Method Article

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

DOI:

10.3791/52867

⸱

July 22nd, 2015

 ,  , 
1Interfaculty Institute for Biochemistry, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems, 3German Cancer Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben ein Protokoll zur Herstellung von gestützten Lipiddoppelschichten und dessen Charakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie und Kraftspektroskopie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine vielseitige, hochauflösende Bildgebungstechnik, die die Visualisierung biologischer Membranen ermöglicht. Es verfügt über eine ausreichende Vergrößerung, um Membransubstrukturen und sogar einzelne Moleküle zu untersuchen. Das AFM kann als Kraftsonde fungieren, um Wechselwirkungen und mechanische Eigenschaften von Membranen zu messen. Gestützte Lipiddoppelschichten werden herkömmlicherweise als Membranmodelle in AFM-Studien verwendet. In diesem Protokoll zeigen wir, wie gestützte Doppelschichten präpariert und ihre Struktur und mechanischen Eigenschaften mit Hilfe von AFM charakterisiert werden. Dazu gehören die Doppelschichtdicke und die Durchbruchskraft.

Die Informationen, die durch die AFM-Bildgebung und die Kraftspektroskopie bereitgestellt werden, helfen dabei, die mechanischen und chemischen Eigenschaften von Membranen zu definieren. Diese Eigenschaften spielen eine wichtige Rolle bei zellulären Prozessen wie der Aufrechterhaltung der Zellblutstillung vor Umweltstress, der Zusammenführung von Membranproteinen und der Stabilisierung von Proteinkomplexen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rasterkraftmikroskopie (AFM) erzeugt ein Bild einer Oberfläche durch Abtasten über einen Bereich der Probe unter Verwendung eines Auslegers mit einer sehr scharfen Spitze 1. Die Bewegung des Auslegers tastet die Oberflächentopologie der Probe. AFM wurde weithin an biologische Moleküle aufgebracht - einschließlich Proteinen, DNA und Membranen, die aufgrund ihrer Flexibilität bei der Analyse von festen Proben in Luft oder nahezu native Zustand in flüssiger 2-5.

Abgesehen von seiner hochauflösenden Imaging-Fähigkeit im Nanometerbereich, wirkt der AFM Cantilever als Feder, um Wechselwirkungskräfte (Adhäsion und Repulsion) und mechanischen Eigenschaften der Probe 5,6 sondieren. Dies wird als Kraftspektroskopie bekannt. In diesem Modus wird zuerst nähert die Sonde die Probe und übt eine Kraft auf, dann zurückgezogen wird, bis er den Kontakt verliert mit der Probe (1A). Die erzeugten Kurven zeigen Kraft als Funktion der Entfernung des Auslegers sowohl für den AppRotauge und Einfahren. Mehrere Objekte einschließlich des Elastizitätsmoduls, die Steifigkeit eines Materials zu messen, und Adhäsionskräfte ableiten.

Unterstützte Lipid-Doppelschichten sind biologische Modellmembranen auf einem festen Träger liegend - in der Regel Glimmer, Borosilikatglas, Quarzglas, oder oxidierten Silizium 7. Sie werden mit verschiedenen Techniken wie Vesikel Abscheidung hergestellt, Langmuir-Blodgett-Verfahren und Spin-Coating 8,9. AFM verwendet wurde, um die Bildung dieser abgestützt Doppelschichten 10 zu folgen, und der Sonde unterschiedliche Strukturen von Membranen unterschiedlicher Zusammensetzungen 11-15 gebildet.

Darstellende Kraftspektroskopie auf unterstützten Doppelschichten führt zu einer Spitze in der Ansatz-Kurve. Dieser Peak zeigt die Kraft, die benötigt, um die Doppelschicht zu durchdringen, und heißt Durchbruch Kraft. Die Doppelschichtdicke kann auch über die Kraftkurve 6 gemessen werden. Die typische Durchbruchkraft von DoppelschichtenBereich zwischen 1-50 nN 6. Diese Eigenschaften hängen von Lipidpackung (flüssig oder Gelphase) und Struktur (Acylkettenlänge und Grad der Ungesättigtheit) von membranaktiven Mittel 16 verändert. Die Theorie hinter dem Bruch wurde erläutert, 17 und andere experimentelle Parameter wie Cantilever Weichheit, Spitzenradius und Annäherungsgeschwindigkeit auch die bahnbrechende Kraft 15,16,18 beeinflussen. Kraftspektroskopie wurde verwendet, um die Eigenschaften der verschiedenen Lipidphasen 11,19, Zusammensetzung abhängigen Änderungen 12,20 sowie Wirkungen anderer Biomoleküle wie Peptide zu analysieren, auf die Stabilität der Membran 21.

