Methodenartikel

Visuell evozierten Potential-Aufnahme in einem Rattenmodell für Experimentelle Optic Nerve Demyelinisierung

DOI:

10.3791/52934

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29. Juli 2015

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1Department of Ophthalmology, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 2Save Sight Institute, The University of Sydney

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Fokale Demyelinisierung wird im Sehnerv durch Lysolecithin-Mikroinjektion induziert. Visuell evozierte Potentiale werden über Schädelelektroden aufgezeichnet, die über den visuellen Kortex implantiert werden, um die Signalleitung entlang der Sehbahn in vivo zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Verfahren, die der Elektrodenimplantation und der Mikroinjektion des Sehnervs zugrunde liegen.

Zusammenfassung

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Die Aufzeichnung des visuell evozierten Potentials (VEP) wird in der klinischen Praxis häufig verwendet, um den Schweregrad einer Optikusneuritis in ihrer akuten Phase zu beurteilen und den Krankheitsverlauf in der Nachbeobachtungszeit zu überwachen. Veränderungen der VEP-Parameter korrelieren eng mit einer pathologischen Schädigung des Sehnervs. Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung des Nagetiermodells der Mikroinjektion des Sehnervs, bei dem eine partielle Demyelinisierungsläsion im Sehnerv erzeugt wird. VEP-Aufzeichnungstechniken werden ebenfalls diskutiert. Mit Hilfe von schädelimplantierten Elektroden sind wir in der Lage, reproduzierbare VEP-Spuren innerhalb und zwischen den Sitzungen zu erfassen. VEPs können an einzelnen Tieren über einen längeren Zeitraum aufgezeichnet werden, um die funktionellen Veränderungen des Sehnervs in Längsrichtung zu beurteilen. Das Demyelinisierungsmodell des Sehnervs bietet in Verbindung mit dem VEP-Aufzeichnungsprotokoll ein Werkzeug zur Untersuchung der Krankheitsprozesse, die mit Demyelinisierung und Remyelinisierung verbunden sind, und kann möglicherweise zur Bewertung der Auswirkungen neuer remyelinisierender Medikamente oder neuroprotektiver Therapien eingesetzt werden.

Einleitung

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Optikusneuritis ist eine der häufigsten Formen der Optikusneuropathie, die zum vollständigen oder teilweisen Verlust des Sehvermögens führt1. Histologisch ist sie gekennzeichnet durch entzündliche Demyelinisierung, axonalen Verlust von retinalen Ganglienzellen und unterschiedlich starke Remyelinisierung im Sehnerv2. Die Optikusneuritis ist in der Regel der manifeste Beginn der Multiplen Sklerose. Das visuell evozierte Potential (VEP) ist ein nicht-invasives Werkzeug zur Untersuchung der Funktion des visuellen Systems. Sie spiegelt die postretinale Funktion von der Netzhaut bis zum primären visuellen Kortex wider und ist bei vielen Erkrankungen des Sehnervs betroffen3. Der VEP wurde überwiegend bei Patienten mit Optikusneuritis eingesetzt, um die Integrität der Sehbahnzu beurteilen 4.

Die Latenz von VEP, die die Geschwindigkeit der Signalleitung entlang der Sehbahn widerspiegelt, wird als genaues Maß für das Ausmaß der myelinassoziierten Veränderungen im Sehnerv angesehen5; während angenommen wird, dass die Amplitude von VEP eng mit der axonalen Schädigung der retinalen Ganglienzellen (RGC) korreliert6. Diese Hypothese wurde unter Verwendung des Rattenmodells der Lysolecithin-induzierten Demyelinisierung des Sehnervs ziemlich gut etabliert5.

