Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht<em&gt; Drosophila</em

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzungen (TBI) in Drosophila zuzufügen. Dieses Verfahren stellt ein Tor zu den zellulären und molekularen Mechanismen, die TBI Pathologien mit der Vielzahl von experimentellen Werkzeuge und Techniken für Fliegen verfügbar zugrunde zu untersuchen.

Zusammenfassung

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) betrifft Millionen von Menschen jedes Jahr, was zu Beeinträchtigungen der physischen, kognitiven und Verhaltensfunktionen und Tod. Studien unter Verwendung von Drosophila haben wichtige Durchbrüche im Verständnis neurologischer Prozesse beigetragen. So mit dem Ziel, das Verständnis der zellulären und molekularen Grundlagen der TBI Pathologien bei Menschen, die High Impact Trauma (HIT) Gerät an geschlossenen Kopf TBI in Fliegen verursachen, haben wir. Fliegen auf die HIT Gerätedisplay Phänotypen mit der Menschen TBI wie vorübergehende Handlungsunfähigkeit und progressive Neurodegeneration unterzogen. Das HIT-Gerät verwendet eine federbasierten Mechanismus, um Fliegen gegen die Wand eines Fläschchens treiben, wodurch eine mechanische Beschädigung des Fliegengehirns. Die Vorrichtung ist preiswert und leicht zu konstruieren, die Arbeitsweise ist einfach und schnell, und sie erzeugt reproduzierbare Ergebnisse. Folglich kann die HIT-Gerät mit vorhandenen experimentellen Werkzeuge und Techniken für Fliegen oder zur Adresse Grund kombiniert werdenFragen zu TBI, die zur Entwicklung von Diagnostika und Behandlungen für TBI führen kann. Insbesondere kann die HIT-Gerät verwendet werden, um großflächige genetischen Screens durchzuführen, um die genetische Basis von TBI Pathologien zu verstehen.

Einleitung

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) als Verletzung des Gehirns von einer externen mechanischen Kraft definiert. Am häufigsten TBI Ergebnisse geschlossenen Kopf Kräfte wie stumpfe Kräfte und Trägheits Beschleunigungs- und Verzögerungskräfte, die das Gehirn, um das Innere des Schädels schlagen verursachen. In den Vereinigten Staaten, wird geschätzt, dass 50.000 Menschen sterben jedes Jahr an TBI und von 2,5 bis 6.500.000 Personen sind mit den Folgen der TBI leben, einschließlich schwächenden physischen, kognitiven und Verhaltensproblemen ^1,2. Die Folgen der TBI sind nicht nur durch primäre mechanische Verletzungen des Gehirns, sondern auch sekundäre zelluläre und molekulare Verletzungen des Gehirns sowie anderen Geweben, die über die Zeit ^3-5 auftreten. Die Entwicklung von Methoden zur Diagnose und Behandlung TBI hat sich als schwierig erwiesen, weil TBI ist eine komplexe Krankheit Prozess. Die variable Natur des Primärverletzungen, die menschliche Physiologie und Umweltfaktoren führt zu heterogenen Sekundär injuries und Pathologien. Zugrunde liegende variable Faktoren umfassen die Schwere der primären Verletzung, die Zeit zwischen den sich wiederholenden Primärverletzungen, und das Alter und den Genotyp des Individuums. Zu verstehen, wie jede Variable Faktor trägt zu den Folgen der TBI wird wahrscheinlich in der Entwicklung von Methoden zur Diagnose und Behandlung TBI ^6,7 zu unterstützen.

Hier beschreiben wir eine Methode zur zuzufügen geschlossenen Kopf TBI in Drosophila melanogaster (Fruchtfliege), die verwendet werden können, um den Beitrag der variablen Faktoren auf die Folgen der TBI abzugrenzen. Die Methode basiert auf einer anfänglichen Beobachtung, dass intensiv Schlagen der Seite eines fly Kulturfläschchen gegen die Handfläche verursacht Wildtyp-basierte fliegt zu werden vorübergehend außer Gefecht gesetzt, eine wahrscheinliche Folge TBI. So bauten wir die High-Impact Trauma (HIT) Gerät, um die Beschleunigungs- und Verzögerungskräfte aus der Hand schlagen Aktion zu wiederholen. Ein High-Speed-Film zeigt, dass ein einzelner Angriff überHIT Gerät verursacht fliegt in das Fläschchen Wand mit ihren Kopf und Körper ⁸ kontaktieren mehrmals. Zu einem gewissen Grad sind alle Kontakte geeignet sind, die Fliegenhirn dazu führen, abprallen und verformen gegen die Kopfkapsel, ähnlich dem, was passiert mit den Menschen in Stürze und Autounfälle ^9. Dementsprechend fliegt mit dem HIT Gerätedisplay Phänotypen, die mit Hirnverletzung, einschließlich der vorübergehenden Arbeitsunfähigkeit, gefolgt von Ataxie, allmähliche Erholung der Mobilität, Veränderungen der Genexpression in den Kopf, und progressive Neurodegeneration im Gehirn ¹⁰ behandelt. Somit ermöglicht die HIT-Gerät kann TBI mit der riesigen Arsenal von experimentellen Werkzeuge und Techniken für Fliegen entwickelt studieren.

