Dieses Protokoll beschreibt die effiziente Induktion von hämogenem Endothel und multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Während der Entwicklung von einer Fachuntergruppe von Endothelzellen entstehen hämatopoetischen Zellen, hemogenic Endothel (HE). Modellierung HE Entwicklung in vitro ist für mechanistische Studien der endothelialen-hämatopoetischen Übergangs und blutbildenden Spezifikation. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die effiziente Induktion von HE aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) durch Überexpression von verschiedenen Sätzen von Transkriptionsfaktoren. Die Kombination von ETV2 und GATA1 oder GATA2 TFs wird verwendet, um die er mit pan-myeloischer Potential zu induzieren, während eine Kombination von GATA2 und TAL1 Transkriptionsfaktoren können zur Herstellung von SE mit erythroiden und megakaryozytischen Potential. Die Zugabe von LMO2 zu GATA2 und TAL1 Kombination wesentlich beschleunigt Differenzierung und erhöht erythroiden und Megakaryozyten-Zellen-Produktion. Dieses Verfahren stellt eine effiziente und schnelle Möglichkeit HE Induktion aus hPSCs und ermöglicht die Beobachtung des Endothel-hematopoietic Übergang in der Kulturschale. Das Protokoll enthält hPSCs Übertragungsverfahren und nach der Transduktion Analyse von HE und Blutvorläuferzellen.
Einleitung
Die einzigartige Fähigkeit des menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sich selbst zu erneuern und sich in Zellen der drei Keimblätter, einschließlich Blut zu unterscheiden, machen sie ein wertvolles Werkzeug für die mechanistische Studien von hämatopoetischen Entwicklung, Modellierung von Blutkrankheiten, Wirkstoff-Screening, Toxizitätsstudien und die Entwicklung von Zelltherapien. Da die Blutbildung im Embryo Erlöse aus hemogenic Endothel (HE) durch eine endotheliale hämatopoetischen Gangs 1,2, die Erzeugung von HE in Kulturen wäre sehr wichtig, um die molekularen Mechanismen, die zur Regelung der Endothelzellen zu hämatopoetischen Übergangs und h....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Viruspräparate und Transcription Factor Kombinationen
- Die Lösungen mit pSIN-EF1 lentiviralen Expressionsplasmid, das Protein-kodierende DNA für ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 und LMO2 (Tabelle 1).
- Messung der Konzentration und Reinheit von Plasmid-Präparationen durch die Aufzeichnung der UV-Absorption mit einem Spektrophotometer bei 230 nm, 260 nm und 280 nm für lentivirale Produktion verwendet. Hinweis: zeigen DNA-Präparationen A260 / 280 und A260 / 230-Werte größer als 1,8 werden im Allgemeinen als guter Qualität. Unter A260 / 280-Werte können Protein-Kontamination anzuzeigen, während niedrigere A260 / 230-Werte zeigen Veru....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die schematische Darstellung des HE und Blut Induktion aus hPSCs durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren ist in Abbildung 1 ETV2 mit GATA1 oder GATA2 Kombination gezeigt, induziert pan-myeloischer Blutbildung, während ein GATA2, TAL1 +/- LMO2 Kombination induziert vorwiegend erythro-megakaryozytären Hämatopoese. Beide TF-Kombinationen direkt induzierte HE-Zellen, die anschließend in Blutvorläuferzellen mit einem ausgeprägten Spektrums von hämatopoetischen Differenzierung verwandelt. Differenzier.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das oben beschriebene Verfahren zur hämatopoetischen Differenzierung hPSCs durch Überexpression von TFs, stellt ein schnelles und effizientes Konzept für die Erzeugung von HE und myeloiden und erytho-magakaryocytic Progenitoren aus HES und iPSCs, wodurch die Produktion von bis zu 30 Millionen Blutzellen aus Million pluripotenten Stammzellen 10. Diese Methode zeigte konsequente Differenzierung in mehreren hESC und iPSCs Leitungen 10. Während der Differenzierung von ETV2 und GATA2, GATA1 Faktoren sow.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
IS ist Gründungsaktionär und Berater für Cynata.
Danksagungen
Wir danken Matt Raymond für die redaktionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde mit Mitteln des National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221 und P51 RR000167) und der Charlotte Geyer Foundation unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
Table 1. Induktion der Differenzierung von hPSCs mit Transkriptionsfaktoren und Analyse von hämogenem Endothel und Blutzellen.> | |||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviraler Vektor |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviraler Vektor |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviraler Vektor |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviraler Vektor |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviraler Vektor |
| Hexadimethrinbromid (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Kationisches Polymer zur Steigerung der Effizienz von Infektionen |
| Y-27632 (Dihydrochlorid) ROCK-Inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK-Signalweg-Inhibitor Hemmt ROCK |
| StemPro Accutase-Zelldissoziationsreagenz | Life Technologies | A11105-01 | Zelldissoziationsreagenz |
| unvollständiges (wachstumsfaktorfreies) Kulturmedium mTeSR1 Kundenspezifische Formulierung | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serumfreies mTeSR1-Medium ohne bFGF und TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium |
| grade human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium |
| grade CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hämatopoetisch ( FACS) |
| CD43 PE | BD Biowissenschaften | 560199 | Hämatopoetika (FACS) |
| CD73 APC | R& D Systems | FAB5795A | Endothelmarker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hämatopoetika (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Lebend-/Tot-Assay (FACS) |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Zellfixierung |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilisierung |
| FBS | Fisher | Scientific SH3007003 | Fötales Rinderserum |
| Maus Anti-Human-CD43 | BD Biosciences | 551457 | Reiner, primärer Antikörper für die Immunfluoreszenz (IF)-Färbung |
| Kaninchen Anti-Human-VE-Cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primär (IF) |
| Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488-konjugiert | JacksonResearch | 715-486-152 | Sekundär (IF) |
| Anti-Maus Alexa Fluor 594-konjugiert | JacksonResearch | 715-516-150 | Sekundär (IF) |
| DAPI-Nukleinsäure-Färbung | Life Technologies | D1306 | Lebend-/Tot-Assay (IF) |
| Klonogenes Medium MethoCult H4435 Angereicherte | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-Assay |
| Wright Färbelösung | Sigma -Aldrich | 32857 | Färbung von Cytospins |
Table 2. hPSCs culture. | |||
| Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) humane embryonale Stammzellen; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgenfreie induzierte pluripotente Stammzellen | hPSCs sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und sich in Zellen aus drei Keimblättern zu differenzieren |
| Vollständiges serumfreies Medium für die Kultivierung von hPSCs mTeSR1 Medien | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serumfreies Medium mit Wachstumsfaktoren für die feederfreie Kultur von ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix zur Konservierung von humanen ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, Pulver | Life Technologies | 12500-062 | Basalmedium |
| HyClone Dulbecco's PBS Pulver | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, pulver | Life Technologies | 17105-041 | Neutrale Protease, Zelldissoziation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. | |||
| Primer's Name | Vorwärts (Fwd) 5' -->3' | Rückwärtsgang (Rev) 5'-->3' | Beschreibung |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA- | - | EF1a Promotorsequenz |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Codierungsregion |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Codierungsregion |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Codierungsregion |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Codierungsregion |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GG GCA GTA AC | Codierungsregion |
Referenzen
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mo....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