Die flache Orientierung unterstützt Doppelschichten ist für die Kombination von AFM mit anderen Verfahren wie Oberflächenplasmonresonanz 22 und der Fluoreszenzmikroskopie 11,19 eine bessere Charakterisierung Struktur und die Eigenschaften von Membranen vorteilhaft.

Diese ausführliche Video protocol soll unterstützten Lipiddoppelschichten bereiten Vesikel mit Abscheidung und mit AFM und Kraftspektroskopie zu analysieren. Während Vesikel in verschiedenen Größen verwendet werden, um Doppelschichten herzustellen, konzentriert sich dieses Protokoll auf kleinen und großen unilamellaren Vesikeln. Unterstützte Doppelschichten, die in flüssige Phase bestellt (L o) und flüssige ungeordneten (L d) Phasentrennung wurden 11,15 aus. 2: 1-Verhältnis die Membran aus Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC), Sphingomyelin (SM) und Cholesterin (Chol) bei 2 besteht. Diese Zusammensetzung Modelle die Lipid Rafts, die vorgeschlagen werden, um als Plattform für wichtige Proteintransport und Sortierung, Zellsignalisierung und andere zelluläre Prozesse 23,24 verhalten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung der unterstützten Lipiddoppelschichten (SLB) 11,12,21

  1. Herstellung von Lipid-Mischung und Multilamellare Vesikelsuspensionen
    1. Bereiten Sie die folgenden Puffer vorher.
      1. Vorbereitung PBS-Puffer bei Konzentrationen von 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 und 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Vorbereitung SLB (unterstützte Lipiddoppelschicht) Puffer bei Konzentrationen von 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
      3. Es wird eine Lösung von 1 M CaCl 2.
    2. Man löst die folgenden Lipide in Chloroform in einer gewünschten Konzentration: beispielsweise Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC) bei 25 mg / ml, Sphingomyelin (SM) bei 25 mg / ml und Cholesterin (Chol) bei 10 mg / ml.
    3. Nehmen 18,38 ul DOPC 17,10 ul SM und 11,30 ul Chol, um eine Lösung mit 1 mg Gesamtlipiden in einem 2 zu machen: 2: 1 DOPC: Molverhältnis Chol: SM. Variieren die Volumina entsprechend auf der Grundlage der concentrations der in 1.1.2 hergestellten Lipide. Behält jedoch das Molverhältnis von 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol als Änderung des Molverhältnisses wird die Phaseneigenschaften der Membran 25 zu ändern.
    4. Mischen Sie die Lösung vollständig durch Vortexen. Hinzufügen eines fluoreszierenden lipidischen Farbstoff bei 0,05 Mol-%, wenn man die Doppelschicht mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen wünscht.
      Hinweis: Die Familie von langkettigen dialkylcarbocyanines, mochte, DiI und DiO umfassen einen weiten Bereich von Wellenlängen und können idealerweise verwendet werden, um Lipidmembranen zu markieren. Alternativ können fluoreszenzmarkierten Lipiden, wie Rhodamin- Phosphatidylethanolamin oder BODIPY-Cholesterin verwendet werden. In jedem Fall sollte die Konzentration des Farbstoffs gemäß der Mikroskopie Einstellung optimiert werden, wenn man bedenkt, dass hohe Konzentrationen des Fluorophors an das Lipid gebunden ist, kann die Lipid Verhalten 19 zu ändern.
    5. Trocknen Sie das Chloroform unter Verwendung von N2-Gas (oder einen beliebigen verfügbaren Inertgas wie Ar und He).
    6. Weitere dry-Ter Lipidgemisch unter Vakuum für mindestens 1 Std.
