen Wert der größten gleitenden Durchschnitt über einen 90 min-Fenster. Insbesondere definieren die Asymptote der Wachstumskurve.
      figure-protocol-3 [3]
    3. Unter Verwendung der μ max und A-Werte von 4.3.1 und 4.3.2 finden Sie die λ-Wert, indem Sie versuchen alle Werte λ:
      figure-protocol-4 [4]
      1. Verwenden Sie jeden λ-Wert, um eine Summe der quadrierten Fehler (SSE) zu berechnen. Verwenden Sie die niedrigste SSE ist die SSE (& lambda; s):
        /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]

5. Phänotyp Analyse von MAPs

  1. Berechnen Sie die Wachstumsstufe (GL) für jede Wachstumskurve, um die Gesamtwachstum pro Klon pro Substrat zu bewerten. GL definiert als harmonisches Mittel der verschobenen logistic ausgestattete Werte:
    figure-protocol-5 [6]
  2. Vergeben Sie einen Phänotyp zu jedem Wachstumskurve basierend auf den GL-Werte. Hier sind die vier Phänotypen verwendet: das erwartete Wachstum, kein Wachstum, Gewinn von Funktion und Funktionsverlust.
    1. Bestimmen Sie Phänotypen durch Vergleich Wachstum in allen Klonen auf einem bestimmten Substrat in Form von Standardabweichungen vom Mittelwert. Mithilfe dieser Statistik und eine minimale Wachstumsschwelle, um den Phänotyp von der Wachstumskurve (1A, B). 1C stellt Beispiele für Phänotyp Zuordnung dargestellt zu bezeichnen.
    2. Wachstum zu definieren, wie GL ≥ 0,4 (Figure 1A, B). Überfunktion (1C, grün) zu definieren, wie mit einer GL> zwei Standardabweichungen über dem Mittelwert und einer mittleren> der Wachstumsschwelle. Verlust der Funktion (1C, rot) als mit einer GL der Wachstumsschwelle definiert.
  3. Erstellen Sie visuelle Darstellungen des Datensatzes auf Basis von Phänotypen und Wachstumskurven.
    1. Wachstumsdynamik Ansicht darzustellen OD 600 nm-Werte als Farb schnell verglichen Wachstumskurven zwischen mehreren Klone (Abbildung 2).
    2. Anzuzeigen phänotypischen Verteilungen aller Klone anhand von Wachstumsbedingungen (Abbildung 3).

6. Aufbau der Dauerkulturapparat

  1. Reactor Hafenbau (4A, B). Bohren Sie drei 1/4 in. Löcher im Abstand von 3/4 in. Voneinander entfernt, in der Kappe der kontinuierlichen Kultur Reaktor.
    1. For α-Anschluss: Schraube ein Gewinde Luer Stil Tafeleinbau auf 1/16 in Widerhaken aus dem Boden der Kappe mit der Widerhaken nach oben, aus der Kappe.. Sichere Widerhaken mit einer 1/4 in. Kontermutter Schalttafeleinbau.
    2. Für Port β: Schraube ein Gewinde Luer Stil Tafeleinbau auf 1/16 in Widerhaken mit der Widerhaken nach oben, aus der Kappe.. Sichere Widerhaken mit einer 1/4 in. Kontermutter Schalttafeleinbau.
    3. Für Port γ: Schraube ein Gewinde Luer Stil Tafeleinbau auf 1/16 in Widerhaken aus dem Boden der Kappe, so dass die Widerhaken nach oben zeigt, aus der Kappe.. Sichere Widerhaken mit 1/4 in. Kontermutter Schalttafeleinbau. Schrauben Sie eine Luer mit integriertem Sperrring zu 1/8 in. Breiten Bohrung Schlauch an die Schlauchtülle an der Innenseite der Kappe.
    4. Für die Ablaufanschluss: bohren Sie ein 5/16 in Loch an der 75-ml-Marke der kontinuierlichen Kultur Reaktor.. Geschnitten 3/4 in. Aus der Mutter Ende der 1/4 in. Stacheldraht Schottverschraubung. Einschrauben 1/4 in. Schlaucholiven mit Beschlag (Dichtung auf der Außenseite der Flasche und die Mutter ist an der Innenseite, FBBILDUNG 4B).
  2. Babyflasche Hafenbau (4C). Bohren Sie zwei 1/4 in. Löcher im Abstand von 1 in. Voneinander in der Kappe der Trinkflasche.
    1. Für den Hafen δ: Schraube ein Gewinde Luer Stil Tafeleinbau auf 1/8 in Widerhaken mit der Widerhaken nach oben, aus der Kappe.. Sichere Widerhaken mit einer 1/4 in. Kontermutter Schalttafeleinbau.
    2. Für den Hafen ε: Schraube ein Gewinde Luer Stil Tafeleinbau auf 1/16 in Widerhaken mit der Widerhaken nach oben, aus der Kappe.. Sichere Widerhaken mit einer 1/4 in. Kontermutter Schalttafeleinbau.
      1. Schrauben Sie eine Luer mit integriertem Sperrring zu 1/8 in. Breiten Bohrung Schlauch an die Schlauchtülle, an der Innenseite der Kappe.
  3. Magensonden und Rohrverlängerungen:
    1. Cut zwei 1 in. Schlauchstücke (1/8 in. Außendurchmesser (OD) x 1/16 in. Innendurchmesser (ID)). Fit Stücke auf Ports α und γ der kontinuierlichen Kultur Reaktor in Abschnitt 5.2 vorgenommen.
    2. Schneiden Sie ein einzelnes 1 in. Stück tubing (1/4 in. OD x 1/8 in. ID). Fit Stück auf Port Β der kontinuierlichen Kultur Reaktor.
    3. Schneiden Sie ein einzelnes 3,5 in. Rohrstück (1/8 in. OD x 16.1 in. ID). Passt dieses Stück an der Innenseite der Hafen γ, auf dem männlichen Luer mit integriertem Sperrring zu 1/8 in. Breiten Bohrung Schlauch. Port γ ist die Probenentnahmeanschluss des kontinuierlichen Kulturreaktor.
    4. Schneiden Sie ein einzelnes 1 in. Rohrstück (1/4 in. OD x 1/8 in. ID). Passt dieses Stück auf der δ-Port der Trinkflasche.
    5. Schneiden Sie ein einzelnes 11 in. Rohrstück (1/16 in. OD x 1/8 in. ID). Passt dieses Stück an der Innenseite der Hafen ε der Trinkflasche, auf dem männlichen Luer mit integriertem Sperrring zu 1/8 in. Breiten Bohrung Schlauch.
    6. Schneiden Sie zwei 18 in. Schlauchstücke (1/8 in. OD x 16.1 in. ID). Fit ein Stück in den Hafen ε der Trinkflasche. Speichern Sie die andere Stück für Abschnitt 7.

