Methodenartikel

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

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DOI:

10.3791/52862

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11. Juni 2015

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1Center for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um die Interaktion von Bakterien mit den Blutgefäßen unter Scherspannung zu untersuchen, werden eine Strömungskammer und ein in vivo mesenteriales Intravitalmikroskopie-Modell beschrieben, die es ermöglichen, die bakteriellen und Wirtsfaktoren zu entschlüsseln, die zur Gefäßadhäsion beitragen.

Zusammenfassung

Um endovaskuläre Infektionen und Endokarditis führen, müssen Bakterien in der Lage, an der Gefäßwand, während sie mit der Schubspannung des strömenden Bluts ausgesetzt haften.

Um die Bakterien und Wirtsfaktoren, die zu Gefäß Adhäsion von Mikroorganismen beitragen zu identifizieren, werden geeignete Modelle, die diese Interaktionen unter physiologischen Scherbedingungen zu studieren benötigt. Hier beschreiben wir ein in-vitro-Strömungskammer Modell, das die bakterielle Adhäsion an verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix zu untersuchen oder zu Endothelzellen ermöglicht und eine Intravitalmikroskopie Modell, das entwickelt wurde, um die anfängliche Adhäsion der Bakterien an die splanchnic Zirkulation in vivo direkt visualisieren . Diese Verfahren können verwendet werden, um die Bakterien und Wirtsfaktoren für die Adhäsion von Bakterien unter Strömung erforderlich identifizieren. Wir veranschaulichen die Bedeutung der Scherbelastung und die Rolle der von Willebrand-Faktor für die Adhäsion von Staphyaureus unter Verwendung von sowohl in vitro als auch in vivo-Modell.

Einleitung

Um endovaskuläre Infektionen zu etablieren, benötigen Krankheitserreger einen Mechanismus, um am Endothel zu haften, das die Gefäßwand und die innere Oberfläche des Herzens auskleidet, und um zu bestehen und eine Infektion zu etablieren, obwohl sie der Scherbelastung durch schnell fließendes Blut ausgesetzt sind. Der häufigste Erreger, der lebensbedrohliche endovaskuläre Infektionen und infektiöse Endokarditis verursacht, ist Staphylococcus aureus (S. aureus)1.

Verschiedene bakterielle oberflächengebundene Haftmoleküle vermitteln die Adhäsion an Wirtsgewebe, indem sie mit extrazellulären Matrixkomponenten interagieren. Diese MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) erkennen Moleküle wie Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen und den von-Willebrand-Faktor (VWF). MSCRAMMs sind wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus und sind an der Besiedlung und Invasion des Wirtsbeteiligt 2. Die meisten Studien zu diesen Virulenzfaktoren wurden unter statischen Bedingungen durchgeführt und sind daher möglicherweise nicht repräsentativ für Infektionen beim Menschen, bei denen die anfängliche Adhäsion der Bakterien im fließenden Blut auftritt.

Im Falle von Blutbahninfektionen müssen Bakterien die Scherkräfte des fließenden Blutes überwinden, um sich an der Gefäßwand festzusetzen. Von besonderem Interesse sind daher Modelle, die die Interaktion zwischen Bakterien und Endothel oder Subendothel unter Strömungsbedingungen untersuchen.

Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die Adhäsion von S. aureus an Blutgefäße unter Scherspannung durch VWF3 vermittelt wird. VWF, ein Scherspannungs-operationelles Protein, wird bei der Aktivierung aus den Endothelzellen freigesetzt. Zirkulierendes VWF bindet an Kollagenfasern der exponierten subendothelialen Matrix. Unsere Gruppe berichtete, dass das von-Willebrand-Faktor-bindende Protein (vWbp) von S. aureus entscheidend für die Scher-vermittelte Adhäsion an VWF4 ist.

In diesem Artikel stellen wir ein in vitro Durchflusskammermodell vor, in dem die bakterielle Adhäsion an verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix oder an Endothelzellen bewertet werden kann. Um die Ergebnisse aus In-vitro-Daten zu validieren, haben wir ein In-vivo-Modell entwickelt, das die direkte Interaktion von Bakterien mit der Gefäßwand und die Bildung von Bakterien-Thrombozyten-Thromben im Mesenterialkreislauf von Mäusen mit Hilfe der intravitalen Gefäßmikroskopie in Echtzeit visualisiert und quantifiziert.