Hier erläutern wir ein umfassendes Protokoll der Mikroinjektionstechnik des Sehnervs bei Nagetieren, das die durch chirurgische Manipulation verursachte Schädigung des Nervs an sich sowie an den angrenzenden Geweben wie extraokulären Muskeln und Blutgefäßen minimieren kann. Auch die Schädelelektrodenimplantation wurde für die VEP-Aufzeichnung bei Tieren beschrieben7. Die VEP-Aufzeichnungen können über einen längeren Zeitraum wiederholt an Tieren durchgeführt werden, um Veränderungen im Zusammenhang mit Demyelinisierung/Remyelinisierung sowie Auswirkungen auf die axonale Integrität des Sehnervs zu beurteilen.

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Protokoll

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Ethics Hinweise: Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem australischen Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken und den Richtlinien der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und wurden durch die genehmigte Tierethikkommission der Macquarie University.

1. VEP Elektrodenimplantation

  1. Betäuben das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (75 mg / kg) und Medetomidin (0,5 mg / kg).
    Hinweis: Nach der Einleitung der Narkose, beachten Sie die Entzugs Reflexe (Pinch-Test, der Hornhaut und der Augenlidreflex, etc.) und ihre Abwesenheit als Indikation zur Operation zu beginnen. Tiere ständig in der gesamten Operation zu überwachen und zu verwalten zusätzliche Anästhetika (10% vom Ausgangs Ketamin Dosis pro top-up), wenn die Reflexe vorhanden sind. Adulte Ratten (> 12 Wochen) werden in den Experimenten verwendet.
  2. Rasur die Haut des OP-Bereich.Legen Sie das Tier auf eine wärmende Unterlage (37 ° C), um die Körpertemperatur während der Operation aufrecht zu erhalten. Bereiten Sie die Haut durch topische Anwendung von PVP-Jod. Bewerben Chirurgisches Tuch. Gelten topische Augensalbe zur Hornhaut Trockenheit unter Vollnarkose zu vermeiden. Pflegen Keimfreiheit, indem sie sterile Instrumente.
  3. Einen Längshautschnitt auf der Mittellinie der Kopfhaut. Deaktivieren Sie das Bindegewebe um gute Belichtung des Schädels zu erreichen.
  4. Vorsichtig bohren kleine Bohrlöcher manuell mit einem Mikrohandbohrmaschine auf 7 mm hinter dem Bregma und 3 mm lateral der Mittellinie.
  5. Implantatschraube Elektroden durch den Schädel in die Rinde (Bereich 17), Durchdringen der Kortikalis zu einer Tiefe von etwa 0,5 mm. Implantat eine Referenzelektrode Schraube auf der Mittellinie 3 mm rostral des Bregma. Bewerben Zahnzement zu umhüllen und fixieren Sie die Schrauben (nicht immer erforderlich).
  6. Naht der Haut des Kopfes, zu verwalten antibiotische Salbe auf die Haut und lassen Sie das Tier recover aus der Narkose auf einer Erwärmung pad.
    Hinweis: Alternativ können Elektroden können dem Tageslicht ausgesetzt werden, so dass die Haut muss nicht in jeder Aufzeichnungs wieder geöffnet werden. Unmittelbar nach Beendigung der Operation, aber vor dem Aufwachraum, verwalten ein nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAID) (wenn nicht vor der Operation verabreicht wird) oder ein Opioid-Analgetikum. Überwachen Sie die Tiere ständig bis zur vollständigen Wiederherstellung nach Betäubung und ambulant voll.
  7. Lassen Sie mindestens 1 Woche für die Tiere von der Operation vor der VEP Aufnahme erholen.

