Methodenartikel

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

DOI:

10.3791/52867

⸱

22. Juli 2015

 ,  , 
1Interfaculty Institute for Biochemistry, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems, 3German Cancer Research Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben ein Protokoll zur Herstellung von gestützten Lipiddoppelschichten und dessen Charakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie und Kraftspektroskopie.

Zusammenfassung

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Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine vielseitige, hochauflösende Bildgebungstechnik, die die Visualisierung biologischer Membranen ermöglicht. Es verfügt über eine ausreichende Vergrößerung, um Membransubstrukturen und sogar einzelne Moleküle zu untersuchen. Das AFM kann als Kraftsonde fungieren, um Wechselwirkungen und mechanische Eigenschaften von Membranen zu messen. Gestützte Lipiddoppelschichten werden herkömmlicherweise als Membranmodelle in AFM-Studien verwendet. In diesem Protokoll zeigen wir, wie gestützte Doppelschichten präpariert und ihre Struktur und mechanischen Eigenschaften mit Hilfe von AFM charakterisiert werden. Dazu gehören die Doppelschichtdicke und die Durchbruchskraft.

Die Informationen, die durch die AFM-Bildgebung und die Kraftspektroskopie bereitgestellt werden, helfen dabei, die mechanischen und chemischen Eigenschaften von Membranen zu definieren. Diese Eigenschaften spielen eine wichtige Rolle bei zellulären Prozessen wie der Aufrechterhaltung der Zellblutstillung vor Umweltstress, der Zusammenführung von Membranproteinen und der Stabilisierung von Proteinkomplexen.

Einleitung

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Rasterkraftmikroskopie (AFM) erzeugt ein Bild einer Oberfläche durch Abtasten über einen Bereich der Probe unter Verwendung eines Auslegers mit einer sehr scharfen Spitze 1. Die Bewegung des Auslegers tastet die Oberflächentopologie der Probe. AFM wurde weithin an biologische Moleküle aufgebracht - einschließlich Proteinen, DNA und Membranen, die aufgrund ihrer Flexibilität bei der Analyse von festen Proben in Luft oder nahezu native Zustand in flüssiger 2-5.

Abgesehen von seiner hochauflösenden Imaging-Fähigkeit im Nanometerbereich, wirkt der AFM Cantilever als Feder, um Wechselwirkungskräfte (Adhäsion und Repulsion....

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Protokoll

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1. Vorbereitung der unterstützten Lipiddoppelschichten (SLB) 11,12,21

  1. Herstellung von Lipid-Mischung und Multilamellare Vesikelsuspensionen
    1. Bereiten Sie die folgenden Puffer vorher.
      1. Vorbereitung PBS-Puffer bei Konzentrationen von 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 und 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Vorbereitung SLB (unterstützte Lipiddoppelschicht) Puffer bei Konzentrationen von 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
      3. Es wird eine Lösung von 1 M CaCl 2.
    2. Man löst die folgenden Lipide in Chloroform in einer gewünschten Konzentration: beispie....

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Ergebnisse

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Unterstützte Lipid-Doppelschichten von DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) wurden in AFM abgebildet (Abbildung 2 AC). Aufgrund der Lipidzusammensetzung wurden SM / Chol reiche L o und DOPC reiche L d Phasen beobachtet. Das Höhenprofil der AFM-Bildgebung kann wichtige Informationen über die Membranstruktur zu schaffen. Indem man die Höhenprofils kann die Dicke der Doppelschicht in Anwesenheit von Defekten in der Membran (2B), oder die Differenz in der Höhe zwis.......

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Diskussion

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SLBs, die aus DOPC:SM:Chol (2:2:1) bestehen, wurden auf Glimmer nach Adsorption und Bruch der Vesikel durch Calciumchlorid gebildet. Diese Lipidzusammensetzung trennte sich in Ld- und Lo-Phasen. Die Lo-Phase ist angereichert an Sphingomyelin und Cholesterin und weniger fließfähig/höher viskos (Abbildung 1A) als die Ld-Phase11. Die Trennung der Lo- von der Ld-Phase zeigt sich als kreisförmige Strukturen, die über der Umgebung erh.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Max-Planck-Gesellschaft, dem Deutschen Krebsforschungszentrum, der Universität Tübingen und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (Fördernummer 0312040).

