Abstract
Во время разработки, кроветворные клетки возникают из специализированного подмножества эндотелиальных клеток, кроветворный эндотелия (ОН). Развитие моделирования Его в пробирке имеет важное значение для механистических исследований эндотелия-гемопоэтических перехода и кроветворной спецификации. Здесь мы описываем способ эффективного индукции HE от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) путем сверхэкспрессии различных наборов транскрипционных факторов. Сочетание ETV2 и GATA1 или GATA2 ТФ используется, чтобы вызвать он, пан-миелоидный потенциала, в то время как комбинация GATA2 и TAL1 факторов транскрипции позволяет для производства он, эритроидных и мегакариоцитарной потенциала. Добавление LMO2 к GATA2 и комбинации TAL1 существенно ускоряет дифференциацию и увеличивает эритроидной и мегакариоцитарной клеток производства. Этот метод обеспечивает эффективное и быстрое средство индукции Его из hPSCs и позволяет для наблюдения эндотелиальной-hematopoietiС переходом в культуральной чашке. Протокол включает в себя процедуры hPSCs трансдукции и пост-трансдукции анализ он и предшественники крови.
Introduction
Уникальная способность человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) для самообновлению и дифференцировке в клетки трех зародышевых листков, в том числе крови, сделать их ценный инструмент для механистических исследований кроветворной развития, моделирования болезней крови, скрининг наркотиков, исследования токсичности и развитие клеточной терапии. Потому что образование в крови эмбриона выручки от гемогенного эндотелия (ОН) через эндотелиальной кроветворной перехода 1,2, генерация HE в культурах бы важно изучить молекулярные механизмы, регулирующие эндотелиальные к кроветворной перехода и кроветворной спецификации. Современные методы исследований HE основаны на индукции дифференциации в hematoendothelial агрегатов (EBS) с добавлением гемопоэтических цитокинов 3-5, и совместного культивирования в hPSCs с кроветворения-поддержку стромальных клеток 6,7 или в двумерных культур с внеклеточной матрицы и сytokines 8,9. Эти классические методы дифференциации основаны на введении внешних сигналов, действующих на поверхности клеток и инициирующих каскады молекулярных путей, которые в конечном итоге приводят к активации транскрипции программы руководящей hematoendothelial развития. Таким образом, эффективность hPSCs дифференциации в этих системах зависит от эффективной индукции этих сигналов, сигнальной трансдукции к ядру, и в результате активации специфических транскрипционных регуляторов. Кроме того, изучение HE в обычных культурах дифференцировки требует дополнительного шага изоляции HE клеток с использованием клеток сортировку. Здесь мы опишем простой протокол для прямого индукции он и крови по избыточной экспрессии кроветворных факторов транскрипции. Этот метод позволяет эффективно индукции HE в блюдо и непосредственного наблюдения за эндотелиальной к кроветворной перехода без необходимости выделения HE с использованием процедуры сортировки громоздким клеток.
Формирование он и кровь из человека плюрипотентных стволовых клеток может быть эффективно индуцируется с гиперэкспрессией всего несколько транскрипционных факторов (ТФ). Оптимальное сочетание ТФ, способных индуцировать надежную пан-миелоидный кроветворение из hPSCs включает ETV2 и GATA1 или GATA2. В отличие от этого, сочетание GATA2 и TAL1 вызывает erythromegakaryocytopoiesis 10. Программирование hPSCs через гиперэкспрессией этих факторов отличает hPSCs непосредственно к VE-хама + CD43 - CD73 - клетки, которые HE постепенно приобретают кроветворную фенотип определяется выражением раннего маркера CD43 гемопоэтических 7. Этот метод основан лентивирусов-за непосредственного программирования методом человека плюрипотентных стволовых клеток применяется для генерации он и клеток крови для механистических исследований, исследований эндотелиальных к кроветворной перехода и регуляции транскрипции гемопоэтических развития и спецификации. Хотя CПротокол омер текущего описано получение крови с помощью конститутивной экспрессии трансгенов, аналогичные результаты можно было бы получить с использованием модифицированной мРНК 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Вирусные препараты и фактор транскрипции Комбинации
- Готовят растворы с pSIN-EF1α лентивирусов плазмида экспрессии, содержащий ДНК, кодирующей белок по ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 и LMO2 (Таблица 1).