7. BETRIEB Kontinuierliche Kulturen für Metabolomics

  1. Sterilisieren Materialien:
    1. Autoclahabe die trockenen Materialien für 30 min. Achten Sie darauf, Kappe der Trinkflasche in Abschnitt 5 in Aluminiumfolie wickeln. Halten angebracht Schlauch gerade.
      1. Wickeln Sie Kappe des kontinuierlichen Kultur Reaktor, in Abschnitt 5 hergestellt, in Aluminiumfolie. Halten angebracht Schlauch gerade. Wickeln Sie 18 in. Rohr Schnitt in Abschnitt 6.3.5 und der kleinste Schlauchpumpe Schlauchadapter in Aluminiumfolie. Halten Schlauch gerade. Autoklav für 30 min.
    2. Machen Sie 2 l 0,5x LB-Brühe. In der Milchflasche, stellen 0,5x LB-Brühe. Decken Babyflasche mit Folie. Autoklaven für 1 Stunde.
    3. Machen Sie 70 ml 0,5x LB-Brühe. Pour Brühe in der kontinuierlichen Kultur Reaktor. Legen Sie einen Rührstab in der kontinuierlichen Kultur Reaktor. Decken Reaktor mit Folie und Autoklaven für 30 min.
  2. Kontinuierliche Kultur Set-up:
    1. Bakterienzellsuspension.
      1. Von einem 12,5% Glycerin gefrorenen Lager, Teller Frische E. coli-Klone auf LB-Agar, enthaltend 0,5 × 100 & mgr; g / ml Ampicillin. Bebrütenbei 37 ° C für 24 Std.
      2. Inokulieren einer einzelnen Kolonie in 3 ml LB-Brühe, die 0,5 × 100 & mgr; g / ml Ampicillin. Für jeden Klon verwenden biologischen Triplikaten. Bei 37 ° C unter Schütteln für 22 Stunden.
    2. Verbinden Sie die Teile zusammen.
      1. Legen Sie alle Materialien im Autoklaven in einem biologischen Sicherheitsschrank und schalten UV-Licht auf, während Medien abkühlt. Einmal beschreibbare Medien abgekühlt ist, werden 0,1% L-Arabinose und 100 ug / ml Ampicillin zu allen 0,5x LB Brühe.
      2. Packen kontinuierlichen Kultur Reaktordeckel und schrauben auf den Reaktor. Berühren Sie nicht die Entnahmerohr. Packen Sie die Fütterung Flaschendeckel und Schraube auf der Trinkflasche. Berühren Sie nicht die Entnahmerohr.
      3. Halten Sie die 18 in. Schlauch an Port ε sterile angebracht. Un-wickeln Sie den 18 in. Schläuche und Schlauchpumpe Schlauchadapter.
      4. Setzen Sie einen freien Ende der 18 in. Schlauch auf ein Ende der Schlauchpumpe Schlauchadapter. Das andere Ende des Schlauchpumpe Schlauchadapter andie in 18. Schlauch an Anschluss angeschlossen ε der Trinkflasche Kappe.
      5. Schraube 0,22 um Filtereinheiten auf Ports β und δ der kontinuierlichen Kultur Reaktor. Schrauben Sie eine 0,22 um-Filtereinheit an der Adapterport α. Auf die 0,22 um-Filtereinheit, passen Sie das freie Ende des 18 in. Schläuche.
    3. Starten der kontinuierlichen Kultur.
      1. In der biologischen Sicherheitshaube, impfen die kontinuierliche Kultur Reaktor mit 100 ul O / N-Kultur in Abschnitt 7.2.1.1 vorgenommen.
      2. Verschlußsystem, bevor die kontinuierliche Kultur in einem 37 ° C Inkubator. In dem Inkubator haben eine magnetische Rührplatte und Minischlauchpumpe einrichten.
      3. Montieren Sie die Schlauchpumpe Schlauchadapter in die Schlauchpumpe. Schlauch von der Saugflasche beginnt bei der "In" beginnt Seite und Schläuche, die zu dem Reaktor bei der "Out" Seite.
      4. Stellen Sie die Schlauchpumpe zu: "FAST". Starten Sie die Schlauchpumpe durch die Umstellung auf R20; FORWARD ". Überprüfen Sie, ob Medien beginnt durch den Schlauch fließen.
      5. Zeigen Reaktor auf Magnetrührplatte und beginnen Mischen. Kontinuierliche Kultur Reaktor muss 24 Stunden lang vor der Probenahme ins Gleichgewicht.
    4. Abtastung der kontinuierlichen Kultur. Schrauben Sie eine 5 ml-Luer-lok Spritze auf Port γ und ziehen Sie 4,5 ml der Kultur.
      1. Anwendung 500 ul der Kultur, die Dichte (OD 600 nm) zu messen. Verdünnte Zellen zu 4 x 1 ml-Kulturen bei OD 600 nm = 0,35 zu machen.
      2. Aliquot in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt Kulturen. Wiederholen Probenahme alle 12 h für 4 Tage.
    5. Bereiten Sie Proben für die GC-TOFMS:
      1. Pellet-Zellen über Zentrifugation bei max Drehzahl (16.900 xg) für 2 min. Dekantieren. Wash-Zellen mit 500 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie diesen Schritt.
      2. Dekantieren ein letztes Mal, und dann tauchen Mikrozentrifugenröhrchen mit pelletierten Zellen in flüssigem Stickstoff bis zur Blasenbildung stoppt. Sriss Proben in -80 ° C Tiefkühltruhe.

8. Lauf Serielle Passage Batch-Kulturen für Metabolomics

  1. Vorbereitung Bakterienzellsuspension. Von einem 12,5% Glycerin gefrorenen Lager, Teller Frische E. coli-Klone auf LB-Agar, enthaltend 0,5 × 100 & mgr; g / ml Ampicillin. Inkubieren bei 37 ° C für 24 Std.
    1. Inokulieren einzelnen Kolonien in 3 ml LB-Brühe, die 0,5 × 100 & mgr; g / ml Ampicillin. Verwenden biologischen Triplikaten für jeden Klon.
  2. Serielle Passage Batch-Kulturen.
    1. Subkultur O / N von der 8.1.1 über eine 500-fache Verdünnung in 3 ml LB-Brühe, die 50 ug / ml Ampicillin und 0,1% L-Arabinose. Subculture sollte einen OD 600 nm <0,005. Bei 37 ° C unter Schütteln.
    2. Überprüfen optische Dichte (OD 600 nm) bei 2 und 2,5 Stunden. Wachsen Zellen, die OD 600 nm = 0,35 zu erreichen.
      1. Subkultur über eine 500fache disung in 3 ml LB-Brühe, die 50 ug / ml Ampicillin und 0,1% L-Arabinose. Subculture sollte einen OD 600 nm <0,005.
    3. Überprüfen optische Dichte (OD 600 nm) bei 2 und 2,5 Stunden. Wachsen Zellen, die OD 600 nm = 0,35 zu erreichen.
  3. Sampling serielle Passage Batch-Kulturen.
    1. Verwendung einer sterilen Pinzette platzieren eines 0,22 um Membranfilter auf einem Filterverteiler. Aliquot 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf das Filterpapier und dann Vakuumpumpe zu drehen.
    2. Wiederholung der Zugabe von 1 ml PBS. 1 ml der Subkultur aus dem Abschnitt 8.2.3 auf das Filterpapier. Von hier aus schnell zu bewegen, um Proben in flüssigen Stickstoff sofort. Führen Sie diese in 1 min.
    3. Aliquot 1 ml PBS auf Filterpapier, um Probe zu waschen. Spülen Sie schnell ohne Verschütten Probe über Seiten des Filterpapiers. Wiederholen.
    4. Mit einer sterilen Pinzette Ort Filter in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch vorsichtiges Falten des filter. Tauchen Sie Mikrozentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff bis zum sprudelnden stoppt. Shop Probe in -80 ° C Tiefkühltruhe.