Protokoll

Tierversuche wurden von der Ethikkommission der KU Leuven genehmigt.

1. Vorbereiten Bakterien für In-vitro-Perfusionen und In-vivo-Experimente

  1. Wir verwendeten S. aureus-Stamm Newman für alle in dieser Handschrift beschriebenen Experimente. S. aureus Newman in Brain Heart Infusion (BHI) mit 10% Glycerin bei -80 ° C gelagert.
  2. Verwenden Sie eine sterile Schleife, um die gefrorenen Bakterien bei 37 ° C (OD 600> 3) abkratzen und impfen in 5 ml CASO-Bouillon (TSB) O / N.
  3. Waschen der Bakterien durch Zentrifugation (2.600 g, RT, 5 min) und Resuspension des Bakterienpellets in 5 ml PBS (phosphatgepufferte Salzlösung).
  4. Eine 1 mg / ml Lösung von 5 (6) -Carboxy-fluorescein-N-hydroxysuccinimidylester (Carboxyfluorescein) in Ethanol. Verdünne die 1 mg / ml Carboxy-Fluorescein-Lösung zu 150 & mgr; g / ml in Wasser in Laborqualität (zB MilliQ Wasser). Schützen Sie die Rohre vor Lichtmit Aluminiumfolie und bei -20 ° C.
  5. Zentrifugieren Bakterien (2.600 xg, RT, 5 min). Resuspendieren der Bakterienpellets in 800 & mgr; l PBS und 200 & mgr; l (Endkonzentration 30 ug / ml für die Perfusion Experimente) oder 400 & mgr; l (Endkonzentration 50 ug / ml für die in vivo-Experimente) der 150 ug / ml Carboxy-Fluorescein-Lösung. Schützen Sie die Rohre von Licht mit Aluminiumfolie und Inkubation für 30 min bei RT auf einem Schüttler.
  6. Nach der Markierung Block mit 6% Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung in PBS.
  7. Verdünnte Bakterien mittels optischer Densitometrie (OD), eine OD 600 von 0,65 für die in vitro-Experimente (entsprechend etwa 3 × 10 8 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml für S. aureus) und eine OD 600 von 1,8 für die in vivo-Experimente ( entsprechend etwa 1 x 10 9 CFU / ml für S. aureus) in PBS. Schützen Sie die Rohre von Licht mit Aluminiumfolie und verlassen auf dem Eis.