- Измерение концентрации и чистоты плазмидных составов, используемых для производства лентивирусов путем записи УФ-поглощению с помощью спектрофотометра при 230 нм, 260 нм, и 280 нм. Примечание: Препараты ДНК, демонстрирующие A260 / A260 280 и / 230 значения выше 1,8, как правило, считается хорошим качеством. Нижние A260 / 280 значение может указывать на заражение белка, тогда как более низкие A260 / 230 значения указывают примеси солей или с какой-то растворителе, таком как фенол. Рекомендуемая концентрация плазмида 1-3 мкг / мкл.
- Продукция лентивирусы для каскадов, как описано в ранее опубликованных протоколов 11. Индукция он с пан-миелоидный потенциала требует сотрудничества выражение ETV2 и GATA1 или ETV2 и GATA2.Индукция он с эритро- и мегакариоцитарной потенциала требует GATA2 и TAL1. Добавление LMO2 значительно улучшает выход эритро-мегакариоцитов клеток от hPSCs в присутствии GATA2 и TAL1 10.
2. hPSCs Культура протокол
- Растут плюрипотентных стволовых клеток в труднодоступных колоний с острыми краями 70-80% слияния, прежде чем пересева. Марк и удалить спонтанно дифференцироваться колонии, прежде чем пассажей клеток.
- Развести коммерческую внеклеточного матрикса геля (таблица 2) в соответствии с инструкциями производителя и покрытие 6-луночных планшетах в течение ночи при 4 ° С, или, по крайней мере, одного часа при 37 ° С до использования. Перед пассажей клетки, аспирация матрицу, добавьте 2 мл свежей коммерческой полной culturemedium (таблица 2) и держать пластины в 37 ° С, 5% СО 2 до клетки готовы для посева.
- Прохождение hPSCs
- Аспирате вещества из одной сливной лунку 6-луночного планшета с hPSCs и добавить 1,5 мл подогретого раствора диспаза II (2 мг / мл в DMEM / F12, стерилизуют фильтрацией через 0,22 мкм фильтры). Инкубировать в течение 5-7 мин при температуре 37 ° С, 5% СО 2 до края колоний начинают поднимать с поверхности.
- Решение Аспирируйте диспазу II и тщательно мыть колонии дважды, добавив затем аспирации 2 мл свежей DMEM / F12 среде. Затем, используя 5 мл серологические пипетки стекла, отделить hPSCs с 3 мл свежего коммерческой полной культуральной среде (таблица 2) с помощью пипетки клеточной суспензии вверх и вниз несколько раз.
- Добавить 0,5 мл суспензии клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, содержащего 1,5 мл коммерческой полной культуральной среде (таблица 2). Перемешайте пластину назад и вперед и справа налево несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток при располагающий пластины в инкубатор. Сохранить клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 18-24 ч.
- На следующий день изменение средней на свежий коммерческой полной культуральной среде (таблица 2) и проверьте hPSCs морфологию. Успешные результаты пассажей в небольших, хорошо прикрепленными колонии подпорных HPSC морфологию. hPSCs должны подаваться с 2,5-3 мл freshmedium за хорошо на ежедневной основе, и пассировать каждые 4-5 дней не более чем на 70-80% слияния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если hiPSCs поддерживали на эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), они должны быть переданы в фидерных без условиях и пассировать 2-3 раза до трансдукции для обеспечения эффективного дифференциации.
