Ein Verfahren zum Fern Silencing neuronale Aktivität in Nagetiere Während diskreter Phasen des Lernens

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie neuronale Aktivität in diskreten Gehirnregionen vorübergehend und aus der Ferne zum Schweigen gebracht werden kann, während Ratten mit Lern- und Gedächtnisaufgaben beschäftigt sind. Der Ansatz kombiniert Pharmakogenetik (Designer-Rezeptoren-Exklusiv-aktiviert-durch-Designer-Medikamente) mit einem Verhaltensparadigma (sensorische Präkonditionierung), das darauf ausgelegt ist, zwischen verschiedenen Komponenten des Lernens zu unterscheiden.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie vorübergehend zum Schweigen zu bringen und aus der Ferne die neuronale Aktivität in einzelnen Gehirnregionen, während die Tiere in Lern- und Gedächtnisaufgaben beschäftigt. Der Ansatz kombiniert Pharmakogenetik (Designer-Rezeptoren-Exklusiv-Activated-by-Designer-Drogen) mit einem Verhaltensparadigma (sensorischen Präkonditionierung) dazu bestimmt ist, zwischen verschiedenen Lernformen zu unterscheiden. Insbesondere wird viral-vermittelte Abgabe verwendet werden, um eine genetisch modifizierte inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor (der Designer Receptor) in einer diskreten Region des Gehirns im Nagetier auszudrücken. Drei Wochen später, als Designer-Rezeptor-Expressionsniveaus hoch sind, ein pharmakologisches Mittel (der Designer Drug) wird systemisch 30 Minuten vor einem bestimmten Verhaltens Sitzung verabreicht. Das Arzneimittel besitzt eine Affinität für den Designer-Rezeptor und damit zu einer Hemmung der Neuronen, die den Designer-Rezeptor exprimieren, ist ansonsten biologisch inert. Die Hirnregion bleibt für 2-5 Stunden zum Schweigen (DEPENDing von der Dosis und dem Weg der Verabreichung). Nach Beendigung der Verhaltensparadigma wird Hirngewebe für die korrekte Platzierung und Rezeptor-Expression bewertet. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Bestimmung der Anteile der einzelnen Gehirnregionen bestimmte Komponenten von Verhalten und kann über eine beliebige Anzahl von Verhaltensparadigmen verwendet werden.

Einleitung

Eine spannende Herausforderung auf dem Gebiet der Behavioral Neuroscience ist es, die neuronalen Substrate komplexe Verhaltensweisen zu bestimmen. Eine Anzahl von Techniken, wie beispielsweise Dauer Läsionen, temporäre Gehirn Inaktivierung über Kanülenimplantate und Optogenetik verwendet worden sind, um die Beiträge der einzelnen Gehirnregionen zu Subkomponenten komplexe Verhaltensweisen zu identifizieren. Während diese Ansätze informieren unser Verständnis der regionalen Spezifität beim Lernen, ist jede Technik nicht ohne Einschränkungen. Insbesondere werden Läsionen typischerweise permanent durchgeführt vor der Verhaltenstests, wodurch ihre Wirkung während der gesamten Dauer des Paradigmas vorliegen. Kanülierung Studien, die die Vorlage eines kurzfristigen neuronalen Inaktivator (zB Tetrodotoxin) beinhalten können erhebliche Schäden an Hirngewebe zu produzieren und können Stress bei Patienten kurz vor der Verhaltenstests zu induzieren. Weiterhin wird die Inaktivierung durch Kanülierung in die Region des Gewebes, die die Umgebung begrenztSpitze der Kanülen. Schließlich, während Optogenetik bietet eine Reihe von Flexibilität für die zeitliche Steuerung der Aktivität in bestimmten Hirnregionen, ist es kostspielig und technisch anspruchsvoll.