9. Metabolitenanalyse & Processing

  1. Schiff 3 Proben pro Klon auf Trockeneis zu einem Metabolomics Core Facility für Probenaufbereitung, Analyse und Normalisierung der GC-TOFMS.
  2. Für jede Probe bestimmen den Mittelwert, Median, Standardabweichung und Variationskoeffizient für Metaboliten mit Replikatdatenserver.
  3. Für die statistische Analyse, manuell einen QA-Pipeline Code unter Verwendung von bedingten Anweisungen und sich wiederholende Ausführungen 26 bis Metaboliten, die festgelegten Bedingungen nicht befolgen zu entfernen.
    1. Für Bedingung 1, entfernen Metaboliten, bei denen mehr als 2 Proben Nullfluss. Entfernen internen Standards aus den metabolomic Profile.
    2. Für Bedingung 2, entfernen Sie diese Stoffwechselprodukte, die in den Zellen von Interesse zu finden sind. Hier, nehmen Sie die folgenden Metaboliten: Indol-3-Acetat, dihydroabiet ic Säure, Nonadecansäure, Salicylsäure, Salicylaldehyd, Cholesterin, Phenol, 1-Monostearin, Octadecanol, 1-Monopalmitin, Dodecan, Dodecanol, 1-Hexadecanol, 5-Methoxytryptamin, Benzoesäure, Pentadekansäure, Phosphorsäure, Pelargonsäure, Palmitinsäure , Caprinsäure, Hydroxylamin, Stearinsäure, Myristinsäure, Maleimid, Levoglucosan und 4-Hydroxybuttersäure.
    3. Für Bedingung 3, entfernen Sie diese Stoffwechselprodukte, deren Variationskoeffizient größer als 1 ist.
  4. Erfassen global Metabolomik Wirkungen suchen Sie in Metaboliten relativen Häufigkeiten.
    1. Erstellen Sie eine visuelle Darstellung des medianen Metabolit Fülle pro Klon für jeden Metaboliten (Abbildung 6).
  5. Identifizieren Ausreißer durch Beobachtung Klon-Metaboliten Paar Frequenzen.
    1. Berechnen Sie die Z-Score für jeden Medianwert jedes Metaboliten in einem Klon. Berechnen Sie Z-Werte nach der folgenden Gleichung:
      /52854/52854eq7.jpg "/> [7]
      Hinweis: Zeit X MC steht für die Fülle Niveau eines bestimmten Metaboliten für einen bestimmten Klon. Ausdruck μ C stellt den Mittelwert aus allen Klonen für eine spezifische Metaboliten. Tige σ C ist die zugehörige Standardabweichung.
    2. Erstellen Sie eine visuelle Darstellung der Daten, in denen Ausreißer markiert sind (Daten nicht zur Verfügung gestellt).

Ergebnisse

Alle Proben verwendet, um die offenen Leserahmen (ORFs) in diese Studie ausgewählt bestimmen wurden von Starbuck Island, Seite 7 (STAR7) und Caroline-Atoll, Seite 9 (CAR9) der südlichen Line Islands gesammelt. Schätzungsweise 100 L Meerwasser von diesen Seiten wurde unter den Korallen Grenzschicht mit Lenzpumpen gesammelt, wie zuvor beschrieben 5. Inhalte der Pumpen unterlagen Fraktionierung durch grobporigen Filter können kleine Eukaryoten zu entfernen, und anschließend mit 100 kDa tangentialen Stromfilter so dass nur Mikroben und Virus ähnliche Partikel (VLPs) konzentriert. Um die VLPs zu trennen, wurde verbleibenden Meerwasser durch 0,45 um-Filter, was zur virome übergeben. Chloroform wurde zu dieser Virusfraktion eingeführt wird, um das Wachstum der verbleibenden Zellen arretieren und bei 4 ° C gelagert.

VLPs wurden unter Verwendung der Cäsiumchlorid-Verfahren, bei dem Dichtegradienten getrennt durch Zentrifugation und ermöglicht die Wiederherstellung von vir gereinigtIonen bei ~ 1,35 g / ml bis 1,5 g / ml 3. Virus-DNA wurde mit einem CTAB / Phenol: Chloroform extrahiert und über mehrere Protokoll displacement amplification Verwendung Phi29 Reagenzien amplifiziert. Sequenzierung des virome wurde mit kommerziell erhältlichen Pyrosequenzierungstechnologie bewerkstelligt.

Bioinformatik bei der Verarbeitung und Auswahl von Virus ORFs für diese Studie verwendet werden, sind wie folgt. Drei Vorverarbeitungsschritte wurden auf den CAR9 und STAR7 viralen metagenomes verwendet. Zuerst wurde öffentlichen Software zur Tag-Sequenzen, die aus der Amplifikation der viralen DNA vor dem Sequenzieren 27 führte zu entfernen. Zweitens wurden gemeinsame Sequenzierung Artefakte wie Sequenz dupliziert und niedriger Kopienzahl aus dem Datensatz über einen zusätzlichen Bioinformatik-Programm 28 gefiltert. Schließlich wurde die Entfernung von Fremdsequenz Kontamination 29 für jene Sequenzen, die ≥ 90% Abdeckung und ≥ 94% Identität mit den Sequenzen in den folgenden Datenbanken durchgeführt hatte: RefSeq virus Genome; Mensch - Reference GRCh37; Mensch - Celera Genomics; Mensch - Craig Venter (HuRef); Mensch - Seong-Jin Kim (Korean); Mensch - Chromosom 7 Version 2 (TCAG); und Mensch - James Watson, Yanhuang (YH; Asian), Yoruba (NA18507; African) Referenzsequenzen 21. Im Anschluss an diese Prozesse, Sequenzen aus den CAR9 Proben betrug 591.600 und STAR7 Sequenzen betrug 939.311. Diese Sequenzen wurden auf MGRAST hochgeladen und per Assembler-Software mit den Standardeinstellungen zusammengebaut. Contigs wurden in 6 Leserahmen und mutmaßlichen offenen Leserahmen (pORFs) wurden mit Hilfe von Skripten festsetzten, wie zuvor beschrieben 21.

Unbekannte ORFs eine Reihe von Ähnlichkeiten basierten Suche durchgeführt, um ORFs bekannter Funktion entfernen zu identifizieren. Kurz gesagt wurden die folgenden Suchen mit den entsprechenden Suchkriterien 21 durchgeführt werden:

  1. Signifikante Ähnlichkeit von ≥ 95% Identität über ≥40 Basenpaare (bp) durch MGRAST BLAT in M5NR Datenbank.
  2. Signifikante Ähnlichkeit (E-Wert ≤ 0,001) durch TBLASTN gegen alle öffentlichen Metagenomen in My Metagenom Database Ressource.
  3. Signifikante Ähnlichkeit (E-Wert ≤ 0,001) von BLASTP und TBLASTN gegen NR-Datenbank.
  4. Signifikante Ähnlichkeit (E-Wert ≤ 0,001) von RPS-BLAST gegen die konservierte Domäne Database.
  5. Protein Übersetzungen aus einer ausgewählten Fraktion von jedem Datensatz verglichen gelöst Proteinstrukturen in der Protein Data Bank.
  6. Berechnung der Dinucleotid Frequenzen mit Dinucleotid Signatures Paket.

