Methodenartikel

Generation skalierbar, Metallic Hochseitenverhältnis Nanokomposite in einer biologischen Flüssigmedium

DOI:

10.3791/52901

⸱

8. Juli 2015

 ,  ,  ,  , 
1Biophysics Department, Centenary College of Louisiana, 2Department of Chemistry, Louisiana Tech University, 3Department of Integrative Physiology, University of North Texas Health Sciences Center, 4Biomedical Engineering, Louisiana Tech University, 5Institute for Micromanufacturing, Louisiana Tech University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um neue, hochSeitenVerhältnis Biokomposite unter biologischen Bedingungen und in flüssigen Medien zu synthetisieren. Die Biokomposite skalieren von Nanometern bis Mikrometern im Durchmesser und Länge auf. Kupfer-Nanopartikel (CNP) und Kupfersulfat in Kombination mit Cystin sind die Schlüsselkomponenten für die Synthese.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ziel des Protokolls ist es, die Synthese von zwei neuartigen Biokomposite mit hohem Aspektverhältnis Strukturen zu beschreiben. Die Biokomposite bestehen aus Kupfer und Cystin, entweder mit Kupfer-Nanopartikel (CNP) oder Kupfersulfat trägt die metallische Komponente. Synthese in flüssiger unter biologischen Bedingungen (37 ° C) und der selbstorganisierten Verbundstoffen nach 24 h durchgeführt. Einmal gebildet, sind diese Verbundwerkstoffe in beiden flüssigen Medien in einer getrockneten Form sehr stabil. Die Verbundwerkstoffe skalieren von der Nano- bis Bereich in der Länge Mikro- und von einigen Mikrometern bis 25 nm im Durchmesser. Feldemissionsrasterelektronenmikroskopie mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX) gezeigt, daß Schwefel in der NP-abgeleitete lineare Strukturen vorhanden, während sie nicht an dem Ausgangsmaterial CNP, wodurch bestätigt Cystin als Quelle für Schwefel in den endgültigen Nanokomposite . Während der Synthese dieser linearen Nano- und Mikroverbundwerkstoffe, ein breites Spektrum von Längen von structures in dem Synthesebehälter ausgebildet ist. Ultraschallbehandlung der flüssigen Mischung nach der Synthese wurde gezeigt, dass bei der Kontrolle der durchschnittlichen Größe der Strukturen durch Verminderung der Durchschnittslänge mit der erhöhten Zeit der Ultraschallbehandlung zu helfen. Da die gebildeten Strukturen sind sehr stabil, nicht agglomerieren und sich in der flüssigen Phase gebildet wird, kann auch zur Zentrifugation in Konzentrierung und Trennung gebildeten Verbundstoffe zu unterstützen.

Einleitung

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Kupfer ist ein hochreaktives Metall, das in der biologischen Welt für einige Enzymfunktionen essentiell ist 1,2, aber in höheren Konzentrationen stark toxisch ist, einschließlich in der nanopartikulären Form 3,4. Die Besorgnis über die Toxizität von Kupfer hat mit der Verwendung von CNPs und anderen kupferbasierten Nanomaterialien aufgrund der vergrößerten Oberfläche/Masse für Nanostrukturen an Bedeutung gewonnen. So kann selbst eine kleine Masse Kupfer in Form von Nanopartikeln aufgrund ihrer Fähigkeit, in die Zelle einzudringen und in reaktive Formen abgebaut zu werden, lokale Toxizität verursachen. Einige biologische Spezies können sich mit Metallionen komplexieren und sie chelatisieren und sie sogar in biologische Strukturen einbauen, wie bei Meeresmuscheln beschrieben wurde 5. Bei der Untersuchung der potenziellen toxischen Wirkungen von Nanomaterialien 4 wurde entdeckt, dass im Laufe der Zeit und unter biologischen Bedingungen, die für die typische Zellkultivierung (37 °C und 5 % CO2) verwendet werden, stabile Kupfer-Biokomposite mit einer (linearen) Struktur mit hohem Aspektverhältnis gebildet werden können.