2. Optic Nerve Injection

  1. Betäuben das Tier, bereiten die Haut und wenden drapieren wie oben beschrieben (1.1 und 1.2).
  2. Einen 1- bis 1,5-cm-Einschnitt in der Haut oberhalb der Umlaufbahn von einer zufällig ausgewählten Auge. Öffnen Sie das Unterhautgewebe, um die Augenhöhle mit feinen Iris Schere zu erreichen. Öffnen Sie die Bindehaut und vorderen Tenon-Kapsel unter dem Operationsmikroskop.
  3. Ziehen Sie die äußeren AugenMuskeln und intraobital Tränendrüsen auf ca. 3 mm Länge des Sehnervs freizulegen. Öffnen Sie die Dura und Arachnoidea Angelegenheit Schichten um den Sehnerv in Längsrichtung mit einer ophthalmischen Klinge.
  4. Legen Sie die Glaspipette in den Sehnerv in einem Abstand von 2 mm hinter der ganzen Welt. Die Glas-Mikropipette wird in eine Hamilton-Spritze befestigt ist.
  5. Injizieren 1% Lysolecithin (0,4-1,0 ul, mit 0,02% Evans Blau, das keine Auswirkungen auf die Myelinisierung) langsam in das Nerven ungefähr über einen Zeitraum von 30 sec.
  6. Naht der Hautschnitt. Gelten antibiotische Salbe um Infektionen zu vermeiden. Partneraugen können als interne Kontrollen für die Elektrophysiologie Aufnahmen serviert.
  7. Legen Sie die Tiere auf einer Erwärmung pad sich von der Anästhesie zu erholen.

3. VEP Recording

  1. Betäuben das Tier und bereiten die Haut wie 1.1 und 1.2.
    Hinweis: Niederdosis Narkosemittel kann für elektrophysiologische reco verwendet werdenrding (Ketamin 40 mg / kg und Medetomidin 0,25 mg / kg).
  2. Legen Sie die Ratte in einem dunklen Raum und lassen Sie ihn in die Dunkelheit für 5 anzupassen - 30 min. In einigen Fällen können Ratten jeweils dunkel angepasst O / N für scotopic oder Licht zur photopischen VEP Aufnahmen 8 angepasst werden.
  3. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur auf 37 ± 0,5 ° C durch die homoeothermic Tuchsystem mit einer rektalen Temperaturfühler.
  4. Erweitern die Schüler mit 1,0% Tropicamid Augentropfen. Öffnen Sie die Haut über den Schädel, um auf die vorge platziert in situ Schraube Elektroden.
  5. Schließen Sie die Schraube über der kontralateralen visuellen Kortex des stimulierten Auge und dem Referenzschraube an den Verstärker. Legen Sie eine Nadelelektrode in den Schwanz als die Erde. Messen Sie und pflegen die Elektrodenimpedanz unter 5 kOhm.
  6. Legen Sie eine Mini-Ganzfeld-Stimulator direkt auf der Haut um die Augenlider, um überlegene Augen Isolierung 7 bereitzustellen. Die Beleuchtung der Stimulator muss vorher kalibriert werdenmit einem Photometer.
  7. Liefern Fotostimulation durch Lichtblitze 100 mal mit einer Frequenz von 1 Hz, bei niedrigen und hohen Bandpassfiltereinstellungen von 1 bis 100 Hz. Das Signal Abtastrate bei 5 kHz.
    Gilt: Signale sollte mindestens bei ca. 250 abgetastet werden - 300 Hz, um sicherzustellen, dass mehr als zwei Proben werden während eines jeden Zyklus gesammelt.
  8. Naht der Haut zurück und die Tiere zu halten auf einer Erwärmung pad sich von der Anästhesie zu erholen. Aufzeichnungs kann wiederholt auf einzelne Tiere aufgezeichnet werden, um funktionelle Veränderungen über einen Zeitraum zu überwachen.
  9. Am Endpunkt, eine Überdosis zu verabreichen Injektion von Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg, ip), um das Tier einschläfern. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Herzstillstand, Atemstillstand und eine Abnahme der Körpertemperatur.