Diese Einschränkungen können mit einer pharmakogenetischen Ansatz (Designer-Rezeptoren-Exklusiv-Activated-by-Designer-Drogen, DREADDs) ^1,2 überwunden werden. Wichtig ist, dass, während das Konzept der Pharmakogenetik ist anspruchsvoll, ist die Ausführung der Technik unkompliziert. Ähnlich herkömmlichen stereotaktischen chirurgischen Methoden, die Infusion von Toxin (zB NMDA, Ibotensäure) in diskreten Gehirnbereichen beinhaltet diese Technik das Infundieren eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), die ein DNA-Fragment für ein modifiziertes inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor enthält beinhalten (hM4Di; der Designer-Rezeptor) in dem interessierenden Bereich von Standard-Labornagern (siehe Abbildung 1). Der virale Vektor enthält auch einen fluoreszierenden Reporter (mcitrine). Einmal in eingeauf Zellen, die Designer-Rezeptor (und Reporterprotein) maximal exprimiert ~ 3 Wochen nach der Infusion und selektiv für 2-5 Stunden nach der systemischen Verabreichung des ansonsten biologisch inert Designerdroge, Clozapin-N-oxid aktiviert werden (CNO) ^{1 , 3.} Weil der Experimentator mit präziser, noch remote zeitliche Kontrolle über neuronale Aktivität in bestimmten Hirnregionen ausgestattet, kombiniert Pharmakogenetik besonders gut mit Verhaltensparadigmen, die in mehreren Phasen durchgeführt werden. In diesem Beispiel ist der Beitrag der retrosplenialen Cortex (RSC) auf einen Reiz-Stimulus Lernen wird zu seiner Rolle bei Pavlovian Lernens verglichen jedoch Kombination dieser beiden Ansätze ist gut geeignet, um eine beliebige Anzahl von Fragen, die zu ermitteln, wie bestimmte Hirnregionen tragen zu suchen komplexes Verhalten.

Darüber hinaus, während in dem vorliegenden Protokoll beschrieben, können virale und transgene Ansätze verwendet werden, um Zelltyp-spezifische Expression DREADD ² zu erzielen. Da ichs eigen Verhaltensparadigmen, die pharmakologischen und / oder andere Arten von experimentellen Manipulationen, sorgfältige Prüfung der Versuchsaufbau und die anschließende quantitative Analyse beteiligt ist erforderlich, wenn unter Verwendung der DREADD Ansatz. Experimentatoren neu in der DREADD Ansatz sind, um eine umfassende Überprüfung der derzeitigen DREADD Technik ² bezeichnet.

Jeden Tag Organismen lernen Sie neue Impulse und Ereignisse und ihre Beziehungen untereinander. Selbst in einer vertrauten Umgebung, wie zu Hause, ist eine schnell zu Veränderungen in den Beziehungen zwischen Reizen zu erkennen, weil diese Änderungen können prädiktiv für sinnvolle Veranstaltungen. Solche Stimulus-Stimulus (dh relational) beinhaltet die Lernzusammengehen mehrerer Reize und ist traditionell mit dem Hippocampus, die zentral innerhalb des medialen Temporallappens ⁴ wohnt in Verbindung gebracht. Allerdings ist der Hippocampus nicht vorhanden, noch isoliert handeln; kortikalen Regionen innerhalb und außerhalbSeite der medialen Temporallappen liefern wichtige sensorische Information an den Hippokampus ^5-7. Traditionelle Permanent Läsion Studien liefern überzeugende Beweise für die Beteiligung einer Reihe von kortikalen Regionen (zB die retrosplenialen, postrhinal und entorhinalen Kortex) in hippocampalen abhängigen Lern sind jedoch in ihrer Fähigkeit, die Rolle eines bestimmten Bereichs bei diskreten Phasen unterscheiden begrenzt Lernen ^8-10.

Das vorliegende Protokoll testet die Hypothese, dass die RSC ist für Stimulus-Stimulus Lernen erforderlich, durch Schweigen den RSC während einer einzelnen Phase einer 3-Phasen-sensorische Präkonditionierung Paradigma ^11,12. Kurz gesagt, erhalten Ratten Infusionen eines AAV, die die Designer-Rezeptor umfasst und ca. 3 Wochen später sind die Designer-Droge (CNO) 30 Minuten vor dem Beginn der Verhaltenstests verabreicht. In dem vorliegenden Protokoll zu empfangen Versuchsratten CNO während der ersten Phase der Prüfung (wenn Stimulus-Stimulus learning auftritt), und sie Fahrzeugs während der nächsten 2 Phasen des Tests unterzogen. Um unbeabsichtigte Auswirkungen der CNO auf Verhalten zu steuern, ziehen Ratten mit dem Designer-Rezeptor (hM4Di) und spritzen mit Fahrzeug statt CNO. Um die für die allgemeine Wirkung von viralen Infusion und Rezeptorexpression Konto, ziehen ein Steuer Virus, das nicht enthält den Designer-Rezeptor und verwalten CNO.