Durch einen Eliminierungsprozess wurde die anfängliche Entdeckung dieser linearen Biokomposite, die in vollständigen Zellkulturmedien stattfand, zu einem definierten Protokoll von essentiellen Elementen vereinfacht, die für die Selbstorganisation der Biokomposite benötigt werden. Es wurde entdeckt, dass die Selbstorganisation von zwei Arten von hochlinearen Biokompositen mit zwei Ausgangsmetallkomponenten möglich ist: 1) CNPs und 2) Kupfersulfat, wobei die gemeinsame biologische Komponente Cystin ist. Obwohl bereits zuvor über komplexere, so genannte kupferhaltige Strukturen vom Typ "Seeigel" und "Nanoblumen" mit nanoskaligen und mikroskaligen Merkmalen berichtet wurde, wurden diese unter nicht-biologischen Bedingungen hergestellt, wie z. B. Temperaturen von 100 °C oder mehr 6-8. Unseres Wissens nach wurde die Synthese einzelner, linearer kupferhaltiger Nanostrukturen, die in flüssiger Phase unter biologischen Bedingungen skalierbar sind, bisher nicht beschrieben.

Eines der Ausgangsmaterialien, die für die Synthese von Nanokompositen verwendet werden, nämlich CNPs, wurde zuvor als sehr giftig für Zellen berichtet 4. Kürzlich wurde berichtet, dass diese Strukturen nach der Bildung der Nanokomposite pro Masse weniger toxisch sind als die Ausgangs-NPs 9. Somit kann die hier beschriebene Synthese aus einer biologischen und biochemischen Reaktion abgeleitet werden, die bei der Stabilisierung reaktiver Kupferspezies nützlich ist, sowohl im Sinne der Umwandlung der NP-Form in größere Strukturen als auch bei der Herstellung von Kompositen, die für Zellen weniger toxisch sind.

Im Gegensatz zu vielen anderen Nanomaterialformen, von denen bekannt ist, dass sie bei Wechselwirkung mit biologischen flüssigen Medien 10,11 aggregieren oder verklumpen, vermeiden die hier beschriebenen hochlinearen Komposite eine Aggregation, möglicherweise aufgrund einer zuvor berichteten Ladungsumverteilung 9. Wie in der aktuellen Arbeit beschrieben, ist diese Vermeidung der Aggregation aus mindestens 3 Gründen für die Arbeit mit den einmal gebildeten Strukturen geeignet: 1) einmal gebildete Verbundstrukturen können durch Zentrifugation konzentriert und dann durch Vortex-Mischen leicht wieder dispergiert werden; 2) Die gebildeten Strukturen können durch Beschallung für verschiedene Zeiträume in der durchschnittlichen Größe verringert werden; und 3) die gebildeten linearen Strukturen können ein zusätzliches Werkzeug zur Vermeidung des kürzlich beschriebenen "Kaffeeringeffekts" 12 bereitstellen und somit ein Dotierungsmittel zur Erzeugung gleichmäßiger verteilter Beschichtungen von Materialien bereitstellen, insbesondere solchen, die kugelförmige Partikel enthalten.

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Protokoll

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1. Planung der Experimente

  1. Bestimmen Sie das Volumen von Kupfer-Nanocomposites zur Synthese benötigt. Auf dieser Basis wählt eine Anzahl kleinvolumigen Flaschen (25 cm 2) oder größer Kolben, wie unten bei der Herstellung der Materialien angegeben.
  2. Für diese Synthese, mit einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 und mindestens 40% Luftfeuchtigkeit. Sicherzustellen, dass diese ein Inkubator ist und dass sie nicht so oft über den Zeitraum der Synthese (ca. 24 h) gestört werden.
    ACHTUNG: wiederholtem Öffnen und Schließen des Inkubators wird sicherlich dazu führen Temperaturschwankungen, die zu einer veränderten Synthese der Nanokomposit-Strukturen führen kann.