      Hinweis: Wenn das Speichern dieser Lipidmischung, Spülluft mit Inertgas (N 2, Ar oder He) und bei -20 ° C. Aliquot überschüssige Lipide-in-Chloroform in kleine braune Fläschchen. Trocknen Sie sie in einer ähnlichen Weise wie die Lipid-Mischung, verdrängen Luft mit Inertgas (N 2, Ar oder He) und bei -20 ° C.
    7. Auflösung der getrockneten Lipide in einem PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10 mg / ml.
    8. Wirbel die Mischung kräftig für etwa 20 sec bis 1 min, um eine trübe Suspension zu erhalten, mit einem multilamellaren Vesikeln. Stellen Sie sicher, dass die keine Lipidfilmen Festhalten an den Seiten des Fläschchens.
    9. Verteilen Sie diese Suspension in 10 ul Aliquots (1 mg Lipid macht 10 Teilmengen).
    10. Lagerung bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
  2. Herstellung unilamellare Vesikel
    Anmerkung: Verschiedene Größen von unilamellare Vesikel können mit dem Beschallungsverfahren oder dem Extrusionsverfahren hergestellt werden. Beschallung verwendet sound Energie, um das Gemisch zu rühren und trenne die Schichten des multilamellaren Suspension. Dies wird durch Bereinigung der trübe Suspension angezeigt. Extrusion zwingt die multilamellaren Vesikeln, um durch einen Membranfilter mit einer bestimmten Porengröße bestehen.
    1. Beschallungsverfahren
      1. Nehmen Sie die 10 ul multilamellaren Lipidsuspensionen und fügen Sie 150 ul SLB-Puffer.
      2. Übertragen Sie die Mischung in kleine (2 ml) bedeckten Glasfläschchen und Dichtung mit Parafilm.
      3. Beschallen des Gemisches bei Raumtemperatur in einem Ultraschallbad für 10 min oder bis sie klar wird, kleine unilamellare Vesikel (SUVs mit einem Durchmesser unter 50 nm) zu erhalten.
    2. Extrusionsverfahren
      1. Nehmen Sie die 10 ul multilamellaren Lipidsuspensionen und fügen Sie 150 ul SLB-Puffer.
      2. Übertragung der Suspension in einen kryogenen Röhre.
      3. Einfrieren der Lipidsuspension durch Eintauchen des kryogenen Schlauch für ein paar Sekunden in flüssigen Stickstoff.
      4. AuftauenLipidsuspension durch Eintauchen des kryogenen Rohr in einem Wasserbad bei Raumtemperatur oder 37 ° C für ein paar Minuten. Wiederholen Sie die Frost-Tau-Stufen mindestens 10-mal.
      5. Um die Lipidsuspension zu extrudieren, mit einem Polycarbonatmembran mit 200 nm Porengrße (andere Porengrößen sind verfügbar, wie 100 nm oder 400 nm) und einem kommerziellen Extrusionsvorrichtung 26.
        Hinweis: Zur Zeit gibt es zwei Extruder Geräte im Handel erhältlich: ein Handbuch Extruder ist für kleine Volumen (200 ul auf wenige ml) erhältlich. In diesem Fall wird die Probe durch die Membran durch manuelles Schieben der Suspension hin und her zwischen zwei Spritzen extrudiert. Je nach Hersteller, würde Lipid Aliquots müssen kombiniert werden, um Mindestvolumen von der Einrichtung zu erreichen. Für größere Mengen (bis zu 50 ml) ausgefeiltere Vorrichtungen verwendet werden, in dem die Suspension durch die Polycarbonat-Membran mit Hilfe von Druckgas gepresst. Aufbau und Extrusionsbedingungen können entsprechend der mod ändernel. Beachten Sie die Hinweise des Herstellers beachten. Dieses Protokoll bezieht sich auf die manuell bedienbarer Extruder für kleine Volumina.
      6. Ins Gleichgewicht des Extruders in Wasser, indem Wasser durch den Extruder. Tauchen Sie die Membran in Wasser.