Eine Anzahl von verschiedenen Serotypen von AAV verwendet werden, um genetisches Material zu liefern. Die aktuellen NIH Richtlinien für die Forschung an rekombinante oder synthetische Moleküle behält diese AAV (alle Serotypen) und rekombinante oder synthetische AAV-Konstrukte, in denen das Transgen nicht entweder eine potentiell tumorigenen Genprodukt oder ein Toxinmolekül kodieren, und werden in der Abwesenheit eines erzeugten Helfervirus erfordert BSL-1 Vorsichtsmaßnahmen (Anhang B-1. Risikogruppe 1 (RG1) Agents) ^13. A Anzahl der Bewertungen im Zusammenhang mit AAV-Struktur, Nutzen und Sicherheit sind ^14,15. Bemerkenswert ist, wenn, Aufgrund von Bedenken in Bezug auf mögliche Fortpflanzungs ^16,17 und potenziellen karzinogenen Mechanismen ^18-20 in Nagetieren, einige Institutionen erfordern die Verwendung von BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen bei der Arbeit mit AAV. Überprüfen Sie die entsprechende BSL vor durch Rücksprache mit Aufsichtsgremien bei einzelnen Institutionen in denen die Forschung, die Centers for Disease Control und den NIH-Richtlinien für die Forschung an rekombinanten DNA-Moleküle ¹³ bei der Verwendung von viralen Vektoren für die Gen-Manipulation in den Vereinigten Staaten durchgeführt werden, zu nutzen. Personenschutz, Ermittler Ausbildung, Vektor-Containment, Dekontamination, Entsorgung dekontaminiert Materialien und Nacheinspritzung Tierhaltung Anforderungen werden von diesen Leitlinien festgelegt. Darüber hinaus beraten und folgen geeigneten Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Richtlinien oder gleichwertig institutionellen Aufsichtsgremium Richtlinien, um die sichere Handhabung, Verwaltung und Veräußerung von AAV zu gewährleisten.

Protokoll

Die Verwendung von Tieren werden durch das Oberlin College Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Ausschuss und sind in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren ^21.

1. Vorbereitung für Viral Infusion

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet BSL-1 Vorsichtsmaßnahmen. Beim Einsatz BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen, eine Einweg-Kittel, Handschuhe, Überschuhe, Augenschutz und soll ein Beatmungsgerät (Typ N95) erforderlich. Alle Individuen Umgang BSL-2-Verbindungen müssen fit für ein Beatmungsgerät getestet von einer lokalen Einrichtung des Gesundheitswesens werden. Siehe Lowery & Majewska (2010) ²² für weitere Informationen zur Handhabung und Lagerung von viralen Vektoren.

1. Beim ersten Gebrauch aliquoten und speichern nicht verwendete Virus in 20 ul Reaktionsgefäße zu wiederholtem Einfrieren und Auftauen vermeiden.
2. Bereiten Sie die Arbeitsfläche, indem Sie alle nicht benötigten Objekte und Sterilisieren der Oberfläche mit 70% Ethanol. Bereiten Sie eine 10% Bleichlösung zur Dekontamination von AAV Abfall. Legen Sie einen Becher voll von der Bleichlösung und einer sterilen 10 & mgr; l-Spritze auf die Arbeitsfläche. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit dem AAV in einen Behälter mit Crushed Ice im Aufbau.
3. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Virus in eine Standard-Schraubstock. Laden Sie eine 10 & mgr; l-Spritze mit mindestens 4 ul AAV. Darauf achten, dass die Spitze der Spritze gegen den Boden der Mikrozentrifugenröhrchen während des Ladens zu biegen. Sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den 4 ul AAV Lösung in der Spritze.
4. Entsorgen Sie das leere Virusrohr in das Becherglas, das 10% Bleichmittel. Bewahren Sie unbenutzte Teile des Virus, wie vom Hersteller angegeben.
5. Fügen Sie zusätzliche 10% Bleichmittel auf den Abfallbehälter und lassen Abfälle zu 30 Minuten vor der Entsorgung der dekontaminierten flüssigen Abfall zu sitzen.
6. Entsorgen Sie die Schutzausrüstung und Kunststoffabfälle in einem Behälter für biologischen wie von den Richtlinien des Instituts beauftragt. Decontaminate jedes Gerät oder Oberflächen, die in Kontakt mit dem Virus mit 10% Bleich kam.