2. Herstellung von Materialien

  1. Bereiten alle Materialien frisch vor dem Beginn eines Versuchs, durch Zugabe von festem Material, Lösungsmittel direkt vor der Synthese beginnen soll. Keeping Stammlösungen von Cystin und Kupferausgangsstoffe in Flüssigkeit für lange Zeiten bevor das Experiment wird nicht empfohlen und kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Sobald Sie vom Anbieter geöffnet halten Ausgangsstoffe trocken durch Umwickeln der Oberseite des Behälters mit Parafilm.
    Anmerkung: Das folgende Protokoll ist als ein Beispiel für eine Reaktion in einer 25 cm2 Zellkulturflasche unter Verwendung von 7 & mgr; l Cystin, 6,643 & mgr; l steriles Wasser, und 350 ul CNPs verwendet.
  2. Vorbereitung einer 2 mg / ml Lösung von Kupfer-Nanopartikeln durch Einwiegen mindestens 2 mg CNPs. Einweghandschuhe tragen bei diesem Schritt, um mögliche Kontakt des CNPs mit der Haut zu vermeiden. Legen Sie die Nanopartikel in einer leeren sterilen 16 ml Glasfläschchen.
    1. In die Durchstechflasche mit CNPs, fügen steril VE-Wasser in dem entsprechenden Volumen, um eine 2 mg / ml-Lösung zu machen und Vortex die Lösung für 20 Sekunden, um die Dispersion der Nanopartikel vor der Synthese beginnt bereitzustellen (mindestens 1 ml Gesamtvolumen wird empfohlen). Stellen Sie das Fläschchen mehr als die Hälfte Weg zu füllen nicht mit Wasser, da dies hemmt Mischen durch Vortexen. CNPs will schnell auf den Boden der Ampulle absetzen und wird dunkel in der Farbe (grau bis schwarz) angezeigt.
    2. Beschallen die CNP-Lösung für 17 Minuten bei Raumtemperatur, um eine maximale Dispersion CNPs vor Beginn der Synthese bereitzustellen. In regelmäßigen Abständen überprüfen, um sicherzustellen, dass CNPs aufgrund Mischen einer Beschallung. Nach einer erfolgreichen Beschallung bleiben CNPs in Lösung für mindestens 30 min suspendiert, und die Lösung ist dunkel in der Farbe sein.
  3. Abwiegen ausreichende Masse von Cystin, um eine 72,9 mg / ml Lösung für die Synthese zu machen. Seit Cystin ist nicht in Wasser löslich ist direkt, legen Sie die gewogen Cystin in einer antistatischen Wägegefäß.
    1. In den Wiegebehälter, Cystin, setze ausreichend Volumen sterilen, 1 M NaOH, so daß der Cystin vollständig auflöst. Beispielsweise lösen sich 7,29 mg Cystin vollständig in 100 ul 1 M NaOH, um eine 72,9 mg / ml Lösung herzustellen.
    2. Um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, führen Sie diesen Schritt in einem sterilen Flussgewebekultur Kapuze.
      ACHTUNG: NaOHbei 1 M Konzentration ist ätzend, bei diesem Schritt, um den Kontakt von konzentrierter NaOH mit der Haut zu verhindern, so Einmalhandschuhe tragen
  4. Die Arbeit in einem sterilen Gewebekultur Kapuze, hinzufügen, 7 & mgr; l von Cystin mit 6643 ul sterilem Wasser auf die sterile Synthese Kolben erste und ließ Inkubation 30 Min im Brutschrank bei 37 ° C mit dem Kolben entlüftet Kappe (lose), um eine wirksame Mischen. Resuspendieren 2 mg / ml Lösung CNP durch Vortexen für 30 Sekunden, da CNPs wird nach der Beschallungsschritt angesiedelt haben.
    1. Ausreichend CNP-Lösung auf die Synthese Kolben (unter Verwendung einer sterilen Technik), um die folgenden Komponentenverhältnisse beizubehalten: 1 Teile kombinieren Cystin, 50 Teile CNPs, und 949 Teilen sterilem Wasser in einem 25 cm 2 Zellkulturflasche, die Synthese zu starten. Zum Beispiel für eine 7 ml Volumen Synthese kombinieren 7 ul von Cystin-Stammlösung, 350 ul CNPs und 6.643 & mgr; l sterilem Wasser. Setzen Sie die Kappe auf der Flasche und ziehen, so dass es secure.
    2. Nach dem Kombinieren aller Komponenten für die Synthese, vorsichtig mischen in dem Kolben durch Verwirbelung 4-5 mal. Zeigen Kolben im CO 2 Inkubator und der Kolben durch Lösen der Entlüftungskappe, so dass es den Gasaustausch in und aus dem Kolben während der Synthese sein.
  5. Erlauben Synthese in den Inkubator für ungefähr 24 Stunden laufen. Während der Synthese kann man beobachten, wobei die Mikroskopie und durch das Auge, die Bildung von hochlinearen Composites.
    Hinweis: Der Prozess der Bildung der Strukturen kann sich plötzlich in dem Sinne, dass die Strukturen anfänglich schwer zu erkennen geschieht, dann schreitet Aussehen schnell zu einer zunehmender Dichte. Bildung kann daher vor 24 Stunden auftreten. Das Verfahren kann auch mit dem Auge beobachtet werden, wenn Strukturen größer und ihre Dichte zunimmt. Während die Erzeugung der Strukturen kann im Laufe der Zeit unter dem Mikroskop und mit dem Auge zu späteren Zeitpunkten beobachtet werden, kontinuierlich Unterbrechung der Synthesebedingungen und der Temperatur kann zu einer schlechten führenSynthese führt.
  6. Beenden Synthese Biokomposite durch dichtes Verschließen des Synthesekolben und Speichern der Behälter in einem Kühlschrank (4 ° C). Strukturen, einmal erzeugt, bleiben stabil in dieser Form für mindestens ein Jahr. Etikett der Kolben mit Synthesebedingungen, einschließlich verwendeten Komponenten, Datum der Synthese sowie der Inkubationszeit der Synthese vor Beendigung.

