Die Manschettentechnik verkürzt und erleichtert das Modell der heterotopen zervikalen Herztransplantation bei Mäusen, indem technisch anspruchsvolle Nahtanastomosen kleiner Gefäße vermieden werden. Die technischen Details, die in diesem Videopapier gezeigt werden, sollten es Forschern ermöglichen, dieses Modell in ihren Labors zu etablieren.
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Methodenartikel
Heterotope Cervical Herztransplantation bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die heterotope zervikale Herztransplantation bei Mäusen ist ein wertvolles Werkzeug in der Transplantations- und Herz-Kreislauf-Forschung. Die Manschettentechnik vereinfacht dieses Modell erheblich, indem sie schwierige Nahtanatostomen kleiner Gefäße vermeidet und dadurch die warme Ischämiezeit verkürzt. Im Vergleich zur Bauchtransplantatimplantation ist das zervikale Modell weniger invasiv und das implantierte Transplantat ist für weitere Nachuntersuchungen leicht zugänglich. Anastomosen werden durchgeführt, indem die aufsteigende Aorta des Transplantats mit der Arteria carotis communis des Empfängers über die Manschette gezogen wird und die Hauptpulmonalarterie mit der Vena jugularis externa über die Manschette gezogen wird. Die Auswahl der geeigneten Manschettengröße und die vollständige Mobilisation der Gefäße sind wichtig für eine erfolgreiche Revaskularisation. Ischämie-Reperfusionsschäden (I/R) können durch Perfusion des Transplantats mit einer kardioplegischen Lösung und durch Hypothermie minimiert werden. In diesem Artikel stellen wir technische Details für eine vereinfachte und verbesserte Manschettentechnik vor, die es Chirurgen mit grundlegenden mikrochirurgischen Fähigkeiten ermöglichen soll, den Eingriff mit einer hohen Erfolgsquote durchzuführen.
Einleitung
Die Herztransplantationsmodell wird häufig verwendet, um I / R-Verletzung, Allotransplantatabstoßung nach Transplantation Vaskulopathie und die Effizienz der immunmodulierende Mittel zu untersuchen. Mausmodelle kombinieren viele Vorteile wie die bekannten immunologischen und genetischen Hintergründen, die Verfügbarkeit von vielen Inzucht und transgenen Linien und der relativ geringen experimentellen Kosten.
Im Jahr 1973 wurde eine Technik der Bauchherztransplantation bei Mäusen zuerst von Corry et al. 1 beschrieben In diesem Modell Transplantate werden von Ende-zu-Seite-Anastomosen der aufsteigenden Aorta zu abdominalen Aorta des Empfängers und des Hauptlungenarterie zu der unteren Hohlvene revaskularisiert. 1991 wurde ein Nahttechnik für zervikale Herztransplantation bei Mäusen durch Chen et al. 2 beschrieben In diesem Modell wird ein Rück koronare Herzdurchblutung wird durch Anastomose der A. carotis des Empfängers zu den aufsteigenden Aorta des gr gegründetachtern. Das venöse Blut Drains über den Koronarsinus in das rechte Atrium, den rechten Ventrikel und durch die Lungenarterie in den Empfänger äußere Jugularvene (Figur 1) ausgestoßen wird. Im Vergleich zu der Bauch Graft-Implantation der zervikale Modell ist weniger invasiv und die oberflächliche Lage des Transplantats ermöglicht eine sehr gute Zugänglichkeit für zusätzliche Kontrolluntersuchungen (zB Palpation, Echokardiographie, Intravitalfluoreszenzmikroskopie) 3,4.