      7. Platzieren der Membran zwischen den beiden Kolben, montieren die Vorrichtung und im Gleichgewicht belassen, Puffer, indem man den Puffer durch den Extruder von einer Spritze zur anderen. Zusätzlich ermöglicht dieser Schritt die Prüfung der Undichtheit des Systems. Wenn sie undicht ist, zerlegen und wieder zusammenbauen es wieder Veränderung der Membran.
      8. Nehmen Sie die Lipidsuspension mit Hilfe einer Spritze des Extruders ("Schmutzseite").
      9. Befestigen Sie die Spritze mit der Lipidsuspension auf einen Kammer und die leere Spritze auf der gegenüberliegenden Kammer.
      10. Schieben Sie die Spritze an einem Ende. Übergeben Sie die Lösung durch die Membran und in das gegenüberliegende Spritze. Dies ist der 1. Pass ab.
      11. Führt es durch die Membran für eine Gesamtzahl von 31 mal solchendaß die Lösung endet an der gegenüberliegenden Spritze ("saubere Seite").
        Hinweis: Prüfen Sie die Membran nach dem Extrudieren. Wenn es war gebrochen, dann Extrusionsverfahren war nicht erfolgreich und muss wiederholt werden.
      12. Leeren Sie die Spritze in einem Röhrchen. Große unilamellare Vesikel (LUVs) sind für 1-2 Tage stabil, wenn sie bei 4 ° C gehalten.
  3. Herstellung von Mica und Deckgläser
    1. Waschdeckgläschen erst in Wasser und dann in Ethanol. Luftgetrocknet.
    2. Nehmen Glimmerscheiben und ziehen Sie die äußere Schicht mit Klebeband.
    3. Befestigen Sie die Glimmerscheibe auf dem Deckglas. Transparente optische Klebstoffe sind optimal, so dass man die Doppelschichten mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüfen.
    4. Bringen Kunststoffzylinder (2,5 cm Außendurchmesser, 2 cm Innendurchmesser und 0,5 cm Höhe) mit optischen Kleber / Fett. Stellen Sie sicher, dass alles dicht ist und keine Lecks vorhanden sind. Verwenden Sie Fett zu wollen, wenn Wiederverwendung der Zylinder, da sie leicht von th abgelöst werdene Deck und gewaschen. Wobei die Abmessungen der Kunststoffzylinder, abhängig von der Größe des AFM Cantileverhalter und sollte entsprechend eingestellt werden.
  4. Ablagerung von unilamellare Vesikel auf einem festen Träger
    1. Pipette das gesamte Liposomenlösung direkt auf den Glimmer. Noch ein SLB Puffer auf ein Volumen von 300 & mgr; l zu erreichen.
    2. Add 0,9 ul 1 M Calciumchlorid-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 3 mM Ca 2+ erreichen.
    3. Inkubieren bei 37 ° C für 2 min und dann bei 65 ° C für mindestens 10 min. Immer decken die Doppelschichten mit Puffer. Kontakt mit Luft und Luftblasen zu zerstören. Während der Inkubation fügen weitere Puffer, wenn notwendig, insbesondere, wenn die Inkubation bei höheren Temperaturen.
      Anmerkung: Die Inkubationstemperaturen je nach den Lipidmischungen und Phasen erforderlich. Inkubationszeit von mindestens 10 min erforderlich ist, um getragen Doppelschichten zu bilden, aber es länger sein könnte, abhängig von der Temperatur und Zusammensetzung.
    4. Wäschedie Doppelschicht mit heißem (65 ° C) SLB Puffer 15-20 mal Calcium und nichtkondensierten Vesikeln zu entfernen. Seien Sie besonders vorsichtig während der Waschschritte, um die Doppelschicht unter Puffer zu halten und vorsichtig pipettieren der Waschlösung zu verhindern die Zerstörung der Doppelschicht.
    5. Coole unterstützt Doppelschichten auf Raumtemperatur vor AFM-Messungen. Dies ist erforderlich, um die unterschiedlichen Phasen der Membran sowie bilden Minimierung thermischer Drift im Gerät.