4. Gewebepräparation und Histologie

  1. Entfernen Sie die Sehnerven von eingeschläfert Tiere unter dem Mikroskop und befestigen Sie das Gewebe in 1% Paraformaldehyd O / N.
  2. gründlich waschen das Gewebe mit Kochsalzlösung. Behandeln Sie das Gewebe in einem automatischen Gewebeprozessor und betten in Paraffin. Geschnittenen Abschnitte (5-10 & mgr; m) unter Verwendung eines Rotationsmikrotom.
    Hinweis: Für die Immunhistochemie Studie beheben Gewebe in 1% Paraformaldehyd, wasche mit Kochsalzlösung und Inkubation mit 30% Saccharose O / N. Betten Sie Gewebe in OCT Einbettmedium und machen Gefrierschnitten unter Verwendung eines Kryostaten.
  3. Abschnitte in 0,1% fast blue Lösung wie Luxol (in 95% Ethanol) O / N Inkubieren bei 56 ° C. Differenzieren Sie die Abschnitte in 0,05% Lithiumcarbonat für 30 Sekunden und dann 70% Ethanol für weitere 30 sec. Schließlich in 0,1% Cresylviolett Lösung Gegenfärbung 30 Sekunden vor der Montage der Teile. Nutzen Sie die schnelle Blau-Färbung, um Myelin in den Sehnerv 5 zu identifizieren.

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Ergebnisse

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Reproduzierbare inner sessional VEP Spuren sind in Abbildung 1 dargestellt und eine signifikante Verzögerung in N1 Latenzzeit kann nach dem Sehnerv Injektion zu sehen. Teil Sehnerv Läsionen der Demyelinisierung auf histologischen Schnitten mit Luxol schnelle Blau-Färbung 5 beobachtet werden. Abbildung 2 zeigt einen repräsentativen Querschnitt mit einer kleinen Brenn demyelinisierten Läsion in der Mitte des Sehnerven. Beachten Sie, dass Querschnitt repräsentieren nicht Gesamtv...

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Diskussion

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Der Sehnerv ist sehr anfällig für mechanische Beschädigungen. Eine Quetschverletzung des Sehnervs über eine Dauer von 1 s kann über einen Zeitraum von 2 Wochen zu einem RGC-Verlust von etwa 75 % führen10. Daher ist bei der Durchführung der chirurgischen Eingriffe äußerste Vorsicht geboten. Nach den Erfahrungen der Autoren ist es viel besser, einen stumpfen Dissektionsansatz zu adaptieren, um das Gewebe um den Sehnerv herum entlang der Ausrichtung des Nervs freizulegen und zu durchdringen, als in einer senkrech...

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Offenlegungen

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Keiner der Autoren hat konkurrierende oder widersprüchliche Interessen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von der Ophthalmic Research Institute of Australia (Oria) unterstützt. Wir danken Prof. Algis Vingrys und Dr. Bang Bui, University of Melbourne, für zunächst uns helfen, die VEP Aufnahmetechnik zu entwickeln.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ketamin 100 mg/ml (Ketamil)Troy LaboratoriesAC 116
Medetomidin 1 mg/ml (Domitor)Pfizersc-204073
Tropicamid 1,0% (Mydriacyl)Alconsc-202371
Homöothermes Blanket-SystemHarvard ApparatNC9203819
Impedanzmessgerät GrassF-EZM5
Schraub-Elektroden Mikro-BefestigungselementeM1.0 & mal; 3mm Csk Schlitz M/T 304 S/S
Subdermale Nadelelektroden GrassF-E3M-72
Schnelle Reparatur DeguDent GmbH
Leuchtdiode  NichiaNSPG300A
BioverstärkerCWE, Inc.BMA-400
CED-SystemCambridge Electronic Design, Ltd.Power1401
Hamilton Spritze Hamilton87930
LysolecithinSigmaL4129
Evan' s blau SigmaE2129

Referenzen

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Visual Evoked PotentialsOptic Nerve DemyelinationRat ModelVEP RecordingSkull Implanted ElectrodesOptic Nerve MicroinjectionFocal DemyelinationElectrode ImpedancePhotic StimulationLuxol Fast Blue

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