2. In Vitro Perfusionsexperimenten

  1. Beschichtung der Deckgläser
    1. Verdünnter von Willebrand Faktor (VWF) (Haemate P, Stammkonzentration 2,400 ug / ml) in Laborqualität Wasser (entionisiertem destilliertem) bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml.
    2. Verdünnter Kollagen in isotonischer Glucoselösung (SKF-Lösung, pH 2,7-2,9, wie vom Hersteller geliefert) in einer Endkonzentration von 160 ug / ml.
    3. Coat Deckgläser (24 x 50 mm) mit VWF oder Kollagen durch Fallenlassen 200 ul der Beschichtung auf Parafilm und legen Sie das Deckglas auf der Oberseite des Tropfens. Das Tröpfchen entlang der Oberfläche des Deckglases verteilt.
    4. Inkubiere das Deckglas in einem befeuchteten Behälter für 4 h bei RT. Die Deckgläser aus dem Parafilm Heben Sie mit einer stumpfen Nadel. Montieren Sie das Deckglas in den unteren Teil der Durchflusskammer.
  2. Beschichtung von Kunststoff Slips mit Endothelzellen
    1. Coat Kunststoff rutscht(1-well PCA Zellkulturkammer, Sarstedt, Deutschland) mit 1 ml einer 1% igen Gelatinelösung in PBS und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Samen menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) auf den mit Gelatine beschichteten Kunststoff rutscht und sie wachsen zu 70-80% Konfluenz. Montieren Sie die Kunststoff-Schlupf in den unteren Teil der Durchflusskammer.
  3. Perfusion Experiment
    ANMERKUNG: Eine schematische Übersicht der in vitro Perfusionsmodell ist in Figur 1 dargestellt.
    1. Führen in vitro bakterielle Adhäsion Studien in einem Mikroparallelplattenflusskammer in einer laminaren Scherspannung zwischen 2,5 dyne / cm 2 und 20 dyne / cm 2, um verschiedene physiologische Strömungsbedingungen zu simulieren.
    2. Die Durchflusskammer (Inhouse-Design) besteht aus einem Metallrahmen und einer Perfusionskammer aus Plexiglas (Poly (methyl) (PMMA)). Indem zu einem hochgenauen Infusionspumpe (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA) verbinden, können wir Strömungs ra erzeugentes zwischen 0,0001 & mgr; l / min und 220.82 ml / min.
    3. Den Schlauch an dem oberen Teil der Strömungskammer und injizieren Mediums im Schlauch. Platzieren danach den oberen Teil der Strömungskammer auf der Oberseite der Bodenteil und der Durchflusskammer zu montieren. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden. Injizieren Sie 1 ml Medium durch die Kammer, um sicherzustellen, dass die Kammer nicht undicht und um überschüssige Beschichtungslösung zu entfernen. Vermeiden Sie Luftblasen.
    4. Platzieren Sie die Maus auf einer thermo-kontrollierten Heizkissen bei 37 ° C auf einem Mikroskop-Fach. Da es sich um ein Anschlussverfahren, gibt es keine Notwendigkeit für strenge aseptische Verfahren. Einen Einschnitt in der Nähe der Halsschlagader, entfernen Sie vorsichtig die rechte Seite der Halsmuskel und zu isolieren, die Halsschlagader aus dem umgebenden Gewebe.
    5. Einrichten der Infusionspumpe und Fluoreszenzmikroskop. Infusionspumpe Einstellungen hängen von der Spritzendurchmesser und die gewünschte Durchflussrate (siehe Abschnitt 2.4). Von nun an arbeiten in einem dunklen Raum.
    6. VWF Beschichtung:
      1. Füllen Sie eine Spritze mit fluoreszenzmarkierten Bakterien und schließen Sie es an das Einlassrohr. Vermeiden Sie Luftblasen. Starten Sie die Infusionspumpe für 10 min. Die Infusionsdauer hängt von der Schergeschwindigkeit und der Beschichtung, Bakterien und Medium verwendet und sollte den stationären Zustand der Haftung darstellen.
      2. Nach 10 min wurde abzuwaschen ungebundene Bakterien durch Verbinden einer Spritze mit PBS mit dem Einlassrohr und dem Start der Infusionspumpe.
      3. Nehmen Sie sich mindestens 15 Bilder oder Filme an verschiedenen Orten nach dem Waschprozess. Bakterien sind kleine und potenziell schwer scharf zu stellen. Vor der in vitro Strömungsexperiment kann die geeignete Brennebene, indem ein Tropfen von fluoreszenzmarkierten Bakterien auf einem Deckglas und Platzieren des Deckglases in der Strömungskammer abgerufen werden. Dann suchen Sie nach dem entsprechenden Brennebene und speichern Sie die Einstellungen.
        HINWEIS: Bei der in vitro Strömungsexperiment Erfassen der Bilder während des Waschschritts (± 5 min nach dem Start) wird sichergestellt, dass nur dieSignal für anhaftende Bakterien eingefangen.
    7. Collagen Beschichtung:
      1. In 60 ug / ml VWF an die fluoreszenzmarkierten Bakterien kurz vor dem Start der Perfusion. Füllen Sie eine Spritze mit fluoreszenzmarkierten Bakterien oder fluoreszenzmarkierten Bakterien, die mit 60 ug / ml VWF ergänzt und an das Einlassrohr. Vermeiden Sie Luftblasen. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5.2 bis 2.3.5.3
    8. Endothelzellen:
      1. Aktivierung der Endothelzellen durch Perfusion mit einer 0,1 mM Lösung des Ca 2+ -ionophore A23187 (Stammlösung 10 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst ist) in DMEM für 10 min mit einer bei der gleichen Schergeschwindigkeit wie die bakterielle Perfusion durch Perfusion 0,1 mm. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5.2 bis 2.3.5.3.
  4. Berechnen Schergeschwindigkeit und Scherspannung wie folgt.
    Schergeschwindigkeit = 6Q / wh 2
    Wo: Q: Durchfluss in ml / min, w: Breite in cm, h: Höhe in cm
    Schubspannung (τ) = Schub Ratteex Viskosität (μ)
    Wo μ: mittel: 0,01 dyn x sec / cm 2, Vollblut: 0,04 dyn x sec / cm 2
  5. Bildanalyse
    1. Erhalten Sie Live-Bilder mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einem Schwarz-Weiß-Kamera und zu entwickeln, mit Imaging-Software. Verwenden Sie die Belichtungszeit von 1,5 sec. Nehmen Sie mehrere Snapshots (mindestens 15) nach dem Zufallsprinzip über die beschichtete Fläche der Strömungskammer verteilt und speichern Sie sie in das entsprechende Dateiformat.
    2. Führen Sie die Bildanalyse mit ImageJ. Subtrahieren Sie den Hintergrund, um glatte kontinuierliche Hintergründe aus dem Bild (Process - Substract Hintergrund) zu entfernen und legen Sie die Schwelle zum unteren und oberen Schwellenwerte festgelegt, die Segmentierung von Graustufenbildern in Merkmale von Interesse. Misst die Fläche, auf die Schwelle begrenzt.
    3. Vergleichen bakterielle Adhäsion, ausgedrückt als Fluoreszenzbereich, beispielsweise mit Hilfe von statistischen Analysesoftware. Vergleichen Sie die Gruppen mit one-way ANOVA oder two-tailed Student-t-Test. Berichten alle Werte als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Betrachten wir ein p-Wert von <0,05 signifikant (* p <0,05; ** p <0,01; *** p <0.001).