Trotz technische Verbesserungen 5,6, wurde eine weitere Verbreitung dieses Modells aufgrund technischer Probleme beschränkt genäht Anastomosen von kleinen Schiffen mit einer hohen Inzidenz von Anastomosen Leckagen und Thrombosen führen. 1991, Matsuura et al. erläutert den Manschettenverfahren, bei dem die Gefäßwand über eine synthetische Zylinder, der das Modell des zervikalen Herztransplantationen 7 erleichtert stülpt. Die Technik war fueitere angenommen für verschiedene experimentelle Transplantationsmodellen einschließlich Nieren 8, Bauchspeicheldrüsen 9, des Körpers 10, Leber 11,12, 13,14 und Lungengefäßtransplantation 15. Im Vergleich zu der Nahttechnik die erforderliche Zeit für Anastomosen und somit ist das warme Ischämie Zeit kürzer, und es sind deutlich weniger vaskulären Komplikationen mit der Manschette Technik 16. Darüber hinaus ermöglicht es Chirurgen, mit wenig Ausbildung in der Mikrochirurgie, um den Betrieb mit einer hohen Erfolgsquote durchzuführen. Ein Nachteil der Manschette Technik ist Voraussetzung Ligatur der Arteria carotis, der zerebralen Durchblutung verändern können.
In diesem Video-Papier stellen wir ein verbessertes und vereinfachtes Manschettentechnik für zervikale Herztransplantation bei Mäusen.
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Protokoll
Alle Experimente wurden vom Deutschen Herzzentrum München und der Regierung von Bayern, Deutschland (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13) zugelassen. Die Tiere wurden in einer speziellen pathogenfreien Einrichtung untergebracht und erhielten menschlicher Obhut in Übereinstimmung mit den "Principles of Laboratory Animal Care" von der Nationalen Gesellschaft für Medizinische Forschung und dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" durch die National Academy bereitgestellt formuliert der Wissenschaften und von den National Institutes of Health (NIH Publikation Nr. 86-23, überarbeitet 1985) veröffentlicht.
HINWEIS: Ein kompletter Satz von sterilen mikrochirurgischen Instrumenten, darunter zwei gebogenen Pinzette und Gefäß Dilatatoren, ist notwendig für das Verfahren (Abbildung 2a). Perioperative Antibiotikaprophylaxe nicht routinemäßig notwendig, kann aber bei immungeschwächten Tiere angegeben werden. Die Tiere wurden unter Verwendung von terminaler Isofluran Inhalation geopfert.
Spender Vorbereitung und Graft-Ernte
- Betäuben das Tier durch intraperitoneale (ip) Injektion von Midazolam (5,0 mg / kg), Medetomidin (0,5 mg / kg) und Fentanyl (0,05 mg / kg Körpergewicht). Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf dem Operationsfeld und bestätigen chirurgische Toleranz durch die Pedalrückzugreflex.
- Desinfizieren Sie die Haut dreimal mit Chlorhexidin und führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt. Fahren Sie die Därme mit nassen Gaze auf der linken Seite, um den unteren Hohlvene aussetzen.
- Injizieren 50 IE Heparin in 0,4 ml Kochsalzlösung durch die Vena cava inferior zur Antikoagulation verdünnt. Einzuschneiden das Gefäß 1 min nach Heparinisierung.
- Öffnen Sie die Blende und führen Sie eine bilaterale Thorakotomie, um das Herz freizulegen. Der vorderen Brustwand kranial reflektiert und an der Stelle mit einer Klammer gehalten wird.
- Entfernen Sie den Thymus und unverblümt zu sezieren das Bindegewebe zwischen Aorta und Truncus pulmonalis. Einzuschneiden das Recht der oberen Hohlvene.
- Punktion der mobilisierten aufsteigenden Aorta auf der Ebene derTruncus brachiocephalicus mit einer 30 G-Nadel auf einer 5 ml Spritze befestigt und das Herz retrogradually langsam durchströmen, ohne übermäßigen Druck mit 3 ml 4 ° C kalter Kardioplegielösung. Vermeiden Sie das Eindringen von Luft in das Herz-Kreislauf. Drop eiskalter Kochsalzlösung auf das Transplantat zur weiteren Verbesserung der Herzstillstand.
- Trennen die Aorta proximal zu dem Ursprung des Truncus brachiocephalicus.
- Ligieren die untere und die beiden überlegenen Hohlvenen in der Nähe des Herzens mit 8-0 Seide und durchschneiden sie distal zu den Ligaturen.
- Präparieren Sie kostenlos die Lungenstamm als distal wie möglich. Ligieren die Lungenarterien in der Nähe der Bifurkation mit 8-0 Seide und durchschneiden sie distal.