Die resultierenden pORFs wurden für die Expression in E. entworfen coli unter Verwendung von öffentlich verfügbaren Gen-Design-Software. Rückübersetzung der Aminosäuresequenzen verwendet ein Universal-Codonverwendungstabelle entwickelt, um die Expression in E. aufnehmen coli mit einem minimalen Verbrauch von 2% liegt. Restriktionsenzym-Erkennungssequenzs für BamHI und HindIII wurden die aus den Sequenzen ausgeschlossen, um die Klonierung zu erleichtern. Ein externes Unternehmen synthetisiert das manipulierte Gen-Sequenzen 30 und dann wurden ORFs in ein Medium-Kopienzahl pBAD Promotorvektor, pEMB11 geklont, über Standard-Restriktionsenzym-Klonen. Alle Klone wurden in E. transformierten coli K-12-Stamm BW 27784 23.

Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten)

Eine Hochdurchsatz und robuste Software-Pipeline wurde für die Analyse der Karten, der PMAnalyzer 24 genutzt. Die Rohrleitung wurde in einem Linux-Server-Umgebung verschiedene Schritte einschließlich entwickelt und erfüllt: Analysieren der optischen Dichte Dateien, Formatieren von Daten in lesbare Textdateien Vorverarbeitung der Wachstumskurven für die Qualitätssicherung (QA), und Durchführen einer mathematischen Modellierungstechniken Wachstumskurven analysiert . Die primären Modellierung Skripte wurden in Python-Version 2.7.5 entwickelt, um den Einsatz der PyLab Modul verfügt.

Landkarten Reproduzierbarkeit wurde mit der Standardfehler (SE) für replizieren Daten (2A) bewertet. Roh Wachstumskurven wurden logistischen Wachstumskurven verglichen, um zu bestimmen, ob das Programm PMAnalyzer genau parametriert und modelliert Klon Wachstum während der Experimente (Daten nicht gezeigt). Für weitere Informationen über die Richtigkeit und Gültigkeit der Karten und PMAnalyzer siehe Cuevas et al. 24

Nach Validierung der Methode wurde MAPs Daten unter Verwendung der Vielzahl von Parametern, wie zum Beispiel maximale Wachstumsrate (μ max) und Wachstumsniveau (GL), durch die Verarbeitungspipeline vorgesehen analysiert. Vergleichende Visualisierung von Wachstumskurven wird oft für das Wachstum der Dateninterpretation verwendet werden; Jedoch ist die Anzahl der Kurven, die zu einem Zeitpunkt für den Vergleich visualisiert werden kann, weist Einschränkungen auf. Zahlreiche Wachstumskurven gleichzeitig zu analysieren, wurden Heatmap abgeleiteten Grund flehte um Zehn Klone auf einem einzigen substrat gewachsen vergleichene gegen durchschnittliche Reaktionsbedingungen, die "(2B). Der Einfluss durch die Überexpression eines neuen Phagenprotein platziert wird durch Veränderungen in der Kurvenparameter zu beachten, insbesondere: Lag-Phase, exponentiellen Phase und die maximale Biomasseertrag (Asymptote). Als Beispiel wird der steile Aufstieg von Lag-Phase in der Wachstumskurve für die Capsid-Protein (2A) modelliert exponentiellen Phase wird durch einen schnellen Wechsel der Farbintensität von Schwarz auf Weiß für den gleichen Klon in der dynamischen Grundstück von 2B wiedergegeben .

Um ein globales Bild der Klon Verteilung über Substrate zu erhalten, wurden phänotypische Klassifikationen vom GL abgeleitet verwendet (Abbildung 3). Hier werden die vier getrennten Phänotypen in vier Diagrammen, wo die Höhe jeder Balken steht für die Anzahl der Klone Anzeige dieses Phänotyp für ein spezifisches Substrat. Ausreißer in den Daten werden als Klone fallen in die "Verstärkung der fu erkanntnktion "oder" Verlust der Kategorie-Funktion ". Ausreißer können dann einzeln gesucht werden, und untersucht genauer experimentell. Außerdem erkennt globale Analyse Substrat Verzerrungen in dem Test. Substrate wie Phenylalanin, Äpfelsäure und Glycin führte zu einem "kein Wachstum" Klassifikation. Substrate, die konsequent in die kein Wachstum Klassifizierung fallen, über alle Klone, nicht stark in nachgeschalteten funktionelle Charakterisierung gewichtet.

Metabolomics

Die Abbauprodukte von Klonen, die unbekannt Phagen-Gene wurden unter Verwendung von Metabolomics identifiziert. Kurz gesagt, wurden Klone entweder unter einer kontinuierlichen Kultur oder serielle Passage in Batch-Kultur-Umgebung, bevor sie für GC-TOFMS Analyse zu einem Metabolomics Core Facility gesendet gewachsen. Einzelheiten zur Probenverarbeitung, Analyse und Normalisierung für GC-TOFMS durch die gewählte Kernanlage umgesetzt sehen Fiehn et al. 31 BrieFly wird 1 ml kaltem Extraktionslösung zu jeder Probe, nach dem Proben werden gevortext und in ein kaltes Bad 5 min beschallt zugegeben. Proben werden schließlich zentrifugiert und die Hälfte der Probe wird dekantiert und nach unten für die Analyse getrocknet. Extrakte werden gereinigt und mit inneren Rückhalteindexmarker versetzt, bevor sie auf den Gaschromatographen geladen und dann anschließend an das Massenspektrometer überführt. Daten von jeder Probe analysiert wird, so dass Signalintensitäten für alle detektierten Signale im Chromatogramm werden gemeldet. Zur Normalisierung wird die Fülle von Spitzen für jede Probe summiert und die Gesamtspitzenhäufigkeiten zwischen allen Proben in der Gruppe gemittelt. Stoffwechselhäufigkeiten pro Probe werden von der Probe Spitzenfluss geteilt und dann durch die durchschnittliche Spitzenfluss der Stichprobe multipliziert. Die resultierenden Daten werden für die Analyse von metabolomics im Forschungs diskutiert verwendet.

Validierung von Metabolomics Reproduzierbarkeit wurde erforderlichdie geeignete Stichprobengröße für jede Kultivierungsverfahren. Zum Nachweis der Genauigkeit innerhalb Proben gesehen und die Unterschiede zwischen den Proben gesehen Größen der Standardfehler des Mittelwerts (S M) sowohl für n = 3 und n = 6 Datensätze wurden überprüft (5B). Unabhängig von der kontinuierlichen Kultur (CC) Probengröße von weniger als 1% der Daten hatte ein S M ≤ 1,5. Median S M s waren 221 und 300, und die Werte von 0 bis 7,55 x 10 5 und 3,74 × 10 5, für n = 3 und n = 6 jeweils angeordnet. S M s wurden für jeden Satz von Probe berechnet repliziert in der seriellen Kultur (SC) -Methode. Auch weniger als 1% der Daten hatte ein S M ≤ 1,5, eine mediane S M von 137, und eine Reihe von 0 bis 3,51 x 10 5. Um die S M Verteilungen zwischen jedem Probensatz (CC n = 3 vs vergleichen . CC n = 6, n = CC 3 vs. SC n = 3 und CC n = 6 vs. SC n = 3) eine Permutation Test durchgeführt wurde. Die distribution entweder kontinuierlicher Kultur S M Werte Datensatz war nicht signifikant verschieden von der Verteilung der seriellen Kultur S M-Werte (p-Wert = 0,0). Jedoch war die Verteilung von S M Werte für kontinuierliche Kultur n = 3 Daten signifikant von dem der S-M-Werte für das kontinuierliche Kultivierungs n = 6 Daten (p-Wert = 1,908804 x 10 -49). Schließlich ist der Variationskoeffizient pro Metaboliten im Vergleich vor und nach der Durchführung einer Qualitätssicherung (QA) Stufe (5C). Insgesamt wurden 210 Metaboliten nach der Umsetzung der QA-Pipeline (40% der Daten) entfernt wird. Weniger als 1% der entnommenen Daten hatte einen Metaboliten Fluss von Null, ~ 2% war interner Standard Daten ~ 5% wurden Daten von Metaboliten nie in E. beobachtet coli und die übrigen Metaboliten (> 30%) hatten einen Variationskoeffizienten von mehr als 1.