2. Chirurgie

1. Bereiten Sie den OP-Bereich, indem absorbierenden Papierbank unter der stereotaktischen Apparat und auf einer als dedizierte Virenhandhabungsbereich bezeichnet angrenzenden Raum.
   1. Legen Sie eine 10% Bleichabfallbehälter in den dedizierten Virus Handhabungsbereich in der Nähe der Operationsvorrichtung.
2. Induzieren einen stetigen Niveau der Anästhesie und bereiten die Ratte für die Chirurgie.
   1. Zeigen die Ratte in einer Induktionskammer, die eine Mischung von Isofluran Gas (im Bereich von 1 bis 3%) und Sauerstoff (100% auf etwa 1 l / min) enthält, bis es zu einem Verlust des Bewusstseins und Fehlens des Brutto gezielte Bewegung. Aufrechtzuerhalten Isoflurananästhesie gesamten chirurgischen Prozedur.
   2. Nach 6 tiefe Narkose erreicht ist, rasieren die Ratte aus zwischen den Augen bis leicht hinter den Ohren.
   3. Legen Sie die Ratte zurück in die Induktionskammer für einweitere 1-3 min.
   4. Sicherzustellen, dass der Isoflurananästhesie System ist mit dem Nasenkonus des stereotaktischen Chirurgie verbunden sind. Öffnen des Hahnes auf das Isofluran Schlauch, um den Fluss von Isofluran zum stereotax beginnen. Aufrechterhaltung der Isofluran und Sauerstoff bei den oben genannten Ebenen.
   5. Legen Sie die Ratte in einem stereotaktischen Apparat durch die Sicherung der Mund auf den Biss Bar und der Sicherung der Ohr-Bars.
   6. Gelten Augensalbe für die Augen und Betadin zum Operationsort vor Einschnitt.
3. Machen Sie eine 2,4 cm Mittellinienschnitt der Haut auf der dorsalen Oberfläche des Schädels ab ca. 2 mm kaudal auf die Augen. Ziehen Sie die Haut, um den Schädel freizulegen. Von Zeit zu Zeit zu vermitteln steriler 0,9% iger steriler Kochsalzlösung an den Rändern der Operationsstelle zu Geweben vor dem Austrocknen zu verhindern.
4. Klare membranöse Gewebe vom Schädel bis Bregma und Lambda sind deutlich sichtbar.
5. Stellen Sie sicher, dass der Schädel ist Ebene durch Messung der dorsal-ventralen Koordinaten anBregma und Lambda. Stellen Sie den stereotaktischen Gerät entsprechend bis dorsal-ventralen Koordinaten Bregma und Lambda um nicht mehr als 0,04 mm.
6. Zu dieser Zeit reduzieren die Isofluran Gas zwischen 2 und 2,5%.
7. Bringen Sie den Bohrer zu Bregma, Rezero den Koordinaten und bewegen Sie dann den Bohrer auf die gewünschte medial-lateral und anterior-posterior zu koordinieren.
8. Bohren Sie ein Loch an der Koordinate mit einem 0,9 mm Bohrer, da sie eine geeignete Größe Loch für eine 28 G Infusionsspritze erzeugt.
9. Stellen Sie die Infusionspumpe Virus bei einer Rate von 0,2 ml / min zu liefern. Legen Sie die Spritze in die Infusions Arm der stereotaktischen Gerät und senken Sie die Spritze in die gewünschte koordinieren. Geben Sie die gewünschte Menge an Virus (Bereich 0,1 bis 0,8 & mgr; l). Zum Beispiel liefern 0,8 ul von AAV als 4 min.
   Anmerkung: Pilotstudien durchzuführen, um die ideale Infusionsvolumen und die typische Ausbreitung des Virus in jeder Region von Interesse zu bestimmen.
   1. Nach der Lieferung von Virus cosolute Lassen Sie die Spritze in Platz für 10 min zum Rückfluss in den Nadeltrakt zu verhindern. Langsam heben Sie die Spritze mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 mm / min. Wiederholen, bis alle Koordinaten mit AAV infundiert worden.
10. Schließen Sie die Wunde mit Operationsklammern und Mantel die Wunde mit topischen antibiotischen Salbe.
11. Folgen Sie den Richtlinien des Instituts für die postoperative Schmerztherapie.
12. Legen Sie die Ratte in einem Käfig mit Decken und Kissen, einem Deckel und ordnungsgemäße Beschilderung und gibt die Ratte auf die Tierhaltung.
    1. Wenn Arbeiten unter BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen, sammeln Bettwäsche für die Höhe der Zeit (in der Regel 48 bis 72 h) von institutionellen Richtlinien festgelegt. Zeigen Betten in ein biohazard Abfallbehälter.
    2. Entsorgen Sie alle AAV-kontaminierten Materialien wie von Richtlinien für ihre sichere Entsorgung angegeben.