3. Индукция Hematoendothelial Pprecursors от hPSCs (день 0, трансдукции hPSCs)
- Для подготовки реакционную среду объединить 1,3 мл коммерческой полной среде без сыворотки (см таблицу 2), вирус, Полибрен и Y27632 ROCK ингибитор (таблица 1): добавить 1,3 мкл ингибитора ROCK 10 мм до 1,3 мл среды до конечной ConCentraние 10 мкм, и полибрен до конечной концентрации 6 мкг / мл.
- Добавить соответствующее количество вирусного концентрата (ов) в конечной концентрации 0,5-1,0 MOI (множественность инфекции) каждого вируса на клетку. Хранить реакционную среду на льду или при 4 ° С до тех пор, суспензии отдельных клеток не будет готов.
Примечание: То же самое количество MOI для каждого вируса в GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, и смеси GATA2 / TAL1 / реакции LMO2 является оптимальным для индукции дифференцировки. Тем не менее, в ETV2 / GATA2 трансдуцированные культуры удвоения МВД для GATA2, по отношению к ETV2, повышает дифференциацию. Таким образом, для этих культур, отношение 1: 2 по МВД ETV2 и 1 МВД GATA2 рекомендуется (например, если вирусные концентрат оценивается приблизительно 6,8 х 10 7 частиц / мл, добавляют 10 мкл ETV2 и 20 мкл GATA2 вирусных концентратов 0,68 × 10 6 клеток на одной реакции ETV2 / GATA2 в 35 мм лунку 6-луночного планшета).
- Добавить соответствующее количество вирусного концентрата (ов) в конечной концентрации 0,5-1,0 MOI (множественность инфекции) каждого вируса на клетку. Хранить реакционную среду на льду или при 4 ° С до тех пор, суспензии отдельных клеток не будет готов.
- Подготовка hPSCs в одном SUSP клетокension.
- Растут hPSCs в фидерных без условиях, как описано в разделе 2. На 4-й день после последнего прохода, наблюдать плотность клеток и морфологию под инвертированным микроскопом. hPSCs должны расти в плотных колониях с острыми краями, без спонтанной дифференцировки и достигать ~ 60-70% слияния в день трансдукции.
- Аспирируйте среднего, добавить 1,5-2 мл коммерческого реагента для диссоциации клеток (таблица 1) на лунку и инкубируют при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 5-7 мин.
- Сбор клеток в равных объемах коммерческой полной среде (таблица 2) с 10 мкМ ингибитора ROCK, подсчет клеток и определить жизнеспособность. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин и затем вновь суспендируют клетки в полной среде коммерческой с 10 мкМ ингибитора ROCK до концентрации 3.4-5 х 10 6 клеток на мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток имеет решающее значение для успешного вирусного преобразования и последующей дифференциации.Как правило, жизнеспособность клеток, прежде чем трансдукции должна превышать 90%.
- Добавить 200 мкл клеточной суспензии, содержащие 0.68-1 x10 6 клеток, в 1,3 мл реакционной среде, приготовленной в разделе 3.1.
- Аспирируйте матричного раствора, из ночной покрытием 6-луночного планшета, полученного в 2.2., Передача реакционной смеси до одну лунку 6-луночного планшета и распространять клетки равномерно. Инкубируют при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 24 часов. Через 24 часа, по крайней мере 80% клеток должны быть прикреплены к матрице.