Wie bei der MAPs Analyse, globale observations vorgesehen ein erstes Verständnis der Informationstiefe Metabolomik Angebote. Um ein umfassendes Bild zu erhalten, wurden Klone hierarchisch auf der Grundlage ihrer relativen Häufigkeiten Metaboliten die Informationen über Klon-Metaboliten-Profile, potentielle Klone mit ähnlichen Funktionen und Klon-Metaboliten Ausreißer (Abbildung 6) gebündelt. Um Proteinfunktionen zu markieren, werden Metaboliten getrennt und auf der Grundlage gemeinsamer Stoffwechselwege gruppiert. Unter Verwendung dieser Analyse mit vorläufigen Ergebnissen war klar, dass metabolomics zur Abtrennung von Genen aus unterschiedlichen Klassen ist (Figur 6, markiert Klone). Darüber hinaus wurde Ausreißer Identifikation mit der Metabolomics-Daten durch Berechnung Standardwerte (Z-Werte) für jeden Klon-Metaboliten Paar bestimmt. Um eine statistische Signifikanz zu gewährleisten, wurden Ausreißer als Klon-Metaboliten Paar mit einem Z-Score-Wert von 2, einem Anteil von nur 5 Prozent der Daten (Daten nicht gezeigt).

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Abbildung 1. Definitionen der Phänotyp Klassifikationen. (A) Zusammenhang zwischen der Wachstumsstufe (GL) und die maximale Wachstumsrate. Datenpunkte rot eingekreist darstellen Wachstumskurven, die wenig bis gar keine Substratverwertung. (B) Boxplot Darstellung definieren Wachstumsschwelle basierend auf der Verteilung von Wachstumskurven mit einem minimalen Wachstumsrate (<0,15 OD / h). (C) Die Varianz und Standardabweichung von GL ist für Substrat D-Galaktose berechnet. Kurz gestrichelten Linien stellen zwei Standardabweichungen vom Mittelwert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. MAPs Validierung über Präzision und Differenzierung. (A) Wachstumskurven für annoStruktur (Capsid) und Stoffwechsel Klone (Thioredoxin), zwei neuartige Stoffwechsel Klone (EDT2440, EDT2441), und die durchschnittliche Antwort der Klone auf Saccharose, D- gewachsen Galactose und D-Mannose in den Karten. Blaue Linien zeigen den Standardfehler zwischen Replikatdatenserver gesehen (n = 3). (B) Die Wachstumskurven für 47 verschiedene Klone werden als Wärmekarten für Saccharose, D-Galactose und D-Mannose dargestellt. Die kommentierte Struktur (grüner Kreis) und Stoffwechsel Klone (orange Kreis), zwei neuartige Stoffwechsel Klone (dunkle und helle blaue Kreise), und die durchschnittliche Antwort (roter Kreis) sind markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Clone Verteilung für jeden Phänotyp auf mehreren Substraten. Der Phänotyp-Klon zählen für 47 Klone auf 72 C-spezifischen Wachstumsbedingungen. Tabelle bietet einen direkten Zählungen für jeden Phänotyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Abbildung detailliert die Konstruktion der kontinuierlichen Kulturvorrichtung. (A) Stufen verwendet werden, um Anschlüsse α-γ der kontinuierlichen Kultur Reaktor aufzubauen, (B) Stufen verwendet, um die Ausflussöffnung des kontinuierlichen Kulturreaktor und Aufbau (C ) die folgenden Schritte, um Ports δ und ε der kontinuierlichen Kultur Saugflasche zu bauen. = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Vergleich der Phenomic Methoden vorgestellt. (A) Arbeitsablauf für die Herstellung der Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten), Dauerkulturen und Serien Kulturen. (B) Der Prozentsatz der Standardfehler der mittleren (S M) zählt sowohl für n = 3 und n = 6 Stichprobengrößen für die kontinuierliche Kultur (CC) und die Serienkultur (SC) Herstellungsmethoden für Metabolomik. Die y-Achse ist auf einer logarithmischen Skala. (C) Die Verteilung der Variationskoeffizienten (CV) pro Metaboliten, vor und nach der Durchführung der QA-Pipeline für die kontinuierliche Kultur (CC) -Methode.g5highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6. Metabolomic Profile von Klonen in kontinuierlicher Kultur gezüchtet. Sind die Median Metabolit Häufigkeiten für eine Reihe von Stoffwechselprodukten für 84 Klone in Dauerkulturen gezüchtet aufgetragen. Metaboliten-Profile für kommentierten Struktur (Capsid) und Stoffwechsel Klone (Thioredoxin), zwei neuartige Stoffwechsel Klone (EDT2440, EDT2441), und die durchschnittliche metabolische Antwort sind rot hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Verbindung Kohlenstoff Stickstoff Schwefel Phosphor
Glycerol - 0,40% 0,40% 0,40%
Ammoniumchlorid 9,5 mM - 9,5 mM 9,5 mM
Natriumsulfat 0,250 mM 0,250 mM - 0,250 mM
Magnesiumsulfat 1,0 mM 1,0 mM - 1,0 mM
Kaliumphosphat 1,32 mM 1,32 mM 1,32 mM -
Magnesiumchlorid - - * -
Kaliumchlorid 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM
Calciumchlorid 0,5 & mgr; M 0,5 um 0,5 & mgr; M 0,5 & mgr; M
Kochsalz 5 mM 5 mM 5 mM 5 mM
Eisenchlorid 6 & mgr; 6 & mgr; 6 & mgr; 6 & mgr;
L- Arabinose 0,10% 0,10% 0,10% 0,10%
MOPS pH 7,4 1x 1x 1x 1x

Tabelle 1 Die Verbindungen und Konzentrationen der in den Karten verwendet verschiedene Grundmedien. * 1,0 mM Magnesiumchlorid ersetzt. 1x MOPS = 40 mM MOPS, 4 mM Tricin.