3. Behavioral Vorrichtung

Hinweis: Die sensorischen Präkonditionierung Gerät besteht aus einem Standard-operante Konditionierung Chamber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) mit einem Edelstahl-Gitterboden, 2 Seitenwänden aus Plexiglas und 2 Metallwände.

1. Montieren Sie eine 2,8 W Licht auf eine der Aluminiumwände, die als Hauslicht dienen und als visueller Reiz, wenn sie bei 2 Hz blinkt. Montieren Sie einen Lautsprecher an der Kammer, um die auditive Reize liefern (10 sec, 1500 Hz, 78 dB und einen reinen Ton dB Rauschen 10 sec 78).
   1. Verwenden Sie eine Futterraufe auf 45 mg Futterpellets in die Nahrungs Tasse zu liefern. In der Lebensmittelbecher, Infrarotlichtschranken erkennen die gesamte Zeit in der Lebensmittel Tasse verbrachte vor, während und nach der Präsentation der Reize und Lebensmittel Belohnungen.
   2. Haus die Kammern in schalldämpfenden Gehäuse (22 "W x 22" H x 16 "D) mit Abluftventilatoren ausgestattet (~ 68 dB).
   3. Verwenden Sie einen PC mit Med Associates-Software, um die operante Kammer zu steuern und erfassen die Daten. Während der Sitzungen Anlage, sammeln Daten über die Gesamtzeit, während presenta mit dem Kopf verbrachte in der Lebensmittel Tassetion der Lichtreiz (5 sec Epoche) und während der Präsentation der Speisen Belohnung (5 sec Epoche). Während der Test-Session, sammeln Daten über die Gesamtzeit, in der Lebensmittel Tasse an Präsentationen der auditive Reize verbrachte in Reaktion (10 sec Epoche Anfang, wenn die akustische Reize werden beendet).

4. Überblick über die Sinnes Präkonditionierung Paradigm

1. Nach Erholung von der Operation, nach und nach Nahrung zu beschränken, die Ratten zu 85% ihrer freien Fütterung Körpergewicht. Wenden Veterinärpersonal nach einem geeigneten Nahrungsmittelbeschränkung Paradigma.
   Anmerkung: Die 3-Phasen-sensorischen Vorkonditionierung Paradigma ist in Abbildung 2 dargestellt.
2. Präkonditionierung Sessions (Phase 1; Täglich 64 min Training über 4 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt):
   1. Vorliegenden Ratten mit 12 vermischt Studien, die der Lieferung von auditiven und visuellen Stimuli bestehen. Gehören unter Untersuchungsintervalle, dass durchschnittlich 4,5 min (Bereich 4,0 bis 5,0 min) nach jeder einuditory Präsentation.
   2. Am 6. der Versuche, ein Ton vorhanden (vorkonditioniert Stimulus) für 10 sec, unmittelbar gefolgt von einer 5 s Präsentation der blinkenden Lichtreiz.
   3. An den anderen 6 Studien präsentieren die weiße Rauschen (ungepaarten Stimulus) allein für 10 sec.
3. Anlage Sitzungen (Phase 2; Täglich 64 min Schulungen über 5 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt):
   1. Vorliegenden Ratten mit 8 Studien, die der Lieferung der visuellen Reiz (die blinkende Lichtreiz) für 5 Sekunden aus, unmittelbar gefolgt von Lieferung von zwei 45 mg Futterpellets. Gehören unter Untersuchungsintervalle, dass durchschnittlich 7 Minuten (Bereich 6,0 bis 8,0 min) nach jedem Versuch. Gelegentlich Ratten benötigen mehr als 5 Anlage Sitzungen, um den Lichtnahrungs Verein zu lernen.
4. Test Session (Phase 3; eine einzige Sitzung 78 min):
   1. Präsentieren Sie die Ratten, die mit 12 vermischt Studien, die der Lieferung der auditive Reize allein bestehen. Gehören unter Untersuchungsintervalle aveWut 4,5 min (Bereich 4,0 bis 5,0 min) nach jedem Gehör Präsentation.
   2. Am 6. der Versuche stellen den Ton Reiz (Stimulus die vorkonditioniert) allein für 10 sec.
   3. An den anderen 6 Studien präsentieren die weiße Rauschen (das ungepaarte Stimulus) allein für 10 sec.
5. Gegengewicht zu den Stimuli durch die Vollendung der Studie mit einer zweiten Gruppe von Ratten, die weißes Rauschen als vorkonditioniert Reiz und den Klang wie die ungepaarten Reiz erhalten.