4. Индукция Hematoendothelial прекурсоров из hPSCs (День 1-7)
- 24 ч после трансдукции, удалить вирус-среде, содержащей и мыть прикрепленные клетки с коммерческой неполным культивирования клеток среды (см таблицу 1), а затем добавить 3 мл на лунку коммерческой неполным культивирования клеток среде, содержащей гемопоэтические цитокины: SCF 100 нг / мл, ТПО 50 нг / мл, оФРФ 20 нг / мл (в дальнейшем именуемые 3F-среде),
- Заменить общую среду со свежим 3F-среды в дни 2, 3 и 4 день, чтобы удалить мертвые клетки и мусор. Через 4 дня, когда плавающие кроветворные клетки возникают, заменить половина 3F-среднего через день, сохраняя при этом общий объем в 4 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: pSIN-EF1α лентивирусный плазмиды экспрессии включают ген устойчивости к пуромицину тем самым позволяя позитивной селекции трансдуцированных клеток. 1-мкг / мл пуромицин может быть добавлен к среде в течение первых 1-2 суток дифференцировки для устранения любых остаточных недифференцированных hPSCs. - Соблюдайте морфологии клеток на 4-й день под инвертированным микроскопом: жесткие скопления клеток с типичной морфологией эндотелиальных начинают появляться (2А, 3А). Круглые клетки крови появляется из 5 день 7 день дифференцировки, в то время как в некоторых районах может сохранить hPSCs морфологию. Анализ он и кроветворной дифференциации, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное hematoendothelial отличаетсятельная приводит к получению клеток крови, которые появляются в рефрактильные круглые клетки слабо прикреплены к основных плоских эндотелиальных клеток. Эти клетки активно размножаются образуя небольшие агрегаты, и в конечном итоге снять и поплавок (2А и 3А). Текущие кровяные клетки могут быть визуально отличается от мертвых и умирающих клеток в зависимости от их способности отражать свет и расширения в условиях культивирования.
5. Анализ гемогенного эндотелия (ОН) Стадия дифференциации.
- Обнаружение образование он сквозь дней 3 и 4 дифференциации микроскопическим наблюдением клеток с эндотелиальными морфологии. Там нет плавающие клетки крови в культуре на данном этапе дифференциации. Наличие он может быть подтвержден иммунофлуоресцентным окрашивания и проточной цитометрии анализ с использованием VE-кадгерин, CD73, CD226 и CD43 антитела.
- Для оценки образования HE с помощью проточной цитометрии использовать анализ клеток на 3-й деньи 4-й день от одного эксперимента. Собирают клетки путем инкубации культур с коммерческой диссоциации клеток реагентом (таблица 1) в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С, 5% СО 2, а затем использовать до 1 × 10 5 клеток на реакцию окрашивания (проточной цитометрии процедуры окрашивания, описанной в 12).
ПРИМЕЧАНИЕ: VE-кадгерин + ОН клетки приобретают экспрессию раннего маркера гемопоэтических CD226, но не хватает экспрессии CD73 и CD43 6. В отличие от этого, не-HE клетки CD73 выразить (цифры 2B, 3B).
- Для оценки образования HE с помощью проточной цитометрии использовать анализ клеток на 3-й деньи 4-й день от одного эксперимента. Собирают клетки путем инкубации культур с коммерческой диссоциации клеток реагентом (таблица 1) в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С, 5% СО 2, а затем использовать до 1 × 10 5 клеток на реакцию окрашивания (проточной цитометрии процедуры окрашивания, описанной в 12).
- Иммунофлуоресценции окрашивание HPSC-производного он.
- Промыть прилагаемый монослой клеток фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем исправить клеток в 4% параформальдегид от 30 до 60 мин при комнатной температуре.
- Промывают клетки снова PBS и затем проницаемыми использованием 0,1% Тритона Х-100 в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Вымойте клеток в PBS два-три раза, а затем инкубировать вблокирующем буфере, состоящий из PBS с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в течение от 30 до 120 мин.
- Подготовьте красящим раствором, содержащим как первичные антитела (1: 1,000 разведение) мышиного антитела против человеческого CD43 и кроличьим антителом против человека VE-кадгерин в PBS с 5% FBS, (Таблица 1).
- Аспирируйте блокирующий буфер из клеток и добавить 1 мл на лунку окрашивающего буфера с добавлением первичных антител; инкубировать 3 часа при комнатной температуре, или в течение ночи при 4 ° C.
- Промыть клетки три раза, добавив 2 мл PBS с 5% FBS.