Kohlenstoffsubstrate Stickstoff Substrate Schwefel Substrate Phosphorus Substrate
2 Desoxy-D-ribose 2-Desoxy-D-ribose 1-butan-sulfonsäure Adenosin-5-monophoshate
4-Hydroxy-phenylessigsäure acetamid Acetylcystein beta-Glycerophosphat
Essigsäure Adenin D-Cystein creatinephosphate
Adenosin-5-monophosphat Adenosin D-Methionin D-Glucose-6-phosphat
Adonit Allantoin Diethyl-Dithiophosphat Diethyl-Dithiophosphat
alpha-D-glucose beta-Phenylethylamin DL-Ethionin DL-alpha-Glycerophosphat
alpha-D-Lactose Biuret Glutathion Kaliumphosphat
alpha-D-melebiose Cytidin Isethionsäure Natriumpyrophosphat
Zitronensäure Cytosin L-Cysteinsäure Natriumthiophosphat
D-Alanin D-Alanin L-Cystein
D-Arabinose D-Asparagin L-djenkolic Säure
D-Arabit D-Aspartat L-Methionin
D-Asparagin D-Cystein Magnesiumsulfat
D-Aspartat D-glucosamin Methansulfonsäure
D-Cellubiose D-Glutaminsäure N-Acetyl-DL-Methionin
D-Cystein DL-alpha-Amino-N-Buttersäure N-Acetyl-L-cystein
D-Fructose D-Methionin Kalium-tetra-thionat
D-Galactose D-Serin Natriumthiosulfat
D-glucosamin D-Valin sulfanic Säure
D-Glucose gamma-Amino-N-Buttersäure Taurin
D-Glucose-6-phosphat Glycin Taurocholsäure
D-Glutamat Guanidin Thioharnstoff
D-Mannose Histamin
D-Raffinose Inosin
D-Ribose L-Alanin
D-Salicin L-Arginin
D-Serin L-Asparagin
D-Trehalose L-Citrullin
D-Xylose L-Cystein
Dulcit L-Glutaminsäure
Glycerin L-Glutamin
Glycin L-Glutathion
i-Erythrit L-Histidin
Inosin L-Isoleucin
L-Alanin L-Leucin
L-Arabinose L-Lysin
L-Arabitol L-Methionin
L-Asparagin L-Ornithin
L-Aspartat L-Phenylalanin
L-Cysteinsäure L-Prolin
L-Cystein L-pyro-Glutaminsäure
L-Fucose L-Serin; L-Threonin
L-Glutaminsäure L-Tryptophan
L-Glutamin L-Valin
L-Isoleucin N-Acetylglucosamin
L-Leucin Putrescin
L-Lysin Thioharnstoff
L-Methionin Thymidin
L-Phenylalanin Thymin
L-pyro-Glutaminsäure Tyramin
L-Rhamnose Tyrosin
L-Serin Uridin
L-Sorbose
L-Threonin
L-Tryptophan
L-Valin
L-Xylose
Laktat
Lactulose
Malat
myo-Inosit
Oxalsäure
Kaliumsorbat
Propionsäure
Putrescin
Chinasäure
Natriumpyruvat
Natriumsuccinat
Saccharose
Thymidin
Xylit

Tabelle 2. Liste der Substrate in den MAP Experimente verwendet.

Diskussion

Hier präsentieren wir Phenomic Ansätze für die funktionelle Charakterisierung von putativen Phagen-Gene. Techniken umfassen eine entwickelte Assay in der Lage Überwachung Host anabolen Stoffwechsel, die Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten), zusätzlich zu den etablierten Verfahren der Metabolomik, die Messung von Auswirkungen auf Energiestoffwechsel. Wir stellten zusätzliche Werkzeuge, um die großen Datenmengen von diesen Technologien resultierenden verwalten, so dass für hohe Durchsatzverarbeitung und Analyse 24. Schließlich durch den Vergleich eines kommentierten Phagen Kapsidprotein, Phagen Thioredoxin, zwei mutmaßliche metabolische Phagen-Genen, und die durchschnittliche experimentelle Reaktion schlagen wir verschiedene Strategien, um beide Datensätze und Gen-Klassen zu interpretieren, wobei der Schwerpunkt auf der Identifizierung von Trends und phänotypische Identifizierung von Ausreißern.

Wie bereits erwähnt, beide Ansätze quantitativ zu messen nur die Hälfte der Wirtsstoffwechsels. Um die relative Funktion der einen der interpretierenneuartige Proteine ​​untersuchten Daten aus beiden Verfahren ist erforderlich, um Hinweise auf Funktion bereitzustellen. Zwar ist dies nicht ein Schwerpunkt unserer aktuellen Manuskript wird Datenausgänge von jedem Phenomic Verfahren durch kombinatorische Analysen, die auf Clustering-Techniken konzentrieren, wie Zufalls Wald und Hauptkomponentenanalyse setzen. Darüber hinaus müssen Hypothesen der kombinierten Analyse resultierenden anschließend von traditionellen genetischen Methoden validiert werden.

Schließlich stellte die Verfahren sind stark von bakteriellen Physiologie beeinflusst und damit die gleichen Standards zu folgen. Bei der Durchführung jedem Verfahren müssen Überlegungen anzustellen, um unabhängige, klonalen Gruppen mit experimentiert zu gewährleisten; Kontamination verhindert wird; eine einzelne Variable getestet wird; und entsprechende Kontrollen werden gleichzeitig liefen. Die Nichtbeachtung dieser Punktekonto wird in unklare Ergebnisse, ähnlich wie bei jedem physiologischen Test führen.

Multi-Phänotyp-Assay-Platten(MAPs)

Die Entwicklung von MAPs bietet einen hohen Durchsatz und anpassungsfähige Test im Vergleich zu derzeit verfügbaren Technologien (5A und Tabellen 1,2). Der Test verwendet Versorgung, Ausrüstung und grundlegende Techniken in allen mikrobiologischen Labors. Der Einbau einer Rechenpipeline PMAnalyzer 24 zur nachfolgenden Datenverarbeitung und Analyse stellt eine schnelle Interpretation der Daten. Darüber hinaus können beide experimentellen und analytischen Aspekte der Ansatz leicht eingestellt oder für kundenspezifische Zwecke abgestimmt werden. Zum Beispiel, wenn ein Großteil der Daten nicht zur Filterung in Abschnitt 4 beschrieben weitergeben, kann man manuell über den Wachstumskurven zu sichten, um Probleme zu identifizieren. Wenn das Problem entsteht aufgrund der strengen Filterparameter können Anpassungen an das Skript werden. Alternativ kann, wenn Probleme mit dem experimentellen Prozess verbunden (dh verlängert Kondensation; unsachgemäße Übertragung von bakteriellen cells, etc.) werden zusätzliche Wiederholungen ohne weiteres wiederholt werden.

Wie in Cuevas et al. 24 beschrieben, ist die PMAnalyzer eine einzige bash-Programm als ein Wrapper-Skript, das die Analyse und Analyse Skripte als zusammenhängende, automatisierten Pipeline führt geschrieben. Alle Skripte sind, indem der Mittelwert für jeden Zeitpunkt in dreifacher Ausfertigung Daten frei zugänglich von einem Git-Repository bei 25, und anschließend parametriert die logistische Kurve, um die Verzögerungszeit zu erhalten, maximale Wachstumsrate, Asymptote, und eine neue Sicht Wachstumsniveau. Der Median-Wert wurde über die mittlere in unserer Studie, um die Wirkung von großen Ausreißer reduzieren gewählt, jedoch kann das Skript leicht angepasst, um den Mittelwert Replikatdatenserver berechnen. Aufgrund der reduzierten Variation (SE) über Replikatdatenserver (2A) ersichtlich wir aufrechterhalten die Verwendung des Medianwertes PMAnalyzer zum Anbringen einer logistischen Kurve. Zusätzlich wird die für das Wachstum abgeschnitten in dieser Studie (GL ≥ 0,4) war die Detedurch den Vergleich, wie Daten über Wachstumsstufe und maximale Wachstumsrate getrennt rmined (1A, B). In Abhängigkeit von der Instrumente und Modellsystem verwendet diesen Begriff können variieren, Neudefinition dieses erfordern abgeschnitten Wert.

