Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen digitalen Endpunkt-Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten (analogen) Auslesung. Wir messen die Massenfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays mit einem Standard-qPCR-Gerät anstelle von speziellen Instrumenten und bestätigen unsere Ergebnisse durch Mikroskopie.

Zusammenfassung

Digitale Assays sind leistungsfähige Methoden, die Detektion von seltenen Zellen und Zählung von einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digitale Assays noch nicht routinemäßig angewendet wird, aufgrund der Kosten und spezielle Ausstattung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden. Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen der digitalen Tröpfchentests unter Verwendung einer herkömmlichen Echtzeit-PCR-Instrument, um Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen.

Wir charakterisieren die Leistung des Schüttauslese Assays unter Verwendung synthetischer Gemische Tröpfchen und Tröpfchen digitalen Multiple Displacement Amplifikation (MDA) Assay. Quantitative MDA besonders profitiert von einer digitalen Reaktions Format, aber unsere neue Verfahren gilt für alle digitalen Assay. Für etablierte digitale Assay-Protokolle wie digitale PCR dient dieses Verfahren zu beschleunigen und zu vereinfachen Assay Auslesen.

Unsere Großauslesemethode bringt die Vorteile der partitioned Assays ohne die Notwendigkeit für spezielle Auslese Instrumentierung. Die wichtigsten Einschränkungen des Schüttauslesemethode verglichen mit Tropfenzählen Plattformen und die Notwendigkeit für eine Standardprobe reduzierten dynamischen Bereich, wobei die Anforderungen an diese Norm sind weniger anspruchsvoll als für einen herkömmlichen Echtzeit-Experiments. Quantitative Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) wird verwendet, um für Kontaminanten in WGA Reaktionen testen und ist das empfindlichste Art und Weise, um die Anwesenheit von DNA-Fragmenten mit unbekannten Sequenzen zu erkennen, was das Verfahren sehr vielversprechend in unterschiedlichsten Anwendungsbereichen einschließlich der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Astrobiologie.

Einleitung

Digitale Assays zur Nukleinsäurequantifizierung (digital PCR) ^{1-4 und} Basis Ordnung (Sequenzierung) stark beeinflussen die Lebenswissenschaften und der Medizin. Digitale Assays stellen die Quantifizierung molekularer zählt auf einer absoluten Skala (nicht relativ zu einer Kontrolle) und bietet hohe Empfindlichkeit und ermöglicht einfache Vergleiche zwischen den Experimenten und entscheidend, so dass der Bau von großen Datenbanken mit vergleichbaren Daten ⁵ (Tabelle 1).

Im Laufe der letzten 15 Jahre, Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) entstanden neben PCR als allgemeines Instrument für die Nuklei....

Protokoll

Anmerkung: Die Herstellung von Mikrofluid-Vorrichtung ist nicht notwendig, diesen Assay als Tröpfchen für dieses Protokoll mit vorhandenen kommerziellen Tropfenträgern ^23,29 gebildet werden.

1. Stellen Sie die Tröpfchenbildungs ​​Mikrofluidikvorrichtung

1. Vorbereitung Vorlagenform für die Kanäle mit der SU-8 Master Fabrication Protokoll dargelegt zuvor ^31, aber mit einem Tröpfchengenerator Maskenmuster ^32.
2. Fertigen Geräte in PDMS mit den Techniken der Softlithographie ^32,33.

2. Bereiten Sie Reaction Mix für Schütt Droplet Anzeige

Ergebnisse

Während herkömmliche Bulk / Echtzeit-Auslesen kann sowohl für quantitative PCR und quantitative Assays WGA (Figur 1) verwendet werden, digital quantitative Assays bieten Vorteile (Tabelle 1). In dem beschriebenen Verfahren ausgelesen wir digitalen Assays in Mikrotröpfchen-Format mit einer einfachen Schüttendpunktmessung (Abbildung 2). Während dieses Verfahren breit anwendbar, konzentrieren wir uns auf quantitative WGA (MDA), da dieses Verfahren stellt besondere Herausfo.......

Diskussion

Digital Assays sind leistungsfähige Methoden, die den Nachweis von seltenen Zellen und Zählen der einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digital Assays sind noch nicht routinemäßig in analytischen Labors zu den Kosten von Spezialausrüstung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden angewendet, die teilweise. Hier beschreiben wir einen Endpunkt digitalen Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten analogen Auslese Verwendung eines Standard quantitative Echtzeit-PCR-Maschine. Die.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Evagreen Farbstoff	Biotium	31000
Rinderserumalbumin	New England Biotechnologies	B9000S
Phi29 DNA-Polymerase-Reaktionspuffer	New England Biotechnologies	B0269S	Periodisch vortexen, bis sich das Aggregat auflöst
Lambda DNA	New England Biotechnologies	N3011S	Auf 50 oC erhitzen und auf Eis vor der Verdünnung
Randomisierte MDA-Oligos	Integrated DNA Technologies		5'-NNNNN*N-3'PCR-Primer
	Integrated DNA Technologies		5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' und 5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'
Ultrareines Nuklease-freies Wasser	Life Technologies	10977-015	Gebrauch 30 Minuten lang mit Stratalinker 2400 UV-behandelt (optional)
ROX-Referenzfarbstoff	Life Technologies	12223-012
PCR-Verschlüsse für optische Streifen Life	Technologies	4323032
PCR-Röhrchen	Agilent Technologies	401428
dNTP (je 25 Mikromolaren)	Agilent Technologies	200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR-System	Agilent Technologies	401403
Barrier Pipettenspitzen	VWR	89003-046
Bio-rad Öl für evagreen	Bio-rad	186-4005
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893-100RXN

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