- Подготовьте второй буфер окрашивания, содержащий вторичные антитела 1: 500 разбавление в PBS с 5% FBS: осла против кролика, конъюгированного с зеленым флуоресцентным красителем, и анти-мышь, конъюгированного с красным флуоресцентным красителем (Таблица 1). Добавить 1 мл на лунку вторичного буфера окрашивания и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промыть три раза PBS без сыворотки. Пятно клетки с 300 нМ рабочего раствора DAPI в дН2 О в течение 10-15 мин.
- Вымойте клеток с PBS в два раза и добавить 2-3 мл PBS в хорошо окрашенных клеток. Соблюдайте флуоресценции с зелеными, красными и синими микроскопа фильтров.
6. Анализ индуцированных гемопоэтических прекурсоров
- Поддержание дифференциации культур до плавающие клетки не расширить значительно, до 10-14 дней, меняя половину 3F-среде, как описано в 3.1, раз в два дня.
- Разбить и собирать дифференциации монослоев клеток при обработке клеток с коммерческой диссоциации клеток реагентом (см таблицу 1) в течение 5-10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
- Выполните проточной цитометрии с использованием анти-VE-кадгерина, CD43 и CD45 антитела, чтобы оценить кроветворение в культурах 12. Обратите внимание, что большая часть клеток, вплоть до 40% от ETV2 и GATA2 трансдуцированных клеток, со-экспрессов VE-CAD и CD43. Следующие антитела могут быть использованы для определения специфических клеточных клонов следующий адресXpansion или дифференциация индуцированных клеток-предшественников крови: CD235a (эритроидных клеток), CD41a (мегакариоцитарной), CD32 (все виды клеток миелоидного), CD66b (нейтрофилы) и CD163 (макрофаги).
- Выполните ХФУ-анализа с использованием коммерческого клоногенных среду (таблица 1) в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Трансфер 1-2 х 10 4 клеток в 3 мл коммерческой клоногенного среды (таблица 3), чтобы оценить количество колониеобразующих клеток и типов гемопоэтических колоний. Оптимальная плотность посева позволяет для идентификации и изоляции отдельных колоний, которые растут отдельно друг от друга и не пересекаются. Посев плотность может варьироваться от экспериментов в зависимости от эффективности дифференцировки, но не должна превышать 1 х 10 4 клеток на 1 мл среды коммерческой образующих клоны.
- Смешайте клетки в коммерческой среде клоногенного нежным встряхивания и передать 3 мл суспензии двух 35 мм ультра-низкие блюд креплениядля CFC анализа 1,5 мл суспензии в каждую чашку. Распределить равномерно среду и инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 14 дней. Избегайте нарушая блюда; наблюдать образование колоний на 7 день и 10 день анализа.
- Выявление и подсчет колоний кроветворных в соответствии с их морфологии на 14 день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Принципиальная схема он и индукции крови из hPSCs по избыточной экспрессии транскрипционных факторов показана на рис 1. ETV2 с GATA1 или GATA2 комбинации вызывает пан-миелоидный кроветворение, в то время как GATA2, TAL1 +/- LMO2 сочетание вызывает преимущественно эритро-мегакариоцитарной кроветворение. Обе комбинации TF непосредственно индуцированных клеток HE, которые впоследствии превращаются в предшественников крови с отчетливым спектра гемопоэтических дифференциации. Дифференциация hPSCs из плюрипотентных государства в крови производству Его занимает в среднем 4 дня. Круглые клетки крови первого появления на 5-й день дифференциации. Впоследствии, многочисленные плавучие клетки крови появляются и расширить в культурах. Чтобы максимизировать количество плавающих клеток крови, после трансдукции культуры могут быть продлен до 10-14 дней. Желаемый линия клеток может быть расширен в странах с низким прилипшие условиях с соответствующей комбинации гемопоэтических цитокинов. Рисунок 