Ein Hauptvorteil unserer Assay ist die Fähigkeit, Phänotypen mit einem einzigen Parameter, der Gesamtmikrobenwachstum, die wir als Wachstumsniveau (GL) zu vergleichen. GL ist eine harmonische Mittel und mindert daher die Auswirkungen der großen Abweichung in den Daten. Die Verwendung eines harmonischen Mittelwert mit verschoben logistic ausgestattete Werte zur Verfügung zu stellen eine Zusammenfassung des Wachstums wurde bei durch Versuch und Irrtum angekommen. Andere Methoden versucht, unterscheiden Wachstum enthalten: Zeit, die spezifischen Kurvenparameter (Halb μ max, μ max und Tragfähigkeit), die Bestimmungskoeffizienten (R 2), und Kombinationen der R 2, multipliziert mit bestimmten Kurvenparameter zu erreichen. Mit Hilfe eines harmonische Mittel mit verschobenlogistic-fit Werte für den GL vorgesehen die größte Reichweite bei der Bewertung Wachstum, so wurde es die Methode der Wahl. Eine Überlegung zu beachten ist, dass dynamische Wachstumskurve Muster haben das Potential, bei der Verwendung eines einzelnen Parameters oder eines angepassten Modells verloren. Zum Beispiel sind die einzelnen Kurvenparameter der logistischen Kurve und der GL unfähig darstellt biphasische Wachstum. In einer einzigen Kohlen Umwelt, diese Wirkung auf das Wachstum impliziert Vermittlung des viralen Proteins zu beiden Umsetzung des Substrats oder der Substratverwertung Verschiebung. Zusätzliche Effekte möglicherweise verloren, wenn nicht unter Berücksichtigung mehrerer Wachstumsparameter umfassen: verlängerte Verzögerungszeit, schlägt eine erhöhte Belastung der viralen Maschinen oder Produkte; schnell beschleunigt exponentiellen Phase, was auf virale Proteine ​​gekoppelt sind, um die Energieproduktion Wege auszurichten; oder höhere Biomassebildung, was impliziert, viralen Träger in Wirtsnährstoffaufnahme und Anabolismus (Daten nicht gezeigt). So Plotten im Entstehen begriffenen Wachstumskurven ( 2A, B) enthält Informationen zu Trends im Zeitverlauf, während die GL berücksichtigt die wichtigsten Variablen der logistischen Modell und bietet eine einzige quantitative Zahl für den Gesamterfolg eines Klons dar.

Bei der Betrachtung der unterschiedlichen Reaktionen von strukturellen und metabolischen Gene in den MAPs beigetragen, stellt man fest, dass die unterschiedlichen Substratklassen in Frage stellen den größten Beweis für die Proteinfunktion. Beispielsweise werden Proteine ​​häufig mit metabolischen Nahme der limitierende Nährstoff, die unspezifisch an Zentralstoff 16,32 Host assoziiert sind. Vorläufige MAP Experimente zeigen, dass Klone vermeintlichen Stoffwechsel Phagen-Gene eine erhöhte Lag-Phase, als am zentralen Stoffwechsel Kohlenstoffquellen (2A) gewachsen. Umgekehrt Klone, die mutmaßlichen Strukturgene, die große Anteile an Gastgeber Energie und dNTP-Pools erfordern, führen zu einer falsch positiven Reaktion auf das Wachstum für central und Aminosäurestoffwechsel Kohlenstoffsubstraten. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der Ansammlung von unlöslichen Proteinen, was zu Host Filamentierung und / oder Einschlusskörper als über Mikroskopie (2A und Daten nicht gezeigt) beobachtet. Während weitere Analyse erforderlich ist, um diese vorläufigen Ergebnisse bestätigen, sind die Karten in der Lage ist das Abrufen phänotypischen Antworten, die die Funktionen von spezifischen Phagen-Gen-Klassen Hypothese zu korrelieren.

Neben der Aufklärung der unbekannten viralen Proteine ​​sind die MAPs eine neuartige Ressource, um die funktionelle und metabolische Diversität eines einzelnen Bakterium oder eine Gemeinschaft von Bakterien zu untersuchen. MAP-Komponenten sind für die einfache Veränderung, um das Wachstum einer Reihe von Bakterien unterstützen entworfen; einschließlich Meeres, auxotroph, und anaerobe Mikroben. Zur Erleichterung dieser Bemühungen die definierten Basis-und pre-Wachstumsmedien erfordern zusätzliche oder eingestellt chemischen Spezies, bevor eine andere Bakteriengattung in den MAPs unterstützt werden.Ein Hinweis auf diese Verwendung der Karten ist es, definierte Medien zu erhalten, das Verbot der Verwendung von Inhaltsstoffen wie Trypton, Hefeextrakt und Pepton.

Metabolomics

Der Bereich der Metabolomics ist abhängig von Stoffwechseldatenbanken, die durch Massenspektrometrie identifiziert isoliert Metaboliten enthalten. Die Core Facility hier gewählt hat eine der größten Metabolomics-Datenbanken. Interessanterweise waren mehr als die Hälfte der Stoffwechselprodukte aus unserer Experimente resultierenden identifizierbaren (~ 65%), während andere noch nie zuvor in unserer Gast aufgezeichnet wurde, Escherichia coli (Beispiele: Indol-3-Essigsäure 33, Salicylsäure 34 und Dihydroabietinsäure 35). Dies könnte entweder auf eine starke Tendenz der Datenbank zu Pflanzenstoffe, oder die spezifischen Proteine ​​in Untersuchung zurückzuführen. Unabhängig davon ist das Ergebnis einer begrenzten Anzahl von bekannten Metaboliten zur Datendarstellung und Analyse zur Verfügung. In der futur, mehrere Metabolomik Methoden mit verschiedenen Datenbanken würde für eine größere Stoffwechselabdeckung zulassen.