3. In Vivo Mesenteriale Perfusionsmodell

  1. Vorbereitung / Chirurgie der Maus
    1. Schnell die Maus in der Nacht vor dem Experiment, um Stuhlgang zu begrenzen.
    2. Geben Sie eine 6-8 Wochen alten Maus (C57BL / 6) präoperative Analgesie durch eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg / kg Körpergewicht (BW)) 20-30 Minuten vor der Operation.
    3. Betäuben die Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (125 mg / kg KG) und Xylazin (12,5 mg / kg KG). Prüfen Sie durch Pedalreflex. Bewerben vet Salbe auf Trockenheit zu verhindern.
    4. Platzieren Sie die Maus auf einer thermo-kontrollierten Heizkissen bei 37 ° C auf einem Mikroskop-Fach. Da es sich um ein Anschlussverfahren, gibt es keine Notwendigkeit einer strikten asceptic Verfahren. Einen Einschnitt in der Nähe der Halsschlagader, entfernen Sie vorsichtig die rechte Seite der Halsmuskel und zu isolieren, die Halsschlagader aus dem umgebenden Gewebe.
    5. Legen Sie eine 2 Französisch intravenösen Katheter in die rechte Halsschlagader für die Infusion von fluoreszenzmarkierten Bakterien oder andere Lösungen. Öffnen Sie die Bauchhöhle über eine Mittellinie Bauchschnitt und verwenden Wattestäbchen, um das Mesenterium verteilt und die mesenterialen Arteriolen und venulären Zirkulation zu visualisieren.
    6. Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite auf eine transparente Platte und befestigen Sie die Kanüle mit Klebeband. Verwenden Sie eine heiße Packung zu Unterkühlung zu verhindern. Zur Dehydratisierung des Gewebes zu verhindern, fallen 500 ul 0,9% NaCl auf die Eingeweide.
  2. Fluoreszenzmikroskopie von bakteriellen Adhäsion an die mesenterischen Zirkulations
    1. Arbeiten Sie in einem dunklen Raum. Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Gefäße zu immobilisieren und visualisieren diese unter einem inversen Mikroskop.
    2. 5 ul einer 10 mM Lösung o topisch anwendenf die Ca 2+ -ionophore A23187 in DMSO gelöst. Nach 10 sec, injizieren 100 ul markierten Bakterien (siehe Schritt 1) ​​durch die Jugularkatheter. Nehmen Sie Zeitraffer-Bilder. Nachdem das Experiment beendet ist, einschläfern die Maus nach institutionellen genehmigten Richtlinien.
  3. Bildanalyse
    1. Erhalten Sie Live-Bilder mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop erfasst mit einem Schwarz-Weiß-Kamera und entwickelt mit jeder Bildbearbeitungssoftware. Bewerben automatische Belichtungszeit und Kontrastoptimierung speziell für die verwendeten Geräte.
    2. Erwerben Sie Zeitraffer-Bilder mit der "Erwerb" in der Werkzeugleiste (Multidimensional Acquisitions - Time) unter Verwendung von 40 Zyklen von 1000 Bildern / s. Speichern Sie die Bilder in einem entsprechenden Bild-Dateiformat.
    3. Prozessbilder mit ImageJ-Analyse-Software, um den Bereich der Fluoreszenzsignal pro Bild zu messen. Definieren Sie die Schwelle zum unteren und oberen Schwellenwerte festgelegt, die Segmentierung von Graustufenbildern in features von Interesse. Identifizieren Sie die Region von Interesse (Blutgefäß) und messen Sie den Bereich, um die Schwelle und der Region von Interesse beschränkt. Vergleichen bakterielle Adhäsion, ausgedrückt als Fluoreszenz-Bereich mit jeder statistische oder grafische Software.