2 DEMдемонстрирует существующую индукции крови из hPSCs использованием ETV2 и GATA1 или GATA2 ТФ. После трансдукции ETV2 и GATA2, клетки приобретают типичную морфологию эндотелия по 4-й день дифференциации, и в конечном итоге превращаются в круглые клетки крови (6-8 день дифференцировки (2А). Cells, собранные в дни 3-4 дифференциации показать типичный VE-кадгерин + CD226 + CD73 -. ОН фенотип (Фигура 2В, 3В) К 7 дню дифференциации более 50% от VE-кадгерин + клетки приобретают гемопоэтических CD43 + фенотип (фиг.2с) CFC-анализы GATA2 / ETV2. индуцированного клетки показывают, что колонии состоят из высокой пролиферативной потенциала (ГЭС) ХФУ, эритроидных (Е) ХФУ, макрофаги (М) ХФУ, и гранулоциты (Г) ХФУ (рис 2E). hematoendothelial дифференциация в hPSCs следующие гиперэкспрессией GATA2 и в одиночку или с TAL1LMO2 показано на рисунке 3. Его этапе лучше определены в культурах с GATA2 и TAL1. Добавление LMO2 ускоряет дифференцировку и заметно стягивает HE этап. GATA2 и TAL1 в одиночку или с LMO2 сочетание демонстрирует дифференцировку и созревание клеток-предшественников крови в основном эритроидных и мегакариоцитарной клетки Рисунок 3D и 3E. Рисунок 4 показывает оптимизацию эффективности трансдукции в H1 ЭСК с использованием GFP лентивирус (A) и клеточной смерти и эффективности дифференциации в культуры трансдуцировали GATA2 / TAL1 / LMO2 на высокой и низкой МВД.
Рисунок 1:. Принципиальная схема протокола для индукции кроветворных эндотелиальных клеток и кровеносных через принудительного выражения ТФ мультфильм изложены основные экспериментальные шаги и сроки. После подготовки суспензии отдельных клеток, которые hPSCs трансдуцированных TFс и высевали на матрице в полной коммерческой бессывороточной среде. На следующий день, среду заменяют фактора роста свободного коммерческого среде с добавлением оФРФ, ТПО и SCF (3F среды). После 3-4 дней культуры, он формируется. Впоследствии он подвергается эндотелиальной в кроветворной перехода с образованием множественных кровяных клеток.
Рисунок 2:. ETV2 / GATA2-индуцированной дифференциации hPSCs (А) фазового контраста изображения ETV2 / GATA2-индуцированной дифференциации в ЭСК H1 в дни 2, 4, 6 и 8 после трансдукции; Масштаб бар, 100 мкм. (B), проточной цитометрии анализ ETV2 / GATA2-индуцированной клеток, подвергающихся эндотелия в кроветворной перехода на 3-й день дифференциации: VE-кадгерин + ОН клетки выразить CD226 и лишены экспрессии CD73. Небольшой процент эндотелиальных клеток CD73 выразить (не-HE). (С) проточной цитометриинализ из ETV2 / GATA1- и ETV2 / GATA2-индуцированной H1 hPSCs на 7 день после трансдукции. (D) проточной цитометрии анализ ETV2 / GATA2-индуцированной кроветворных клеток расширенных в среде с добавлением FBS и SCF, IL-6, ИЛ-3, GM-CSF, G-CSF и ЕРО в течение 14 дней. (Е) Типы гемопоэтических колоний, образованных из ETV2 / GATA2 трансдуцированных клеток в CFC-анализе и соответствующих Райт-окрашенных cytospins представляющих эритроидных (E), макрофаги (M), гранулоциты (GR) и высокий пролиферативный потенциал колонии (ГЭС). Масштабные бары для CFC-анализе, 250 мкм, для cytospins, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3:. GATA2 / TAL1 и GATA2 / TAL1 / LMO2-индуцированной дифференциации hPSCs (A) фазового контраста изображения GATA2 / TAL1 / LMO2индуцированной дифференциации в ЭСК H1 в дни 2, 4, 6 и 8; Масштаб бар, 100 мкм. (Б) проточной цитометрии анализ GATA2 / TAL1-индуцированных клеток, подвергающихся эндотелиальные чтобы кроветворной перехода на 3-й день дифференциации: VE-кадгерина + клетки приобретают экспрессию маркера Его CD226. Небольшой процент эндотелиальных клеток CD73 выразить (не-HE). (С) Иммунофлуоресцентное окрашивание GATA2 / TAL1-индуцированной дифференциации в ЭСК H1, 5 день; VE-кадгерин + клеток (зеленые) приобретают выражение кроветворной маркера CD43 (красный). (D) проточной цитометрии анализ GATA2 / TAL1 / LMO2-индуцированной гемопоэтические культуры в суспензии на 14 день после трансдукции следующие расширения в среде без сыворотки с добавлением SCF, ТРО, ЕПВ и оФРФ; (Е) Типы гемопоэтических колоний, образовавшихся в CFC-анализе с GATA2 / TAL1 / LMO2 дифференцированного cellsand соответствующей Райт-окрашенных cytospins представляющих эритроидных (E), макрофаги (M), и Megakaryocytes (MK). Масштабные бары для CFC-анализе, 250 мкм, для cytospins, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Оптимизация процедуры лентивирусный трансдукции (А) трансдукция ЭСК H1 с различной МВД GFP лентивирусов.. (Б) Жизнеспособность клеток и эффективность дифференциации в культурах, трансдуцированных GATA2 / TAL1 / LMO2 при низкой (1 для каждого вируса) и высокий (2 для каждого вируса) МВД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный выше метод кроветворной дифференциации hPSCs по избыточной экспрессии ТФ, представляет собой быстрое и эффективный подход для генерации он и миелоидных и erytho-magakaryocytic предшественников из ЭСК и ИПСК, тем самым позволяя производить до 30 миллионов клеток крови из один миллион плюрипотентные стволовые клетки 10. Этот метод выставлены последовательную дифференциацию в нескольких чЭСК и ИПСК линий 10. Во время дифференциации по ETV2 и GATA2 факторы GATA1 а также GATA2 и TAL1 факторы, клетки образуют крови производить эндотелий, он и пройти эндотелий в кроветворной перехода. Формирование он, как правило, наблюдается между днями 3 и 4 дифференциации. Добавление LMO2, транскрипционный ко-фактор TAL1, в GATA2 и комбинации TAL1, значительно увеличили надежность дифференциации, в то время как этап стал заметно сократился.
Успех режиссера отличительноение hPSCs по транскрипционных факторов, главным образом, зависит от (I) с эффективной доставки нуклеиновых кислот в клетки, (II) жизнеспособность клеток следующие генетические манипуляции, и (III) эффективное перевода экзогенных транскриптов внутри клетки.
Одним из ключевых шагов в рамках описанного способа является производство эффективных лентивирусных единиц, что зависит от точного буфера рН для НЕК 293T трансфекции клеток, и отсутствие эндотоксинов на всех этапах производства и вирусных трансдукции экспериментов. Целостность всех конструкций, в том числе упаковки и оболочки плазмид, должны быть проверены, если нет признаков вирусного производства в НЕК 293Т не наблюдается 13.
Конструкция протокол дифференцировки с помощью комбинации транскрипционных факторов, следует учитывать несколько переменных. Высокая эффективность вирусной трансдукции имеет важное значение для успешного дифференциации. Так эффективность трансдукции зависит от используемого метода для вирусапроизводство и очистка, оптимизация HPSC трансдукции с использованием GFP-лентивирусный вектор рекомендуется (рис 4а). Вирусный интеграция следующие трансдукции должны быть проверены с использованием геномной ПЦР с трансгенными-специфических праймеров (таблица 3). Дифференцирование оптимизации должен также включать регулировку лентивирусов концентрации в реакционной смеси. Относительно низкое количество вируса, МВД 0,5-1, способен индуцировать дифференциацию HPSC. В то время как выше MOI повышает эффективность дифференциации, но и повышает гибель клеток (фиг.4В). Дополнительный этап оптимизации может включать в себя установку масштаба MOI для каждого вируса в реакционной смеси. В GATA2 / ETV2 трансдуцировали культур, удвоение МВД для GATA2, по отношению к ETV2, повышает эффективность дифференциации. Для GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 и GATA2 / TAL1 / LMO2 равно МВД для каждого вируса является оптимальным.