5. Pharmakologische und Verhaltensordnung

1. Schalten Sie das Gerät an den Verhaltens Gerät und laden Sie die Med-PC-Code für das entsprechende Verhaltens Sitzung. Draht und die Verhaltens-Programm Gerät, so dass die Fans, die auf den Schalldämpfungsschränke montiert sind einzuschalten, wenn der Strom eingeschaltet ist.
2. Um eine 1 mg / ml-Lösung von Clozapin-N-oxid (CNO) vorzubereiten, wiegen 5,0 mg CNO in einen 15 ml konischen Rohr und 5 ml sterilem Wasser oder 5 ml steriler 0,9% saline. Vortex, bis die Lösung klar ist.
   1. Wenn CNO nicht in Lösung aufzulösen oder wenn konzentriertere Lösungen von CNO gewünscht hinzuzufügen ein Solubilisierungsmittel, wie DMSO ^23. Insbesondere, um eine 1 mg / ml-Lösung von CNO mit 0,5% DMSO herzustellen, wiegt 5,0 mg CNO und füge 25 ul DMSO zu einer 15 ml konischen Röhrchen. Flick leicht sichergestellt wird, dass der Inhalt an der Basis der Röhre verbleiben. Wenn die Lösung klar wird, mit 5 ml sterilem Wasser oder 5 ml steriler 0,9% iger Kochsalzlösung. Weitere Anleitungen zur Herstellung von Lösungen von CNO sind auf der DREADD Wiki-Ressourcenseite ²⁵ zur Verfügung.
   2. Bereiten Sie jeden Tag, die es verabreicht wird, eine neue CNO-Lösung.
3. Spritzen den CNO intraperitoneal in einer Dosis von 1 mg / kg, etwa 30 Minuten vor dem Verhaltenstests. B. spritzen ein 200 g Ratte mit 0,2 ml der 1 mg / ml Lösung CNO. Die Dosis und Zeitverlauf der CNO Verwaltung wurden auf der Grundlage bisher veröffentlichten Berichte ^2,12 ausgewählt.
   1. Injizieren CNO 30 Minuten vor jeder Sitzung Präkonditionierung (Phase 1; insgesamt 4 Tagen Injektionen), sondern verwalten das Fahrzeug vor allen nachfolgenden Verhaltens Sitzungen.
4. Nach 30 Minuten, legen Sie die Ratten in den Verhaltenstests Kammern und starten Sie die Computer-Code für die entsprechende Verhaltens Sitzung.
5. Nach Abschluss der verhaltens Aufgabe sofort den Ratten aus den Kammern und zurück die Ratten zur Tierkolonie.

6. Analyse der Verhaltensdaten

Hinweis: Die abhängige Variable für alle Verhaltens Sitzungen ist die Zeitdauer, die den Kopf der Ratte ist in der Nahrungsmittelbecher durch Unterbrechung des Infrarot-Lichtschranken in der Lebensmittel Tasse erkannt. Die Daten (in sec) werden gesammelt und von der Computersoftware aufgezeichnet.

1. Führen Sie keine Analysen auf Daten, die während der Vorkonditionierungsphase erzeugt.
2. Für die Konditionierung Sitzungen: Analysieren Sie jede Ratten einkeit, die leichte Kost Verein durch den Vergleich Food Tasse Verhalten während der Präsentation der visuellen Reiz über die 5 Verhaltenssitzungen erlernen. Genauer gesagt, die Berechnung der durchschnittlichen Zeit in der Lebensmittel Tasse verbrachte während der 5 sec Licht Epoche für jede 8 Studien / Sitzung (dh durchschnittlich 8 Studien, die jeweils 5 sec Dauer / Ratte sind). Vergleiche zwischen den mittleren Kontroll- und Versuchswerte für jede der 5 täglichen Sitzungen (siehe 3A).
   1. Analysieren Sie die Ratten "Motivation, Futterbelohnung durch Vergleich Food Tasse Verhalten bei Auslieferung des Futterbelohnung (5 sec Epoche) über die 5 Verhaltens Sitzungen mit dem gleichen Berechnung wie für den 5 sec Licht Epoche oben genannten zu erhalten. Diese Werte werden ständig höher als die während der Präsentation der visuellen Stimulus erworben werden (siehe 3B).
3. Für die Testsitzung: Berechnung eines Unterscheidungsquote, die die Ratten "Food Tasse Verhalten als Reaktion auf pres beschreibttationen jedes auditorischen Reizes.
   1. Insbesondere wird für jede Ratte, unterteilen die durchschnittliche Zeit nach jedem von 6 Darstellungen der sensorischen vorkonditioniert Stimulus (dh der Ton) durch die Summe der durchschnittlichen Zeit, in der Lebensmittelbecher verbracht in der Lebensmittelbecher verbracht folgenden jeweils von 6 Darstellungen der sensorischen vorkonditioniert Stimulus (dh der Ton Anregung) plus dem Durchschnitt der Gesamtzeit in der Lebensmittelbecher verbracht folgenden jeweils von 6 Darstellungen der ungepaarten Stimulus (dh das weiße Rauschen Stimulus). Jede Epoche ist 10 Sekunden in Dauer.
      Hinweis: Eine Diskriminierung Score von 0,5 oder mehr zeigt, dass Ratten gelernt, die Verbände die sich aus der sensorischen Präkonditionierung Paradigma.