Ergebnisse

S. aureus Haftung an VWF ist subendothelialen Matrix und Endothelzellen eine Scherspannung abhängiges Phänomen

Um die Rolle der Scherbeanspruchung in der Wechselwirkung zwischen S. betonen aureus und VWF, führten wir Perfusionen über VWF beschichtete Deckgläser bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten (eine schematische Übersicht über die in vitro-Perfusions-Modell ist in Abbildung 1 zu 2000 gegeben. Die Adhäsion von S. aureus mit zunehmenden Scherraten von 250 sec -1 erhöhten vWF sec -1 (Figur 2), was anzeigt, daß hohe Scherkräfte nicht hemmen, sondern verstärkt die Adhäsion von Bakterien an VWF.

Um den Beitrag von VWF an die bakterielle Adhäsion an Kollagen zu untersuchen, die Hauptkomponente der subendothelialen Matrix, wir perfundiert fluoreszierend markierten S. aureus als Kollagen in Gegenwart oder Abwesenheit von VWF. In Abwesenheit von VWF, Adhäsion von S. einureus Kollagen nahm mit zunehmenden Scherraten. Wenn jedoch VWF im Medium vorhanden war, die Haftung von S. aureus mit zunehmenden Scherraten (Abbildung 3).

Die in vitro-Flussmodell ermöglicht uns auch, um die Adhäsion von Bakterien untersucht, um Zellen unter Strömungs endotheliale. Wir durchbluteten HUVECs mit fluoreszenzmarkierten S. aureus bei Scherraten von 500 bis 2000 sec -1. Wo angegeben, wurden HUVECs mit einem Ca 2+ -ionophore aktiviert ist, um die Freisetzung von VWF verursachen. Endothelzellaktivierung und die anschließende VWF Release, erhöhte Adhäsion von S. aureus (4A), die typische "strangartige" Muster gebildet von fluoreszenzBakterienHaufen in der Richtung der Scherkraft (4B) ausgerichtet sind, was auf die Bindung von Bakterien entlang einer linearen gestreckte VWF Molekül markiert.

Initial in vivobakteriellen Adhäsion in splanchnischen Venen wird durch VWF vermittelt

Da S. aureus kann in VWF haften verwendeten wir Wildtyp-Mäusen (Vwf + / +) und vWF-defizienten Mäusen (vWF - / -), um die bakterielle Adhäsion an die aktivierte Gefßwand in vivo zu untersuchen. Echtzeit-Videomikroskopie des splanchnic Adern erlaubt die in vivo-Visualisierung zirkulierender fluoreszierend markierten S. aureus (Schematische Übersicht über die in vivo-Perfusions-Modell ist in Abbildung 5 dargestellt).

Nach pharmakologische Aktivierung des Endothels durch die Ca 2+ -ionophore beobachteten wir rasche lokale Ansammlung von einzelnen Bakterien und Aggregate von Bakterien an der Gefäßwand von WT-Mäusen (ergänzende Videos 1 und 2). Fast keine Adhäsion von Bakterien wurde auf der aktivierten Gefäßwand von vWF -deficie beobachtetnt-Mäuse (ergänzende Video 3) im Vergleich zu Haft in WT-Mäusen (Figur 6). Das Fehlen von VWF verringert die Fähigkeit von S. aureus in den aktivierten Gefäßwand haftet.

