Abstract
Uden en aktiv, blomstrende cellepopulation, der er godt fordelt og stabilt forankret til det indsatte skabelon, er usædvanlig knogleregenerering ikke forekomme. Med konventionelle skabeloner, fravær af interne mikrokanaler resulterer i manglende celleinfiltration, distribution og inhabitance dybt inde skabelonerne. Derfor, en meget porøs og ensartet sammenkoblede trabekulære-bone-lignende skabelon med mikrokanaler (biogene mikromiljø skabelon; BMT) er blevet udviklet til at behandle disse hindringer. Romanen BMT blev skabt af innovative koncepter (kapillarvirkning) og fremstillet med en svamp-skabelon belægning teknik. Den BMT består af flere strukturelle komponenter: indbyrdes forbundne primære-porer (300-400 um), der efterligner porer i knogletrabecula, mikro-kanaler (25-70 um) inden for hver trabecula og nanopores (100-400 nm) på overflade for at tillade celler at forankre. Desuden har BMT blevet dokumenteret ved mekanisk test undersøgelse at have simma- mekaniske styrkeegenskaber til dem i human trabekulær knogle (~ 3.8 MPa) 12.
Den BMT udstillede høj absorption, fastholdelse og beboelse af celler i hele bro-formede (n) skabeloner (3 cm højde og 4 cm længde). De celler, der oprindeligt var podet i den ene ende af skabelonerne mobiliseres omgående til den anden ende (10 cm afstand) ved kapillarvirkning af BMT på cellen medier. Efter 4 timer, cellerne homogent besatte hele BMT og udviste normal cellulær adfærd. Den kapillarvirkning tegnede sig for infiltration af cellerne suspenderet i medierne og distribution (aktiv migration) i hele BMT. Efter at have observeret disse kapaciteter af BMT, forventer vi, at BMTs vil absorbere knoglemarvsceller, vækstfaktorer og næringsstoffer fra periferien under fysiologiske betingelser.
Den BMT kan løse nuværende begrænsninger via hurtig infiltration, homogen fordeling og inhabitance af celler i store, volumetriske skabeloner til at reparere massive skeletdefekter.
Protocol
1. Polyurethan (PU) Svamp Forberedelse som skabelon
- Brug PU svampe at fremstille hydroxyapatit skabeloner indeholder indbyrdes forbundne porer. Brug hver svamp til at tilvejebringe det primære trabekler til dannelse af skabelonen stivere samt dannelsen af mikrokanaler i bjælkerne.
- Skær og trim 80 ppi (porer per inch) svampe i 2 bridge-former med dimensioner på 3,5 cm i højden x 5 cm i længde x 1,5 cm i bredden.
Bemærk: Dimensionerne og former kan vælges i henhold til den ønskede primære porestørrelse: 100 ppi, 80 ppi og 60 ppi. - Foretag en 100 ml 4% (w / v) NaOH-opløsning under anvendelse af en 150 ml bægerglas; derefter fordybe og klem, indtil de præparerede svampe er fuldstændig gennemblødt.
- Efter iblødsætning, placer bægeret med svampe i ultralydsapparat (42 kHz).
- Ultralyd præ-behandling af PU svampe til 15-20 min uden varme for at modificere overfladeegenskaber.
- Skyl med destilleretvand i 5-10 minutter. Under skylningen, klemme svampene og give dem mulighed for at udvide 5 til 7 gange for at fjerne den resterende NaOH inde svampene.
- Klem svampe med papirservietter for at fjerne overskydende vand; derefter tørre dem i en ovn ved 60-80 ° C.
2. Hydroxyapatit (HA) Gylle Forberedelse til Coating
- Før du foretager HA gylle, vejning af et bæger med en magnetisk omrører. Denne måling vil blive anvendt til at beregne pulver / væske-forhold.
- Mål 10 g af nanostørrelse HA pulver.
- Der tilsættes 20 ml destilleret vand i 50 ml bægerglas. Varme til 120-140 ° C og omrøres ved hjælp af en varmeplade magnetomrører.
- Tilføj 0,3 g (3% vægt / vægt) af polyvinylalkohol (PVA) (89,000-98,000 MW) pr pulver i destilleret vand under omrøring ved 300-400 omdrejninger pr.
- Der omrøres, indtil PVA er fuldstændig opløst. Opløsningen skal være klar efter fuldstændig opløsning af PVA.
- Drej off varmen og tilsæt 0,1 g (1% vægt / vægt) af natriumcarboxymethylcellulose (CMC) (ultra-lav viskositet) for pulver under omrøring ved 400-500 omdrejninger pr. Opløsningen skal være klar efter fuldstændig opløsning af PVA.