2. Rasterkraftmikroskopie-Messungen 11,12

  1. Imaging
    Hinweis: Führen Sie die Rasterkraftmikroskopie-Bildgebung im Kontaktmodus oder Tapping-Modus. Bild unterstützt Doppelschichten in Lösung; erlauben keine Lösung vollständig verdampfen, da dies die Doppelschichten zu zerstören. Wie man es mit einem Puffer zu arbeiten, beachten Sie bitte Vorsichtsmaßnahmen, dafür zu sorgen, dass jeder AFM Teil von Flüssigkeiten geschützt.
    1. Wählen Sie ein weiches Ausleger (unter 0,2 N / m Federkonstante wird empfohlen) und montieren Sie ihn auf ter AFM. Die Wahl des Auslegersteifigkeit für die Kraftspektroskopie kritischer (und dies wird später diskutiert werden).
    2. Montieren Sie die Probe auf der Bühne AFM und stellen Sie sicher, dass alle Schwingungsisolationsmodule eingeschaltet sind. Wartezeit von mindestens 15 min äquilibrieren und verringern die thermische Drift des Systems. In Abhängigkeit von der AFM-Set-up kann Tuning und Imaging-Spezifikationen variieren. Wenden Handbuch des Herstellers.
    3. Nähern Sie sich der Probe mit der AFM-Spitze bis zum Kontakt.
    4. Da Lipiddoppelschichten sind in der Regel 4 nm in der Höhe, verwenden die Z-Bereich des Instruments, die den höchsten z-Auflösung (beispielsweise 1,5 um) erhalten wird.
    5. Wählen Sie eine Region, die dem Bild. Um einen Überblick über die Lipiddoppelschicht, eine 50 & mgr; m × 50 & mgr; m oder 25 & mgr; m × 25 & mgr; m-Region wird ein guter Ausgangspunkt, um sein Bild zu bekommen. Wenn kleinere Features erscheinen, kann man Bild in kleinere Bereiche (10 & mgr; m × 10 & mgr; m oder 2 um x 2 um). Die Wahl der Abbildungsbereich hängt auch von der Arbeits range des piezoelektrischen Scanner. Bitte konsultieren Sie die Instrumentenhand dafür.
    6. Als Doppelschichten sind sehr zerbrechlich, den Sollwert der AFM-Spitze einstellen während der Bilderzeugung, die Kraft bei minimalem und richtig für thermische Drift zu halten, dabei ständig in Kontakt mit der Probe. Im Kontaktmodus, den Sollwert zu minimieren. Im Tipp-Betrieb, den Sollwert zu maximieren.
    7. Prozessbilder durch Anbringen jeder Scanlinie zu Polynom Ausgleichsfunktionen. Führen Linienentfernung für Scans, die Kontakt mit der Membran unter Verwendung der proprietären Software der AFM-Produktionsunternehmen zu verlieren.
  2. Kraftspektroskopie
    1. Kalibrieren des Auslegers entsprechend den Anweisungen nach dem Protokoll des Herstellers. Kalibrierung ermöglicht die Umwandlung des elektrischen Signals der Photodioden, um eine Kraft (1B).
      1. Kalibrieren Sie die Empfindlichkeit der Spitze zur Ablenkung als z-Piezo-Bewegung (in Längeneinheiten) zu messen, anstatt elektrische Signal in Volt.
        Anmerkung: AFM detektiert Änderungen in der Auslenkung des Auslegers mit Hilfe eines Lasers auf der Rückseite des Auslegers reflektierten. Der Laser erreicht eine Photodiode, die die Position des Laserspots räumlich erfassen kann. Eine Änderung in der Durchbiegung des Auslegers, da es bei Kontakt mit der Probe biegt durch diese Fotodiode als "vertikale Ablenkung" erkannt, und dies ist in den Einheiten der Spannung. Da der Ausleger durch den z-Piezo bewegt wird, wird die vertikale Ablenkung auf die Bewegung in der z-Piezo verwandt. Das Verhältnis von vertikalen Ablenkung und z-Bewegung Empfindlichkeit genannt und wandelt Spannung an Distanz.
      2. Berechnung des Auslegerfederkonstante mit dem thermischen Rauschfrequenzverfahren, in der Regel in der AFM-Software integriert. Bei diesem Verfahren zeigen die Amplitude der Schwingung von Rauschen mit Bezug auf die Frequenz der Schwingung, wodurch eine spektrale Leistungsdichteverteilung. Dieses Grundstück wird eine Spitze um die Resonanzfrequenz zu zeigen. Die Frequenz, bei der die Amplitude idas Größte ist die Resonanzfrequenz. Setzen Sie eine Lorentz-Funktion rund um den Gipfel zu berechnen automatisch die Federkonstante durch die Software. Hier werden einige nützliche Ressourcen für die Theorie des thermischen Rauschens Verfahrens sind in den Artikeln 27 bis 30 angegeben.