3. Synthese Mit Kupfersulfat

  1. Führen Sie die Selbstorganisation Synthese durch Ersetzen CNPs mit Kupfersulfatsalz. Verwendung einer sterilen Technik lösen sich bei mindestens 2 mg an Kupfersulfat in einem ausreichenden Volumen von sterilem entionisiertem Wasser auf eine 2 mg / ml Lösung herzustellen. Die Kupfersulfat-Kristalle leicht in Lösung gehen bei dieser Konzentration, aber vortexen das Fläschchen, wenn nötig, und prüfen Sie nach Augenmaß, um sicherzustellen, dass alle Kristalle gelöst sind.
  2. Nach der Herstellung der Kupfersulfat, durchzuführen Synthese, wie zuvor beschrieben, aber unter Ersatz CNPs mit dem Kupfersulfat.
    Hinweis: Selbstorganisierte Nanocomposites mit Kupfersulfat als Ausgangsmaterial erwiesen sich als viel konsequenter in endgültige Form als für Strukturen aus CNPs synthetisiert.
  3. Beenden Sie die Synthese von Kupfersulfat Biokomposite wie für CNP-Composites (Schritt 2.6) und speichern sie langfristig bei 4 ° C.

4. Charakterisierung und Handhabung Biocomposites Post-Synthese

  1. Charakterisieren Biokomposite von CNPs und von Kupfersulfat mit weißen Lichtmikroskopie 9 und durch Elektronenmikroskopie 9 abgeleitet.
    1. Zur Charakterisierung und Prüfung von Biokomposite nach der Synthese von weißen Lichtmikroskopie, verwenden Sie ein inverses Mikroskop als Verbundwerkstoffe werden an der Bodenfläche des Kolbens innerhalb weniger Minuten der Verlegung der Kolben flach niederzulassen, und kann dann in den Mittelpunkt gerückt werden. Verwenden Sie das Hellfeld-Einstellung auf dem Mikroskop, um den Kontrast zwischen Biokomposite und dem flüssigen Medium zu maximieren. Composites aus CNPs und cop abgeleitetpro Sulfat beide scheinen klare bis opake in Farbe, aber nicht umgesetzten CNP Aggregate wird sehr dunkel in der Farbe angezeigt.
      1. Verwenden Sie eine Digitalkamera mit dem Mikroskop verbunden, um Bilder der Verbundwerkstoffe zu erfassen. Ein Bereich von Längen für die einzelnen Strukturen beobachtet werden.
    2. Zur Charakterisierung und Prüfung von Biokomposite nach der Synthese und nach Lagerung bei 4 ° C, ermöglichen Kolben auf Raumtemperatur für mindestens 15 Minuten kommen, wie Kolben wird Kondensation zunächst nach der Entnahme aus Kühlschrank, der verschleiern wirksam Schwerpunkt bei der Durchführung Mikroskopie zu bilden. Nachdem man Gleichgewichtseinstellung auf RT, wischen Sie die obere und untere Fläche des Kolbens mit einem sauberen Papiertuch, um die Mikroskopie Bildqualität zu maximieren.
    3. Bei der Arbeit mit oder bildgebenden Verbundwerkstoffe, die langfristig gespeichert haben, Wirbel der Kolben für 30 Sekunden, um Klumpen von Verbundwerkstoffen, die während der in den Kühlschrank zu bilden distanzieren. Nach Vortex untersuchen die Strukturen mit einem umgekehrten micROSCOPE um sicherzustellen, dass Aggregate dissoziiert und wiederholen Vortexen wie nötig.
    4. Verwenden invertierten Weißlichtmikroskopie, um die Wirksamkeit der Synthese für eine gegebene Experiment mit CNPs beurteilen. Beispielsweise belegen die Anwesenheit oder Abwesenheit von nicht umgesetztem Synthese CNPs in Kolben für CNP-abgeleiteten Biokomposite von Fläschchen mit verschiedenen Parametern wie Zeitpunkt der Synthese verwendet.