- Ligieren die Lungenvenen alle zusammen mit einem einzigen 8-0 Seidenligatur und durchschneiden sie.
- Entfernen Sie das Herz aus dem Spender und speichern sie in eiskaltes kardioplegischen Lösung bis zur Implantation.
2. Empfänger Vorbereitung
- Bereitendie Manschetten für Anastomosen durch Schneiden des Polyimid-Schlauch mit einem No. 11 Skalpell oder einer Schere unter dem Mikroskop. Die Manschette besteht aus einem zylindrischen Körper und einer Verlängerung (1/3 des Umfangs) für die Platzierung des Gefäßklemme, die jeweils mit einer Länge von 1 mm (Abbildung 2b).
- Betäuben das Tier und bestätigen chirurgische Toleranz, wie oben beschrieben. Injizieren 0,25 ml warmen Kochsalzlösung subkutan (sc) für Flüssigkeitsersatz.
- Entfernen Sie die Haare von der rechten Halsbereich mit einem elektrischen Rasierer und legen Sie das Tier in Rückenlage auf einer warmen Unterlage. Sichern Sie sich die Beine mit Strängen der Band unter Vermeidung von Überdehnung der vorderen Gliedmaßen, da dies die Atmung beeinträchtigen. Decken Sie die Augen mit Augensalbe, um Trockenheit zu verhindern. Desinfizieren Sie die Operationsstelle dreimal mit Chlorhexidin.
- Einen Querhautschnitt von der rechten Kieferwinkel, um die Halsschlagkerbe.
- Unverblümt zu mobilisieren, die external Halsschlagader. Cauterize Seitenäste mit einer bipolaren Pinzette und durchschneiden sie.
- Teilen Sie die äußere Jugularvene zwischen Ligaturen auf der Ebene der Einmündung in die Vene von der Unterkieferspeicheldrüse.
- Ziehen Sie die äußere Jugularvene durch die Manschette und verschließt das Gefäß proximal durch Platzieren einer Gefäßklemme an der Verlängerung der Manschette. Entfernen Sie die Blattschraube und zu bewässern das Gefäßlumen mit 1:10 heparinisierter Kochsalzlösung.
- Evert die Gefäßwand über der Manschette und fixieren Sie es mit einem voreingestellten Umfangs 8-0 Seidenligatur.
- Entfernen Sie den oberflächlichen Teil des M. sternocleidomastoideus.
- Mobilisieren die rechte Arteria carotis communis und durchschneiden das Gefäß zwischen Ligaturen unter dem Karotisbifurkation.
- Ziehen der Halsschlagader durch die Manschette und verschließt den Behälter proximal durch Platzieren eines Yasargil Klemme an der Verlängerung der Manschette. Entfernen Sie die Blattschraube und zu bewässern das Gefäßlumen mit 1:10 heparinisierter Kochsalzlösung.
- Gently dilate das arterielle Lumen mit einem Schiff Dilatator, umzustülpen die Gefäßwand über der Manschette und fixieren Sie es mit einem voreingestellten Umfangs 8-0 Seidenligatur.
- Um ausreichend Platz für Graft-Implantation zu gewinnen, nehmen Sie den rechten Lappen der Unterkieferspeicheldrüse.
- Halten Sie das Operationsfeld feucht bis zur Implantation.
3. Graft-Implantation
- Legen Sie das Transplantat in den Empfänger Halsbereich auf den Kopf mit der Aorta medial orientiert und die Pulmonalarterie seitlich.
- Ziehen Sie die Aorta des Transplantats über der Manschette mit der Halsschlagader und sichern Sie die Anastomose mit einer umlaufenden 8-0 Seidenligatur.
- Einzuschneiden den Truncus pulmonalis auf seiner vorderen Seite und ziehen Sie sie über die Manschette mit der äußeren Halsschlagader. Auch hier sichern die Anastomose mit einer umlaufenden 8-0 Seidenligatur.