После трансдукции с ТФ, подавляющее большинство клеток UnderwЛОР angiohematopoietic дифференциации в то время как лишь очень немногие клетки сохранили морфологию недифференцированные. Так pSIN-EF1α лентивирусов векторов включают устойчивость к антибиотикам, лечение культур с пуромицин может быть использован для устранения остаточных недифференцированных клеток.
Формирование клеток с характерными эндотелиальных морфологии и последующих круглых клеток крови, указывает на успешное дифференциации. В среднем, сочетание GATA2 / ETV2 производит 40-50% CD43 + VE-кадгерин клеток крови от +/- день 9-10 дифференциации с до 30% клеток, оставшихся VE-кадгерин + CD43 -. GATA1 / Комбинация ETV2 индуцирует экспрессию CD43 быстрее и генерирует большее количество CD43 + клеток по сравнению с комбинацией GATA2 / ETV2. В этих культурах, большинство CD43 + клеток coexpress VE-кадгерин. В культурах, трансдуцированных GATA2 / TAL1, количество CD43 + клеток, как правило, достигает 40-50%. Добавление LMO2 в GATA2 / TAL1 существенно ускоряет и усиливает выработку крови, и заметно стягивает эндотелия этап развития.
Колониеобразующих анализы должны быть использованы для определения частоты и тип индуцированных гематопоэтических предшественников. Природа колониеобразующих клеток может быть подтверждено путем подготовки Райт-окрашенных cytospins из отдельных колоний. hPSCs трансдуцированные ETV2 и GATA2 производить в основном большие (больше, чем 0,5 мм в диаметре) высокие пролиферативный потенциал (ГЭС) миелоидных колоний, состоящих из незрелых гранулоцитарного и моноцитов, с некоторыми зрелых миелоидных клеток и иногда эритроидных и мегакариоцитарных клеток. В среднем более чем на 80% ХФУ в GATA2 / ETV2 трансдуцированные культуры являются миелоидной ГЭС. Кроме того, эти культуры генерировать эритроидных и макрофагов колонии (рис 2E), которые, как правило, содержат меньше, чем 20% от общего объема ХФУ. HPSC трансдукции с ETV2 и GATA1 значительно увеличивает тысе часть CFC-E, чтобы до 50%. TAL1 и GATA2 трансдуцированные культуры производства в основном эритроидных (более 80% от общего ХФУ) и мегакариоцитарных колоний (более 10% от общего ХФУ) с очень немногих колоний макрофагов (менее 5% от общего ХФУ). Добавление LMO2 к TAL1 и комбинации GATA2 значительно увеличивает частоту колониеобразующих клеток с эритро-мегакариоцитов потенциал 10. Характер CFC активности после трансдукции с описанными комбинациями транскрипционных факторов согласуется между различными ЭСК и hiPSC линий 10.
Таким образом, лентивирусов-опосредованной избыточная экспрессия в hPSCs является относительно быстрым и эффективным инструментом для индукции он и крови с использованием TFS. Эта система также может быть использован для оценки дифференциации потенциала других ТФ и идентифицировать те, которые необходимы для эндотелиальных и гемопоэтических спецификации. Тем не менее, текущий протокол имеет ограниченное применение для исследований эксtracellular сигнализации участвуют в индукции он, как он использует ТФ в обход опосредованного рецептором передачу сигнала поверхности. Хотя в настоящее время протокол описывает производство крови с помощью конститутивной экспрессии трансгена, аналогичные результаты могут быть получены с использованием модифицированных мРНК 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ЕСТЬ является одним из основателей акционером и консультантом по Cynata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
|||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
|||
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
|||
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