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Figur 1 Eine schematische Darstellung der in-vitro-Strömungsmodells. Die in vitro-Flussmodell ist ein multifunktionales Modell, das die Untersuchung von verschiedenen Scher abhängige Mechanismen ermöglicht, wie die bakterielle Adhäsion an der subendothelialen Matrix, sondern auch die Thrombusbildung. Der Mikro parallelen Strömungskammer auf einem Deckglas (Kunststoff oder Glas) mit unterschiedlichen Beschichtungen von Proteinen und Endothelzellen gegeben. Die Adhäsion von verschiedenen Bakterien (orange und graue Punkte) können analysiert werden, und die Auswirkungen der Gegenwart von Plasmaproteinen, Blutplättchen und Vollblut bewertet werden. Fluoreszenzmarker für Thrombozyten (blaue Ovale) oder fibrinogen (blau strings) kann in Kombination mit verschiedenen Inhibitoren (black Ovale) zur Behandlung bakterieller und Wirtsfaktoren unterscheiden. Repräsentative Bilder der bakteriellen Adhäsion von S. aureus, Kollagen Beschichtung in Gegenwart (unten) oder Abwesenheit (oben) von VWF gezeigt (Maßstab ist 100 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Die Haftung von S. aureus an VWF steigt mit zunehmenden Scherraten. Micro-parallelen Strömungskammer durch Perfusion über die beschichtete VWF (50 ug / ml) mit fluoreszenzmarkierten S. aureus Newman bei Scherraten von 250 bis 2000 s -1 (sec -1) in Medium (n> 5). Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. * P <0,05, ** p <0,01.

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Abbildung 3. Die Haftung von S. aureus an Subendothel ist Scherung und VWF abhängig. Micro-parallelen Strömungskammer durch Perfusion über die beschichtete Kollagen (160 & mgr; g / ml) mit fluoreszenzmarkierten S. aureus Newman bei Scherraten von 250 bis 2000 sec -1 in Medium (n> 5). VWF (60 ug / ml) wurde in dem Medium vorhanden sind angegeben. Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. ** P <0,01.

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Abbildung 4. Haftung von S. aureus an aktivierte Endothelzellen scherabhängig. Micro-parallelen Strömungskammer durch Perfusion über die Endothelzellen. (A) Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen wurden mit dem Ca 2+ -ionophore A aktiviert23187 (0,1 mM), gefolgt von einer 10-minütigen Perfusion von fluoreszierend markierten S. aureus Newman bei Scherraten von 500 bis 2000 sec -1 in Medium (n> 5). Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. * P <0,05. (B) Bild von Mikro-Durchflusskammer parallel Perfusion über aktivierten HUVECs mit S. aureus bei einer Schergeschwindigkeit von 1000 s -2. S. aureus bildet Saiten von ± 200 Mikrometer Länge, was die Haftung an VWF-Multimere (Maßstab ist 100 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5: Eine schematische Übersicht über die in vivo mesenterica Perfusionsmodell. Eine rechte Halsschlagader-Katheter (gelbe Linie) ist für die Verwaltung der Fluor eingesetztescently markierten Bakterien (orange dots), zusätzliche Anästhetika oder andere Komponenten, wie pharmazeutische Inhibitoren und Antikörper. Die Bauchhöhle wird geöffnet und das Mesenterium verteilt wird, um die Blutgefäße (Venen und Arterien) unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Nach pharmakologische Aktivierung des Endothels durch eine Ca 2+ -ionophore, die die Freisetzung von VWF induziert können Bakterien durch die Jugularvene Katheter injiziert werden. Echtzeit-intravaskulären Video-Mikroskopie ermöglicht es dem in vivo Visualisierung der zirkulierenden fluoreszenzmarkierten Bakterien und die daraus resultierende Bildung von Bakterien-Plättchenthromben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6. Die Anfangshaftung von S. aureus. - / - Mäusen an aktiviertes Endothel in vivo wird durch VWF In vivo venösen mesenterica Perfusionsmodell mit C57BL / 6- Vwf + / + und C57BL / 6- Vwf vermittelt. Adhäsion von fluoreszierend markierten S. aureus an den Ort aktiviert Gefßwand ist deutlich niedriger in Vwf - / - Mäusen. Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. *** P <0,001, n> 7.