      Hinweis: Einzelne CNPs sind zu klein, um mit einem Lichtmikroskop beobachten, aber nicht umgesetzten CNP-Aggregate werden als Rundform und dunkle Objekte angezeigt werden, im Gegensatz zu den erfolgreich synthetisiert CNP-Verbundwerkstoffe, die eine High-Seitenverhältnis, lineare Form haben wird, und haben eine Reihe von verschiedenen Längen. Vermeiden Durchführung Synthese zu lange einer Zeit vor der Beendigung, da dies in stark verzweigten "urchin" artigen Strukturen, die schwer in die einmal gebildeten einzelnen Strukturen zu verteilen sind führen.
    5. Verwenden invertiert weißen Lichtmikroskopie, um die Wirksamkeit zu beurteilender Synthese für ein gegebenes Experiment unter Verwendung von Kupfersulfat. Da Kupfersulfat geht vollständig in Lösung unter Verwendung dieses Protokolls wird die Lösung weniger dunkel als die Lösung aus der Synthese mit Hilfe CNPs angezeigt. Dokumentieren Sie die Größe und das Ausmaß der Kupfersulfat-Verbundwerkstoffen durch den Vergleich Fläschchen mit verschiedenen Synthesebedingungen wie Zeit der Synthese vor der Beendigung.
      Hinweis: Erfolgreich synthetisierten Verbundwerkstoffe wird eine Reihe von unterschiedlichen Längen zu zeigen. Vermeiden Durchführung Synthese zu lange einer Zeit vor der Beendigung, da dies in stark verzweigten Aggregaten von Verbundwerkstoffen, von denen einige "Seeigel-like" in Struktur ergeben, und die schwierig zu einmal gebildet einzelnen Strukturen zu verteilen sind .
  2. Konzentrations Biokomposite nach der Synthese, zentrifugieren Lösungen von Verbundwerkstoffen in einem Zentrifugenröhrchen. 6 ml entweder CNP-abgeleiteten Strukturen oder Kupfersulfat-abgeleiteten Strukturen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 10 minbei 500 · g bei RT unter Bildung eines Pellets. Für kleinere Volumina, fügen Sie 500 ul von Strukturen in Lösung zu 0,6 ml großen Tuben. Zentrifugation bei 2.000 × g bei Raumtemperatur für mindestens 10 min, um ein Pellet zu bilden.
    1. Nach Zentrifugieren für eine ausreichende Zeit (mindestens 10 min für microfuges), speichern die beobachtbare Pellet am Boden des Röhrchens, wo die Strukturen durch sorgfältiges Entfernen der überstehenden Flüssigkeit über dem Pellet konzentriert. Von Kupfersulfat abgeleitet Biocomposite Strukturen erscheinen in der Farbe blau und Strukturen aus CNPs abgeleitet sind dunkler (grau bis schwarz).
    2. Noch ein Verbundstoffe an dieser Stange und den Vorgang im gleichen Röhrchen, um Strukturen zu konzentrieren, falls gewünscht. Zu der konzentrierten Pellets zu zerstreuen, fügen Sie das gewünschte Volumen der Lösung in das Röhrchen und Vortex für 10-30 sec.
  3. Beschallen Strukturen einmal gebildet, um die durchschnittliche Populationsgröße (Länge) der Strukturen zu bewegen, um Werte zu senken. Platz Strukturen in sterilem deionisiertem Wasser und Ultraschall behandeln zu least 10 min. Unter Verwendung dieses Verfahrens mit der Zeit geworden Strukturen fragmentiert und kleiner im mittleren Länge (siehe 6 des Textes). Dokumentänderungen in Verbund Größen mit unterschiedlichen Beschallungszeiten unter Verwendung eines invertierten Weißlicht-Mikroskop und Digitalkamera.