Protokoll

1. Aufbau der HIT Geräte

1. Befestigen Sie den Frühling in den Vorstand mit zwei Klemmen und vier Schrauben (1A). Zentrieren Sie die Klammern in Bezug auf die Breite der Platte und stoßen Sie sie gegeneinander mit der Außenklemme bündig mit der Kante der Platine. Vor dem Anbringen der Klemmen, biegen sie mit einer Zange zu dicht über der Feder passen.
   HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für eine Beschreibung der für den Bau des HIT-Gerät benötigten Materialien. Die eingespannt Ende der Feder sollte 1/8 Zoll (3,2 mm) von der Kante der Platte zu sein, und das freie Ende sollte über das Brett von 3/4 Zoll (19 mm) zu verlängern. Stellen Sie die Feder, so dass sie parallel zu der Länge der Platte liegt.
2. Wickeln Sie das freie Ende des Feder einmal um mit dem Klebestreifen Klettschlaufen. Der äußere Rand des Velcro sollte bündig mit dem Ende der Feder sein. Der Klettverschluss ist wichtig, denn es wird verwendet, um das Fläschchen mit dem Feder von cre sicherntriebs einen dichten Klemmfitting. Der Klettverschluss ermöglicht auch eine einfache Verbindung und Entfernung des Vials, so viele Ampullen in einer kurzen Zeit verarbeitet werden.
3. Legen Sie das Eis Eimer Deckel auf den Kopf, zentriert ist, fest gegen die Holzbrett. Richten Sie die erhöhten Bereich der Eiskübel Abdeckung, so dass die lange Kante parallel zur Breite der Platte ist. Beachten Sie, dass der erhöhte Bereich der Eiskübel ist 1/2 Zoll (13 mm) über dem Holzbrett, so dass, wenn ein Fläschchen ist mit der Feder befestigt ist die Feder nicht flach auf dem Brett.
4. Schieben Sie das ganze Gerät gegen einen festen Gegenstand wie einer Wand, so dass das Eis Eimer Deckel zwischen der Karte und dem Objekt eingeklemmt und bewegt sich nicht.
5. Kleben Sie die Papierwinkelmesser, um den Boden eines Kartons fliegen Probenteller und stand es am Rand an der Länge der Platte, so dass die 90 ° Marke mit der Feder ausgerichtet ist, wenn es auf eine vollkommen vertikale Position gezogen wird.