    2. Nach der Bebilderung eine Fläche von der Doppelschicht, wählen Sie eine 5 um x 5 um-Bereich in der Doppelschicht auf Kraftspektroskopie durchzuführen.
    3. Einrichten des AFM so, dass es Kraftkurven in einem 16 x 16 Raster von der Region. Dies führt zu 256 Kraftkurven pro Region. Der Raum zwischen zwei benachbarten Punkten sollte ausreichen, um zu vermeiden, dass die Membranfläche von einem Punkt untersucht würde mit dem nächsten Punkt übereinstimmt. Dies ist abhängig von der Spitzenradius. A 100 nm Abstand zwischen zwei Punkten wäre ideal. Teilen Sie die 5 & mgr; m × 5 & mgr; m Bereich in 16 x 16 Gitter. Abhängig von der Größe der Phasen kann man einen kleineren oder größeren Bereich auszuwählen, und dann entsprechend an die Rastergröße.
    4. Stellen Sie z-Piezoverschiebung zu400 nm. Dies bestimmt die maximale Reichweite der Bewegung des z-piezo. Sie sollte groß genug sein, um sicherzustellen, dass der Ausleger vollständig weg von der Probe in zwischen den Messungen eingefahren werden.
    5. Stellen Annäherungsgeschwindigkeit bis 800 nm / sec und zurückzuziehen Geschwindigkeit bis 200 nm / sec. Verwenden Sie eine Annäherungsgeschwindigkeit von 400 bis 6000 nm / s in Abhängigkeit von der Doppelschichtzusammensetzung und Lipidphase zu unter 6,16 werden.
    6. Nach dem Einstellen aller Parameter, erwerben Kraftkurven, durch Drücken der Taste "RUN" der AFM-Software.
    7. Sparen Kraftkurven als Kraft-Höhenkurven (ein Maß der z-Piezo-Bewegung). Dies berücksichtigt nicht die Biegung des Auslegers in Kontakt mit der Probe zu nehmen. Während der Datenverarbeitungsschritt, kann der AFM-Software-Korrektur für Auslegerbiege zu Kraft-Spitze und Probe-Kurven (Abbildung 1c), die richtigen Werte für die Doppelschichtdicke zu geben erhalten. Die Korrekturwerte werden in der Regel im calibr eingeation, die mit jedem Kraftkurve gespeichert wird. Berechnen Spitze und Probe durch Subtrahieren der vertikalen Ablenkung vom piezoBewegung an einem gegebenen Punkt.
      Anmerkung: Der Peak in der Annäherungskraft-Kurve (der Kraftwert sinkt, auch wenn die Auslegerbewegung noch auf dem Ansatz-Zyklus) ist die Bruchkraft der Membran, während die Differenz zwischen der Position der Spitze und der Position des Punktes wo die Kraft zu steigen beginnt wieder stellt die Dicke der Membran.
    8. Erwerben Sie mindestens 500 Kraftkurven für jede Bedingung, um gute Statistiken zu erhalten. Zeichnen Sie ein Histogramm der Werte mit Programmen wie Origin oder MatLab, und passen Sie die Histogramme zu einer Gauß-Verteilung, um die Spitze und Breite der Verteilung zu erhalten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unterstützte Lipid-Doppelschichten von DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) wurden in AFM abgebildet (Abbildung 2 AC). Aufgrund der Lipidzusammensetzung wurden SM / Chol reiche L o und DOPC reiche L d Phasen beobachtet. Das Höhenprofil der AFM-Bildgebung kann wichtige Informationen über die Membranstruktur zu schaffen. Indem man die Höhenprofils kann die Dicke der Doppelschicht in Anwesenheit von Defekten in der Membran (2B), oder die Differenz in der Höhe zwis...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SLBs, die aus DOPC:SM:Chol (2:2:1) bestehen, wurden auf Glimmer nach Vesikeladsorption und -ruptur gebildet, die durch Calciumchlorid induziert wurde. Diese Lipidzusammensetzung trennte sich in L, d und Lo Phase. DieL-o-Phase ist mit Sphingomyelin und Cholesterin angereichert und weniger flüssig/viskoser (Abbildung 1A) als dieL-d-Phase 11. Die Trennung von Lo und Ld Phase manifestiert sich in kreisförmigen Strukturen, die sich ü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Max-Planck-Gesellschaft, dem Deutschen Krebsforschungszentrum, der Universität Tübingen und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (Fördernummer 0312040).