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Video 1: Echtzeit-Haftung von S. aureus aktiviert Gefäßwand in Vwf + / + Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.

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Video 2: Echtzeit-Aggregatbildung und Embolisation von S. aureus in Vwf + / + Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.

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Video 3: Echtzeit-Haftung von S. aureus aktiviert Gefäßwand in Vwf - / -. Mäusen in vivo mesenterica Perfusionsmodell mit Vwf + / + und vWF - / - Mäusen. Fünf ul einer Ca 2+ -ionophore (10 mM) war Anwened auf den Bereich des visualisierten Gefßbett. Eine Suspension von Carboxy-Fluorescein-markierten S. aureus wurde durch die Vena Katheter injiziert. Die mesenterialen Zirkulation wurde unter einem inversen Mikroskop sichtbar gemacht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.

Diskussion

Scherbeanspruchung ist ein entscheidender Faktor für die vorzeitige bakterielle Adhäsion an der Behälterwand und zur anschließenden Erzeugung des endovaskulären oder endokardialen Vegetationen und metastatischen Infektionen 4,5. Wir beschrieben in vitro und in vivo Modellen komplementär zu der Pathogenese von endovaskulären Infektionen unter physiologischen Scherspannungs studieren. Diese Modelle haben uns erlaubt, von Willebrand-Faktor-bindendes Protein (vWbp) als Haupt S. identifizieren aureus Protein unter Fluss mit einer verletzten Gefäßwand frei VWF 4 interagieren.

Endovascular Infektionen und infektiöser Endokarditis sind insbesondere von Bedeutung, nicht nur weil der Sepsis-induzierten Organversagen und Tod, sondern auch wegen der lokalen und entfernten ("metastatic ') Komplikationen. Um infektiöse Endokarditis und metastatischen Infektionen verursachen, haben Bakterien an der Gefäßwand anhaften und somit Widerstand gegen die Scherspannung des strömenden Bluts. Am meistenUntersuchungen an Bakterien Virulenzfaktoren in statischen Bedingungen durchgeführt. Allerdings könnte diese etablierten Wechselwirkungen Scherkräfte und Untersuchungen nicht standhalten unter Strömungsbedingungen können neue, bisher nicht berücksichtigten Faktoren in Bakterien-Wirt Wechselspiel offenbaren.

Unter Verwendung der Mikrofließkammer parallel haben wir ua die Bedeutung der VWF für vaskuläre Haftung gezeigt. Unter Scherbeanspruchung, VWF schrittweise entfaltet sich aus seiner Ruhekugelförmiger Struktur und macht die A1-Domäne, die mit Thrombozyten über seine GPIb-Rezeptor 6 zusammenwirkt. Strömungskammern wurden ausgiebig verwendet werden, um die Thrombozytenfunktion 7 studieren.

Bemerkenswert ist, auch S. aureus Haftung unter Fluss erfordert VWF, insbesondere die A1-Domäne, die auf Scherung ausgesetzt ist. Wir identifizierten vWbp zu vermitteln VWF-Bindung. vWbp ist ein Koagulase, die auf S. trägt aureus Pathophysiologie durch Aktivierung des Hosts Prothrombin. Staphylothrombin, die resulting Komplex eines bakteriellen Koagulase und Prothrombin, wandelt Fibrinogen in unlösliches Fibrin 8,9. Unsere Studien haben gezeigt, dass nicht nur vWbp Prothrombin aktiviert, jedoch löst die Bildung von Bakterien-Fibrin-Blutplättchen-Aggregate, die die Haftung, die Blutgefäße unter Strömungs 4,10,11 verbessern.