- Entfernen Sie die Klemme an der äußeren Halsschlagader, gefolgt von Lösen der Halsschlagader. Die Herzen füllt sofort mit Blut. Um r verbesserneperfusion fallen 37 ° C warmen Kochsalzlösung auf das Transplantat. Normalerweise entwickelt sich die Herzsinusrhythmus innerhalb einer Minute. Entfernen Sie die Manschette Verlängerung bei der venösen Seite.
- Stellen Sie sicher, korrekte Transplantatposition muss Anastomosen spannungsfrei und Gefäße ohne Torsion sein. Nicht kauterisiert Gefäße der Haut, da dies die Wundheilung beeinträchtigen. Blutungen in der Regel stoppt spontan. Schließen Sie die Haut mit einem einzigen 8-0 fortlaufende Naht.
4. Nachsorge
- Injizieren 0,25 ml warmen Kochsalzlösung sc zum Flüssigkeitsersatz.
- Um antagonisieren Drogen injizieren Naloxon (1,2 mg / kg), Flumazenil (0,5 mg / kg) und atipamezol (2,5 mg / kg Körpergewicht) SC das Tier Linke auf dem warmen Unterlage, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Beobachten Sie das Tier für mindestens eine weitere Stunde, um eine abnormale Verhalten registrieren. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren, bis sie vollständig Recove unterzogen wurde nicht zurückred.
- Bereitzustellen preemptive Analgesie mit Buprenorphin (0,05 mg / kg sc dreimal täglich) oder eine alternative Analgesie nach einem lokalen institutionellen Protokoll für eine Mindestdauer von 72 Stunden nach dem Eingriff.
- Der Chirurg und ein Tierarzt sollten die Tiere regelmäßig zu sehen. Im Falle der Gewichtsverlust> 15%, Apathie, Schwellungen oder chirurgische Seiten Infektion Tiere werden unter Verwendung von terminaler Isofluran Einatmen euthanasiert.
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Ergebnisse
Unser Team konnte die beschriebene Technik nach ca. 20 Trainings Operationen erfolgreich durchzuführen. Die größte Herausforderung ist es, die Gefäßwand der Halsschlagader über die Manschette umzustülpen, weil es leicht kippt zurück und mehrere Versuche können zum Reißen der Wand führen. Nach der Ausbildungszeit, die mittlere Gesamtoperationszeit betrug 60 ± 8 min. Rund 20 min sind für Spender der Ernte, 25 min zur Herstellung der Halsgefäße und 15 Minuten für die Anastomosen und Hautverschluss erforderlich.
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Diskussion
Wir haben mehr als 200 Herztransplantationen mit einer Erfolgsquote von über 90% in verschiedenen experimentellen Einstellungen vorgenommen. Mit dem hier beschriebenen Verfahren kann das gesamte Verfahren innerhalb von 60 min durch einen erfahrenen Chirurgen durchgeführt werden. Durch die Herstellung der Halsgefäße vor der Organbeschaffung kann insgesamt Transplantat Ischämie Zeit auf 20 min begrenzt werden. Zeit für Implantation (warme Ischämie Zeit) wesentlich kürzer ist mit der Manschette Technik im Vergleich zu der ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
M.-A. Deutsch wird gefördert durch das Dr. Rusche Forschungsprojekt (2014), die Deutsche Stiftung für Herzforschung und die Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie. M. Krane wird gefördert durch die Deutsche Stiftung für Herzforschung (F/37/11), Deutsches Zentrum für Herzkreislauf Forschung (DZHK B 13-050A; DZHK B 14-013SE) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KR3770/7-1; KR3770/9-1)
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Pinzette JFC-7.2 | S& T | P-00036 | Gebogene Spitze 0,20 mm |
| Gefäßdilatator D-5a | S& T | S-00124 | |
| Adventita Schere | S& T | S-00102 | |
| Klemme für Gefäße B-1V | S& T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3,5 mm Länge |
| Bipolare Pinzette | Micromed | 148-100-011 | Spitze 0,25 mm |
| Polyimid-Schläuche | River Tech Medical | 19-24 Gauge | |
| 8,0 Seidenligaturen | Catgut | ||
| Custodiol HTK-Lösung | Essential Pharmaceuticals |
Referenzen
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278(2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
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