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Ergebnisse

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1 zeigt ein Flussdiagramm schema der Syntheseschritte, die in dieser Arbeit beschriebenen linearen Biokomposite bilden. CNPs oder Kupfersulfat als Ausgangsmaterialien werden mit sterilem Wasser kombiniert, um eine 2 mg / ml-Lösung zu bilden, ist diese Lösung vermischt und beschallt, um eine gleichmäßige Mischung zu erhalten, und das Kupferlösung wird dann in dem folgenden Verhältnis zur Synthese vermischt: 949 Teile sterile Wasser: 50 Teile Kupfer-Mischung: 1 Teil Cystin-Stammlösung. Die tatsächlichen V...

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Diskussion

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Beim Auswerten potentiellen toxischen Wirkung von Nanomaterialien einschließlich CNPs, wurde beobachtet, daß über die langfristige, CNPs wurden aus einem anfänglich mehrere dispergierte Partikelverteilung auf eine größere, aggregierten Form (Figur 2) umgewandelt. In einigen Fällen sind diese hochaggregierten Formationen, die in der Zellkulturschale unter biologischen Bedingungen hergestellt wurden, gebildet hochlinearen Projektionen vom zentralen Aggregat, erinnert an die zuvor beschriebenen Kupfer enth...

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Offenlegungen

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Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken Alfred Gunasekaran für ihre technische Unterstützung bei Elektronenmikroskopie-Studien am Institute of Micromanufacturing an der Louisiana Tech University und Dr. Jim McNamara für die Unterstützung bei weiteren Mikroskopie-Studien. Die beschriebene Arbeit wurde teilweise unterstützt durch das Louisiana Board of Regents PKSFI Contract No. LEQSF (2007-12)-ENH-PKSFI-PRS-04 und die James E. Wyche III Stiftungsprofessur der Louisiana Tech University (zum M.D.).

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Materialien

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CO2 Inkubator Modell # 2425-2VWR (https://us.vwr.com)Verkäuferkontaktieren Aktuelles Modell calalog # 98000-360
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Zellkulturzentrifuge Modell Z323KLabnet (http://labnetinternational.com/)Verkäufer kontaktierenAktuelles Modell Z206A Katalog # C0206-A
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Referenzen

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Synthese von Kupfer NanopartikelnBildung von Cystin Biokompositenskalierbare Nanokomposit ProduktionFeldemissions REMenergiedispersive R ntgenspektroskopieGr ensteuerung durch BeschallungZentrifugationskonzentrationsmethodeCharakterisierung mittels Wei lichtmikroskopie

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