7. Überprüfung der AAV Placement und Expression

1. Betäuben und perfundieren die Ratten transkardial mit 4% Paraformaldehyd. Aufgrund der Verwendung von Fluoreszenzmarkern, keinen post-Fixierungszeit von 2 h nicht überschreiten zu minimize Verlust der Antigenität und um das Fluoreszenzsignal zu erhalten.
2. Dehydratisieren perfundierten Gehirnen indem sie in einen Gehirn Gefäß mit 30 ml einer 20% Saccharose-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x) für mindestens 2 Tage lang oder bis das Gehirn sinkt auf den Boden des Gehirns Glas.
3. Verwenden eine Gefrier Schlittenmikrotom koronalen Hirnschnitten (20-40 & mgr; m) über den gesamten Umfang der rostrokaudale dem interessierenden Bereich zu machen.
4. Zuführen Immunhistochemie gegen den markierten Rezeptor oder dem Reporterprotein gerichtet, um den Ort und die Expression des Designers Rezeptor und / oder ^Reporter-12 zu ermitteln. Ein Immunhistochemie Färbung Protokoll basiert auf dem DREADD Wiki-Ressourcenseite ²⁵ zur Verfügung gestellt.
5. Montieren Sie die Schnitte auf Superfrost-plus Folien und Deckglas mit 100-200 & mgr; l einer wässrigen Eindeckmedium.
6. Führen Fluoreszenzmikroskopie auf Hirngewebe zu AAV Platzierung und Proteinexpression ^12,24 überprüfen.