Wir danken Eduard Hermann für die Hilfe bei der Automatisierung der Analyse der Kraftverlaufsdaten und Dr. Jakob Suckale für die sorgfältige Lektüre dieses Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholinAvanti Polar Lipids, Inc.850375PKommt als lyophilisiertes Pulver in versiegelten Fläschchen. Lösen Sie das gesamte Pulver nach dem Öffnen in Chloroform auf. Übereinander als getrocknete Lipidfilme unter inerter Atmosphäre bei -20  lagern. °C. Besuchen Sie hier für weitere Informationen zur Lagerung und Handhabung.
Sphingomyelin (Gehirn, Schwein)Avanti Polar Lipids, Inc.860062PKommt als lyophilisiertes Pulver in großen, versiegelten Kunststoffbehältern. Lösen Sie nach dem Öffnen einen Spatel aus Pulverpulver in Chloroform auf. Übereinander als getrocknete Lipidfilme unter inerter Atmosphäre bei -20  lagern. °C. Besuchen Sie hier für weitere Informationen zur Lagerung und Handhabung.
CholesterinAvanti Polar Lipids, Inc.700000PKommt als lyophilisiertes Pulver in großen versiegelten Kunststoffbehältern. Lösen Sie nach dem Öffnen einen Spatel aus Pulverpulver in Chloroform auf. Übereinander als getrocknete Lipidfilme unter inerter Atmosphäre bei -20  lagern. °C. Besuchen Sie hier für weitere Informationen zur Lagerung und Handhabung.
Natriumchlorid (NaCl), 99,8%Carl Roth GmbH + Co. KG9265,1
Kaliumchlorid (KCl), 88%SigmaP9541
Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), >99%AppliChem GmbHA1046
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 99%Carl Roth GmbH + Co. KG3904.1
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2), molekularbiologische QualitätAppliChem GmbHA4689
HEPES, molekularbiologische QualitätAppliChem GmbHA3724
Deckglas 24  x  60  mm, 1  mm DickeDuran Group2355036
Stanz- und MatrizensatzPrecision Brand Products, Inc40105
Optischer KlebstoffNorland Products, Inc.NOA 88Flüssiger Klebstoff, der beim Aushärten unter langwelligem UV-Licht aushärtet.
[header]
Glimmer blockiertNSC Mica Exports Ltd.Dabei handelt es sich um Glimmerstücke mit einer Fläche und Dicke von mindestens 1 Quadratzoll und einer Dicke von 0,006 Zoll bis 0,016 Zoll. Sie werden von der Firma für den Versand auf eine bestimmte Größe zugeschnitten. Kleine Glimmerscheiben können mit dem Stanz- und Matrizensatz aus den Glimmerblöcken gestanzt werden. Fassen Sie Glimmer mit Handschuhen oder Pinzette an.
Laborgeräte FettBorer Chemie AGGlisseal N
LiposomenextruderAvestinLiposoFast-BasicAlternativ kann man sich auch Angebote von Northern Lipids, Inc. anschauen.
Klebeband3MScotch(R) Magic (TM) Klebeband 810 (1 Zoll)
Bath SonicatorBandelin Sonorex DigitecDT-31Keine Erwärmung, Frequenz: 35 kHz, Ultraschall Spitzenleistung: 160 W, HF-Leistung: 40 W. (Datenblatt)
Siliziumnitrid AFM Ausleger Bruker AFM-SondenDNP-10Jeder Ausleger hat vier Spitzen und ihr nominaler Spitzenradius beträgt 20 nm (mit möglichem Maximum bei 60  nm). Basierend auf den Spezifikationen verwenden wir die Spitze D mit einer Resonanzfrequenz von 18 kHz und einer nominalen Federkonstante von 0,06 N/m.
AFMJPKJPK Nanowizard II montiert auf Zeiss Axiovert 200

Referenzen

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  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
  2. Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 2....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

MembranstrukturBilayerschichtdickeDurchbruchskraftmechanische MembraneigenschaftenLipid PhasentrennungImaging im KontaktmodusMembranprotein Interaktion

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