Die In-vitro-Flusskammer-Modell ermöglicht es, die verschiedenen Akteure in die bakterielle Adhäsion an zellulären oder Matrixkomponenten zu studieren. Bakteriellen Virulenzfaktoren können mit Mutanten oder harmlose Bakterien zur Expression spezifischer Oberflächenproteine ​​untersucht werden. Alternativ können pharmakologische Inhibitoren oder blockierende Antikörper gegen das Medium in der Strömungskammer zugegeben werden. Die Rolle von Wirtsfaktoren, wie beispielsweise unterschiedliche Bestandteile der extrazellulären Matrix können mit Deckgläsern mit verschiedenen Beschichtungen untersucht werden. Die Deckgläser kann auch mit Endothelzellen, deren Aktivierungsstatus kann durch Zugabe von spezifischen Stimulatoren moduliert werden abgedeckt. Apart aus der Gefäßwand, kann der Beitrag von Wirtszellen und Blutplasmaproteine ​​durch Zugabe dieser Faktoren strömenden Mediums untersucht werden. So können verschiedene Bedingungen zunehmender Komplexität unter standardisierten Bedingungen laminarer Strömung untersucht, um die Interaktionen, die Bakterien an der Gefßwand in vivo anhaften lassen entwirren.

Wechselwirkungen in der in-vitro-Modell identifiziert werden anschließend in einem Tiermodell untersucht, um ihre Bedeutung in einem komplexen Organismus zu testen. Andere in vivo Modelle zur dynamischen Wechselwirkungen unter Strömungs studieren beschrieben, wie der Hamster Rückenhautkammer 12 und der Cremaster-Modell 13. Im Vergleich dazu ist das hier beschriebene mesenterica Perfusionsmodell bietet mehrere Vorteile aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit, die Möglichkeit zu variieren Host genetischen Hintergrund der Mäuse und pharmakologische Interventionen zu bewerten.

Im Ergebnis der beschriebenen Modellebieten die Möglichkeit, Oberflächenproteine ​​nicht nur von S. studieren aureus, aber von vielen anderen Mikroorganismen in verschiedenen Host-Hintergründe, zum besseren Verständnis der Pathogenese von Gefäßinfektionen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N unterstützt; "Eddy Merckx Research Grant" und die "Sporta Forschung Grant" für Pädiatrische Kardiologie, UZ Leuven, Belgien (JC); das Zentrum für Molekulare und Vaskuläre Biologie wird durch die Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), die von der "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) von der Universität von Leuven und ein Forschungsstipendium von Boehringer Ingelheim.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gehirn-Herz-Infusion (BHI)BD Plastipak 237500
Tryptische Sojabrühe (TSB)OxoidCM0129
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Invitrogen14190-169D-PBS
5(6)-carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimidylester Sigma-Aldrich21878-25MG-FFluoreszenz-Markierung 
Rinderserumalbuminfraktion V (BSA)Roch10 735 086 001
Haemate-PCSL BehringPL 15036/0010VWF
Horm KollagenTakeda10500Kollagen
1-Well-PCA-ZellkulturkammernSarstedt94.6140.102Kunststoff-Slips
TemgesicReckitt Benckiser283716Bruprenorphin
Anesketin (Ketaminhydrochlorid 115 mg/ml (100 mg/ml Ketamin))EurovetBE-V136516Ketamin
XYL-M 2% (Xylazinhydrochlorid 23,32 mg/ml (20 mg/ml Xylazin))VMDArendonkBE-V170581Xylazin
2 französischer intravenöser Katheter grünPortex200/300/010
0,9% Natriumchlorid (NaCl)Baxter HealthcareW7124
Baumwolle TupferInternational Medical Product300230
Ca2+-Ionophorlösung A23187Sigma-AldrichC7522-10 MG
26 Gauge 1 ml Spritze   BD Plastipak 
26 Gauge 1 ml Spritze  mit NadelBD Plastipak 300015intraperitoneale
Injektion Zentrifuge 5810-REppendorf5811 000.320
Deckgläser aus Glas (24x50)VWRBB02405A11Dicke Nr., 1
PHD 2000 InfusionHarvard Apparatur702100Hochpräzise Harvard-Infusionspumpe
Axio-Observer DICarl-ZeissInverses Fluoreszenzmikroskop
ImageJAnalysesoftwaredes National Institute of Health
Graphpad Prism 5,0Graphpad SoftwareAnalysesoftware
AxioCam MRmCarl-Zeiss Schwarz-Weiß-Kamera
300013

Referenzen

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