Ergebnisse

Behavioral Ergebnisse

Bei Beendigung des Versuchs sollte die Wirksamkeit der regionsspezifischen temporären Inaktivierung quantitativ und qualitativ bewertet werden. Das vorliegende Beispiel beinhaltet eine 3-Phasen-Verhaltensparadigma (sensorischen Präkonditionierung), in dem CNO wurde verabreicht, um die neuronale Aktivität in dem RSC während der Vorkonditionierung Sitzungen zu dämpfen, um die Hypothese, dass die RSC ist notwendig für die Bildung von Assoziationen zwischen neutralen Stimuli <...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie man einen pharmakogenetischen Ansatz (DREADD) anzuwenden, um zu untersuchen, wie eine bestimmte Hirnregion trägt zu einer Mehrphasen komplexen Lernaufgabe. Mit der Fähigkeit, vorübergehend zum Schweigen zu bringen und aus der Ferne neuronalen Aktivität in Hirnregionen in diskreten Phasen des Lernens, diese Kombination von Ansätzen bietet eine Plattform, um eine breite Palette von Verhaltensweisen, einschließlich differenzierter oder maskiert Lernformen zu untersuchen. Bei dem in diesem P...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Männlich, Long Evans Ratten, 55-60 Tage alt	Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine	Virus Vector Core		Vorsicht: Dies ist eine BSL-1-Verbindung
rAAV8/hSyn-GFP	Virus Vector Core		Vorsicht: Dies ist eine BSL-1-Verbindung
Clozapin-N-oxid	R& D Systems	4936-10	Designerdroge
Rattenkäfigdeckel (Polycarbonat)	Alternatives Design	FT 8XL-PC	Wird zum Abdecken von Tierkäfigen verwendet 48-72 Stunden nach der Infusion
Filterpapier (Ersatz)	Alternatives Design	FP-R-1018XAD	Filterpapier, das zu Käfigdeckeln passt
Tischschraubstock	JETS	2201-265	Zum Halten von Mikroscentrifuge-Röhrchen mit AAV in der Haube
	Heftklammern	113444	Medline Biohazard-Auskleidungen
Biohazard-Mülleimer			United Solutions 34 Gallonen rechteckiger Mülleimer auf Rädern mit Haken und Verschlussgriff
Isofluran, 100 ml	Patterson Veterinary Supply Inc.	07-890-8540	Anästhetikum
Duales stereotaktisches Kleintier mit Digitalanzeige Anzeigekonsole	David Kopf	Modell 942	Chirurgische Geräte
reißende Ohrbügel, 2er Set (Ratte)	David Kopf	Modell 955	Chirurgische Geräte
Anästhesiemaske (Ratte)	David Kopf	Modell 906	Chirurgische Geräte
Der stereotaktische Hochgeschwindigkeitsbohrer umfasst eine Tischmotorsteuerung, ein Fußpedal, ein Handstück und einen stereotaktischen Handstückhalter	David Kopf	Modell 1474	Chirurgische Ausrüstung
Mikrobohrfräser, 0,9 mm	Fine Science Tools Inc	19007-09	Chirurgisches Zubehör
Automatisierte Spritzenpumpe mit Micro4-Controller	David Kopf	Modell UMP3-1	Chirurgische Ausrüstung
Abnehmbare Keramikklinge für Tiere Clipper-Kit	Ahdis	21420	Chirurgisches Zubehör
Betadine Hautreiniger	Perdue Products L.P	67618-149-04	Chirurgisches Zubehör
Dreifache antiobiotische Salbe	Medline Supply	53329-087-01	Chirurgisches Zubehör
Puralube Tierarztsalbe	Nur Veterinärbedarf	17033-211-38	Chirurgisches Zubehör
Dino-lite	Mikroskop	AD7013MTL	Eine Alternative zum herkömmlichen Präparierskop
Dino-lite starres Tischstativ mit Ausleger	Mikroskop	MS36B	Chirurgische Ausrüstung
28 G 10 μ l Spritze	Hamilton	80308-701SN	Chirurgische Ausrüstung
Extra hohe MDF-Schalldämpfungskabine	Med Associates, Inc	ENV-018MD	22' B x 22" H x 16" D
Extra hohe modulare Testkammer	Med Associates, Inc	ENV-007	Verhaltensausrüstung
Edelstahlgitterboden	Med Associates, Inc	ENV-005	Verhaltensausrüstung
Hausleuchte	Med Associates, Inc	ENV-215M	Wird als Hauslicht und Stimuluslicht verwendet
Modularer Pelletspender	Med Associates, Inc	ENV-203M-45	Verhaltensausrüstung
Pelletbehälter, Bechertyp	Med Associates, Inc	ENV-200R1M	Verhaltensausrüstung
Kopfeintrittsdetektor für Ratte	Med Associates, Inc	ENV-254-CB	Verhaltensausrüstung
Staubfreie Präzisions-Lebensmittelpellets, 45 mg	Bio-Serv	F0165	Verhaltensversorgung
Käfiglautsprecher für Rattenkammer	Med Associates, Inc	ENV-224AM	Verhaltensausrüstung
Programmierbarer Audiogenerator	Med Associates, Inc	ANL-926	Verhaltensausrüstung
Smart Ctrl 8 Eingabe/16 Ausgangspaket	Med Associates, Inc	DIG-716P2	Verhaltensausrüstung
Großer Tischschrank und Netzteil	Med Associates, Inc	SG-6510D PCI-Schnittstellenpaket	Verhaltensgeräte
	Med Associates, Inc	DIG-700P2-R2	Verhaltensgeräte
MED Intel Core Computer Pkg mit X Pro 19" Monitor	Med Associates, Inc	COM-103V	Verhaltensgeräte
Paraformaldehyd (grannular), 1 kg	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	19210	Gefahr: krebserregend,
der Haube Monoklonaler Kaninchen-Antikörper (HA-Tag)	Cell Signaling Technologies	3724S	Histologie-Reagenz
XP Kaninchen monoklonaler Antikörper (GFP)	Cell Signaling Technologies	2956S	Histologie-Reagenz
Anti-Kaninchen-IgG	Cell Signaling Technologies	4412S	Histology liefert
Superfrost plus Objektträger	VWR international	483111-703	Histologiebedarf