Derzeit bekannte und unbekannte Metaboliten werden beim Vergleich und die Gegen unserer neuartigen virale Proteine. Mit diesem Ansatz stellen wir die Hypothese, dass Klone, funktionell ähnliche Proteine ​​eine erhöhte Ähnlichkeit in ihrer vollständigen metabolomic Profil teilen. Vorab metabolomics Analyse zeigte, dass während strukturelle und metabolische Gene nicht eindeutig voneinander trennen, diese Gene ähnliche Effekte auf die Wirts aufweist, wenn er nicht überexprimiert korreliert (Figur 6). Zum Beispiel können die kommentierten Capsid Gencluster eng mit den mutmaßlichen metabolischen Gene markiert in dieser Studie EDT2440 und EDT2441. Untersuchungen die einen öffentlich zugänglichen Transmembrantopologie und Signalpeptid-Vorhersageprogramm ergaben sich Hinweise, dass beide mutmaßlichen metabolischen Gene beherbergen eine einzelne Transmembrandomäne. Interessanter 5 von the 9-Klone in der ersten Cluster-Gruppe (die meisten linken Teil der Dendrogramm) sind Transmembrandomänen mit der gleichen Topologie Programm vorhergesagt. Weitere Untersuchungen erforderlich sind, ist es jedoch wahrscheinlich, daß die bei der Überexpression dieser Klone Metaboliten sind mit zellulären Stress-Antwort von Membran oder Strukturlasten zu verbunden. Dieser Beweis stützt, dass während der Daten metabolomics besitzt eine erhöhte Menge an Rauschen, der fähig ist hervorgehoben Signale allgemeinen Wirkungen von Genen, sowohl innerhalb eines Gens Klasse unterscheiden, ist das Verfahren. Um festzustellen, ob die Methode, die das Auslesen aus spezifischen Informationen der Genfunktion ist, wurden Metaboliten in die spezifische Stoffwechselwege gruppiert. Die Hypothese, der ist, wenn ein Klon wirkt spezifisch für eine einzelne Bahn Metaboliten, dann ist das überexprimiert Gen in diesem Weg aktiv. Vor der Einrichtung unserer Metabolomik Qualitätssicherung Pipeline, ergab vorläufige Daten, die über eined repräsentiert Metaboliten waren typischerweise "unbekannt" bleibt, dass sie nur wenig Informationen über die Wege der sie zugeordnet sind (Daten nicht gezeigt). Vorverarbeiteten metabolomics Daten offenbart jedoch, dass die Mehrzahl der Metabolit Profile ähnlich sind und nur eine ausgewählte Anzahl von unbekannten und bekannten Metaboliten Häufigkeiten variieren von Klonen, beispielsweise Putrescin und Uracil (Abbildung 6). Um eine höhere Auflösung der Proteinfunktion Bemühen stellen werden unternommen, um experimentell zu vergleichen, die die neuen Phagen-Gene gegen bekannte Phagen-Gene, die verwendet werden kann, um in die "Löcher" von Metaboliten auf Basis funktionelle Charakterisierung zu füllen. Unter Verwendung dieser Technik bietet die zugeordnete Funktion von bekannten viralen Genen eine Referenz für die Funktion der unbekannten Genen. Dennoch der limitierende Faktor der Metabolomics-Analyse ist die Größe und Bedeutung der Datenbank. Um dieser Einschränkungen metabolomic Datenbanken relatable dieser Forschung entwickelt werden müssen zu korrigieren; soals Datenbank von Metaboliten und deren Häufigkeiten der spezifisch auf die ASKA Sammlung von E. coli Klone, bei denen ein einzelner ORF überexprimiert 36. Der Nachweis für die Notwendigkeit einer solchen Datenbanken wurde im Jahr 2013 zur Verfügung gestellt, als Forscher an der Lawerence Berkeley National Laboratory kompiliert die erste umfassende Datenbank der spezifischen gesamten Mutantenbibliotheken von Modell Bakterien 37 Metaboliten. Diese Forschung werden neue Einblicke in Genen, die für Verwendung von bestimmten Metaboliten erforderlich ist, enthüllt die klaren Zusammenhang zwischen Phänotyp und Genotyp.

Bei der Prüfung, Metabolomik als Werkzeug, ist es wichtig zu definieren, die Verarbeitung Regime folgte an der Core Facility. Ein Artefakt der meisten experimentellen Verfahren ist der Tag-zu-Tag Varianz mit den Instrumenten der Verwendung verbunden. Bis heute alle GC-MS-Analyse implementiert die Verwendung von internen Standards, die in jede Analysenserie enthalten sind; aber Zugabe von projektspezifischen internen Proben </ Em> lief jeden Tag des Experimentierens entfernt zusätzliche Varianz. Diese Überlegungen müssen frühzeitig angegangen werden, um eine Normalisierung Probleme und Verzerrungen zu vermeiden. Eine andere Lösung ist es, alle Proben bei einer Kernanlage auf der gleichen Maschine und als eine einzige Partie, eine Option zu jeder Kernanlage zur Verfügung zu verarbeiten.

Die verschiedenen Werkzeuge vorgestellt und sowohl in dieser Handschrift neu erforscht, neuartige Mittel zum Screening und Charakterisierung funktionell unbekannt Phagen-Gene. Die Einfachheit und Anpassungsfähigkeit der experimentellen Techniken mit dem stromlinienförmigen Einsatz von Rechenrohrleitungen gewährleistet, diese Methoden sind für ein breites Spektrum von Forschungsvorhaben und Felder. Unser Ziel ist, dass die hier vorgestellten Ansätze Phenomic wird weitere Untersuchungen neuartiger Phagenproteine ​​zusätzlich zu Systemen, die gleichermaßen funktionell undefined sind zu unterstützen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas und Mitgliedern des Viral Dark Matter Consortium für ihre Hilfe und ihren konstruktiven Beitrag zu diesem Manuskript. Diese Forschung wird von der National Science Foundation (DEB-1046413) finanziert und ist Teil des Projekts Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m Sterivex FilterFisher ScientificSVGP01050Millipore
0,22 & Mikro; m Millex FilterFisher ScientificSLGV033RSMillipore
0,22 & Mikro; m SteriCap FilterFisher ScientificSCGPS02REMillipore
0,22 µ m Omnipore MembranfilterMilliporeJHWP02500Millipore
96-Well-MikrotiterplattenVWR82050-764Standard F-Bottom 96 Well Microtiterplatten
2 ml 96-Well-PlatteFisher Scientific
Adhesive Seal PlateFilm Sigma-AldrichZ369667
2 L Nalgene quadratische FlaschenCole ParmerT-06040-70
125 ml Nalgene quadratische FlaschenCole ParmerT-06040-50
1/4 Zoll Kontermutter für Schalttafeleinbau, schwarzes NylonCole ParmerEW-45509-04
Luer-Innengewinde für Schalttafelmontage auf Widerhaken der Serie 200, 1/16 ZollCole ParmerEW-45500-30
Innengewinde für Schalttafelmontage auf Widerhaken der Serie 200, 1/8 ZollCole ParmerEW-45500-34
Integrierter Luer-Sicherungsring für Widerhaken der Serie 500, 1/16 Zoll InnenschlauchCole ParmerEW-45505-31
Luer-Außengewinde mit Sicherungsring x Luer-Kupplung ColeParmerT-45508-80
Schottverschraubungen mit Widerhaken, 1/4 Zoll ODFisher Scientific6149-0002
Sanipure Schlauch, 1/16 Zoll ID x 1/8 Zoll ODSaniPureAR400002
Sanipure Schlauch, 1/4 Zoll Außendurchmesser x 1/8 Zoll IDSaniPureAR400007
Minipumpe mit variablem Durchfluss (Schlauchpumpe)Fisher Scientific13-876-1
MagnetrührerVelp ScientificaF203A0160
PinzetteFisher Scientific14-512-141Millipore* Filterzange
Multiplatten-Spektralphotometer PlattenleserMolecular Devices Analyst GT
FilterverteilerFisher ScientificXX10 025 02
Software:
Python Version 2.7.5http://www.python.org/
PyLab modulehttp://wiki.scipy.org/PyLab
R Version 3.0.1http://www.r-project.org/
reshape2 libraryhttp://had.co.nz/reshape
ggplot2 Bibliothekhttp://ggplot2.org/
Gene ComposerPSI Techhttp://www.genecomposer.net<
West Coast Metabolomics CenterUC Davishttp://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0https://www.dna20.com
Portaltd colspan="4">Dienstleistungen:

Referenzen

  1. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
  2. Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
  3. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  4. Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).
  5. Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).
  6. Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).
  7. Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113 (2), 171-182 (2003).
  8. Calendar, R., Abedon, S. T. The bacteriophages. , Oxford Univeresity Press. (2006).
  9. Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).
  10. Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).
  11. Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).
  12. Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424 (6950), 741(2003).
  13. Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).
  14. Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).
  15. Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).
  16. Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3 (5), e144(2005).
  17. Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).
  18. Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).
  19. Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).
  20. Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).
  21. Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8 (8), e1002657(2012).
  22. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  23. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).
  24. Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. , (2014).
  25. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).
  26. Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf (2014).
  27. Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341(2010).
  28. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6 (3), e17288(2011).
  30. Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4 (9), e7002(2009).
  31. Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).
  32. Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).
  33. Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).
  34. Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).
  35. Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).
  36. Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).
  37. Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).

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