Wir danken Eduard Hermann für die Hilfe bei der Automatisierung der Analyse der Kraftverlaufsdaten und Dr. Jakob Suckale für die sorgfältige Lektüre dieses Manuskripts.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholinAvanti Polar Lipids, Inc.850375PKommt als lyophilisiertes Pulver in versiegelten Fläschchen. Lösen Sie das gesamte Pulver nach dem Öffnen in Chloroform auf. Übereinander als getrocknete Lipidfilme unter inerter Atmosphäre bei -20  lagern. °C. Besuchen Sie hier für weitere Informationen zur Lagerung und Handhabung.
Sphingomyelin (Gehirn, Schwein)Avanti Polar Lipids, Inc.860062PKommt als lyophilisiertes Pulver in großen, versiegelten Kunststoffbehältern. Lösen Sie nach dem Öffnen einen Spatel aus Pulverpulver in Chloroform auf. Übereinander als getrocknete Lipidfilme unter inerter Atmosphäre bei -20  lagern. °C. Besuchen Sie hier für weitere Informationen zur Lagerung und Handhabung.
CholesterinAvanti Polar Lipids, Inc.700000PKommt als lyophilisiertes Pulver in großen versiegelten Kunststoffbehältern. Lösen Sie nach dem Öffnen einen Spatel aus Pulverpulver in Chloroform auf. Übereinander als getrocknete Lipidfilme unter inerter Atmosphäre bei -20  lagern. °C. Besuchen Sie hier für weitere Informationen zur Lagerung und Handhabung.
Natriumchlorid (NaCl), 99,8%Carl Roth GmbH + Co. KG9265,1
Kaliumchlorid (KCl), 88%SigmaP9541
Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), >99%AppliChem GmbHA1046
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 99%Carl Roth GmbH + Co. KG3904.1
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2), molekularbiologische QualitätAppliChem GmbHA4689
HEPES, molekularbiologische QualitätAppliChem GmbHA3724
Deckglas 24  x  60  mm, 1  mm DickeDuran Group2355036
Stanz- und MatrizensatzPrecision Brand Products, Inc40105
Optischer KlebstoffNorland Products, Inc.NOA 88Flüssiger Klebstoff, der beim Aushärten unter langwelligem UV-Licht aushärtet.
[header]
Glimmer blockiertNSC Mica Exports Ltd.Dabei handelt es sich um Glimmerstücke mit einer Fläche und Dicke von mindestens 1 Quadratzoll und einer Dicke von 0,006 Zoll bis 0,016 Zoll. Sie werden von der Firma für den Versand auf eine bestimmte Größe zugeschnitten. Kleine Glimmerscheiben können mit dem Stanz- und Matrizensatz aus den Glimmerblöcken gestanzt werden. Fassen Sie Glimmer mit Handschuhen oder Pinzette an.
Laborgeräte FettBorer Chemie AGGlisseal N
LiposomenextruderAvestinLiposoFast-BasicAlternativ kann man sich auch Angebote von Northern Lipids, Inc. anschauen.
Klebeband3MScotch(R) Magic (TM) Klebeband 810 (1 Zoll)
Bath SonicatorBandelin Sonorex DigitecDT-31Keine Erwärmung, Frequenz: 35 kHz, Ultraschall Spitzenleistung: 160 W, HF-Leistung: 40 W. (Datenblatt)
Siliziumnitrid AFM Ausleger Bruker AFM-SondenDNP-10Jeder Ausleger hat vier Spitzen und ihr nominaler Spitzenradius beträgt 20 nm (mit möglichem Maximum bei 60  nm). Basierend auf den Spezifikationen verwenden wir die Spitze D mit einer Resonanzfrequenz von 18 kHz und einer nominalen Federkonstante von 0,06 N/m.
AFMJPKJPK Nanowizard II montiert auf Zeiss Axiovert 200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
  2. Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
  3. Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
  4. Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
  5. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
  6. Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  7. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
  8. Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
  11. Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
  12. Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
  13. Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
  14. Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
  15. Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
  16. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
  17. Butt, H. -J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601(2002).
  18. Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
  19. Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
  20. Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
  21. García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
  22. Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
  23. Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
  24. Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
  25. Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  26. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102(2013).
  27. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
  28. Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973(2000).
  29. Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64(1998).
  30. Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310(2005).
  31. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
  32. Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
  33. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
  34. Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
  35. Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
  36. Rigaud, J. -L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopySupported Lipid BilayersForce SpectroscopyMembrane StructureBilayer ThicknessBreakthrough ForceMembrane Mechanical PropertiesLipid Phase SeparationContact Mode ImagingMembrane Protein Interaction

Related Articles