2.Betrieb der Vorrichtung HIT

1. Platz zwischen 1 und 60 CO ₂ -anesthetized in einem leeren Fläschchen fliegt und Stopfen des Fläschchens mit einem eng anliegenden Wattebausch.
2. Beschränken die Fliegen auf den Boden 1 Zoll (2,5 cm) des Fläschchens, indem Sie den Wattebausch in die Flasche, bis sie 1 Zoll (2,5 cm) aus dem Boden. Es ist hilfreich, um eine Linie auf dem Fläschchen an der 1 Zoll (2,5 cm) Marke zu ziehen. Man beachte, dass Begrenzungslinie um größere oder kleinere Bereiche der Phiole kann die Schwere von Phänotypen beeinflussen.
3. Warten Sie 5 Minuten für die Fliegen, die Mobilität aus dem CO ₂ zu erholen. Man beachte, dass es nicht bekannt ist, ob 5 Minuten ist ausreichend, um die Auswirkungen von CO ₂ vollständig zu entfernen.
4. Führen Sie das Ende der Feder in das Fläschchen, bis die Innenkante des Velcro ist bündig mit der Oberseite des Fläschchens (1B). Wenn die Feder flach liegt, sollte 1 Zoll (2,5 cm) des Fläschchens den erhöhten Bereich der Eiskübel Abdeckung überlappen. Fläschchen wieder verwendet werden mjederzeit.
5. Sitzend, halten Sie die Durchstechflasche an der Region Velcro mit dem Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Halten Sie die Karte fest in die Tisch mit der rechten Hand. Alternativ können Sie C-Klemmen, um das Brett fest an der Tisch halten.
6. Ziehen Sie die Feder vollkommen gerade wieder in den gewünschten Winkel. Lösen Sie die Feder. Lassen Sie den Frühling bis zum Stillstand kommen.
7. Küvette aus der Feder und damit die Fliegen für ≥5 min erholen. Betreff die Fliegen auf einen anderen Streik oder übertragen die Fliegen in ein Fläschchen mit Fliegen Essen.
   ANMERKUNG: Eine Vielzahl von Assays kann verwendet werden, um die phänotypischen Auswirkungen der Schläge vom HIT Vorrichtung auszuwerten. Beispielsweise können Wirkungen auf Langlebigkeit durch Analysieren der Prozent der Fliegen, die manchmal nach der Verletzung überleben bestimmt wird, können Wirkungen auf Gehirn Morphologie durch histologische Analyse des Kopfes bestimmt werden, und die Auswirkungen auf die Genexpression kann durch quantitative Analyse der mRNA-Konzentrationen bestimmt werden ^10.
8. Findunge Wirkungen des Verfahrens, die nicht aufgrund von Streiks identisch Behandlung Kontrollfliegen, die nicht an Streiks ausgesetzt sind. Gehörschutz tragen, weil die Auswirkungen der Ampulle gegen den Eiskübel Abdeckung erzeugt ein lautes Geräusch.

Ergebnisse

Wir interessieren uns für das Verständnis, warum sterben Fliegen kurz nach Primärverletzung. Um den Tod zu quantifizieren, bestimmten wir die Sterblichkeit Index bei 24 Stunden (MI _24), das der Anteil der Fliegen, die innerhalb 24 Stunden des Primärverletzung gestorben ist. Flies zu Streiks von der HIT-Gerät unterzogen wurden bei 25 ° C in einem Fläschchen mit Fliegen Essen inkubiert und die Anzahl der toten Fliegen wurde nach 24 Stunden gezählt. Wir haben diesen Ansatz auf Faktoren, die den MI ₂₄ ...

Diskussion

Die HIT-Gerät Methode wird von anderen Methoden, die traumatischen Verletzungen verursachen, bei Fliegen durch die Tatsache, dass es bewirkt, dass geschlossene Kopf nicht durchdringen TBI ¹¹ aus. Darüber hinaus nimmt das HIT Gerät Verfahren weniger Zeit, Mühe und Geschick, um TBI in viele Fliegen verursachen, so dass die Methode ist besser geeignet als andere Methoden, um groß angelegte genetische Screens. Schließlich zeigt die Tatsache, dass die primäre Verletzungen durch das HIT Vorrichtung zugefügt werden ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Verzinkte Druckfeder	The Hillman  Gruppe	540189	9 7/8 Zoll (Länge, 2,2 cm), 15/16 Zoll (Außendurchmesser, 2,4 cm), 0,12 Zoll (Drahtstärke, 0,3 cm)
Holzbrett			9 Zoll (Länge, 22,9 cm), 6,5 Zoll (Breite, 16,5 cm), 0,75 Zoll (Höhe, 1,9 cm)
Klemmen	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3,10 Zoll (Länge, 7,9 cm), 0,68 Zoll (Breite, 1,7 cm), 1,11 Zoll (Höhe, 2,8 cm), EMT Zwei-Loch-Gurte, klicken Sie auf Typ für 1 Zoll (2,5 cm) Stahl EMT Rohr
Schlaufe Hälfte des selbstklebenden Klettverschlusses			3 Zoll (Länge, 7,6 cm), (3/4 Zoll Breite, 1,9 cm)
Polyurethan-Eiskübelabdeckung	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 Zoll (Länge, 23,2 cm), 9 1/8 Zoll (Breite, 23,2 cm), 1 1/4 Zoll (Höhe, 3,2 cm)
Kunststoff-Fliegenfläschchen	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 Zoll (Höhe, 9,4 cm), 1 1/16 Zoll (Innendurchmesser, 2,7 cm), 1 1/8 Zoll (Außendurchmesser, 2,9 cm)
Große Wattebällchen	Fisher Scientific	22-456-883
Papier-Winkelmesser			10 Zoll (Durchmesser, 25,4 cm)