- Der omrøres, indtil CMC er helt opløst og køle ned til stuetemperatur.
- Tilføj 0,3 g (3% vægt / vægt) af ammonium polyacrylatdispergeringsmiddel pr pulver under omrøring ved 300-400 omdrejninger pr. Omrør indtil den er helt opløst.
- Tilsæt 0,2 g (2% vægt / vægt) af glycerin pr pulver under omrøring ved 300-400 omdrejninger pr. Omrør indtil den er helt opløst.
- Langsomt dispergere HA pulveret i opløsningen under omrøring ved 600-900 omdrejninger i minuttet og holde omrøring i 5 min.
- Soniker i 5 minutter under anvendelse af en ultrasonikator at sikre dispersion af en hvilken som helst agglomerering af HA pulver.
- Tilføje 5 ml destilleret vand i blandingen under omrøring ved 600-900 omdrejninger i minuttet og varme ved 90-100 ° C.
- Hold omrøring af blandingen under anvendelse af en magnetomrører ved 600-800 rpm ved 90-100 ° C i ordER fordampe vandindholdet.
- Måle hele vægten herunder bægerglasset og blandingen fra tid til anden, indtil et pulver / væske-forhold på 1,75 til 1,8 er opnået.
- Formatering af pulver / væske-forhold, opdele pulverets vægt med den samlede vægt af blandingen (2,14), herunder pulver, reagenser og vand, minus vægten af bægeret og omrører (2.1), og minus HA pulver (2.2).
Bemærk: For eksempel: Hvis A (hele blandingen, herunder pulver, reagenser, og vand) er 49.05 g, B (bæger med omrører) er 33,5 g, og derefter C (HA pulver) er 10 g.
C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 - Tillad opslæmningen at køle ned til stuetemperatur før brug til belægning.
3. HA belægning, Tørring, og Sintring
- Coat de fremstillede PU svampe med HA coatingopslæmningen anvendelse af en rustfri spatel, indtil opslæmningen homogent fordelt i hele PU svamp på en glasplade.
Bemærk: Efter fjernelse af overskydende nedværdigelseRy, nogle af porerne kan stadig være tilstoppet med gylle på grund af den høje opslæmningsviskositet. - For at sikre sammenkobling, ensartethed og åbne porer, let blæse HA overtrukne skabeloner ved hjælp af en luftkompressor. Denne proces sikrer, at skabelonerne homogent overtrækkes både de indvendige og udvendige overflader af PU svamp.
Bemærk: Hvis en homogen belægning ikke er opnået, vil HA-coatede skabeloner kollapse under sintringsprocessen og kan også knække, mens håndtering på grund af lav mekanisk styrke. Derudover homogene coating er kritisk i at skabe mikrokanaler inden trabeculae. - Tør HA coatede skabeloner i mindst 5 timer under afkøling betingelser (20-25 ° C) med forsigtig luftcirkulation. Men forlænge tørretiden baseret på størrelsen af template.
Bemærk: Efter tørring vil HA coatede skabeloner typisk krympe ca. 8% til 10% i hver dimension. - Efter tørringen placere HAcoatede skabeloner på en alumina smeltedigel. Derefter placere dem i en høj temperatur ovn og bruge følgende 8 trin sintring profil.
- Heat 2 ° C / min, indtil 230 ° C.
- Varm 1 ° C / min, indtil 280 ° C.
- Varm 0,5 ° C / min, indtil 400 ° C.
- Heat 3 ° C / min, indtil 600 ° C. Hold ved 600 ° C i 1 time.
- Heat 5 ° C / min, indtil 1230 ° C. Hold 1.230 ° C i 3 timer.
- Cool 5 ° C / min til stuetemperatur.
Bemærk: Sintring vil yderligere skrumpe de HA-coatede svamp skabeloner med ca. 22% - 25% i hver dimension.
4. Ingress og inhabitancy af celler i Skabelon
- Kultur pre-osteoblastiske MC3T3-celler på en ikke-osteogen medier bestående af α-MEM, suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% antibiotika (streptomycin og penicillin) ved 37 ° C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 .
- Tilsæt 10 mlaf en celle suspension ved 2 x 10 6 celledensitet i en enkelt brønd i en 6-brønds plade.
- Placer 3 cm x 4 cm x 1 cm broformet skabelon lodret ind i 6-brønds plade. Placer en del af skabelonen ind i pladen indeholder cellesuspensionen og det andet ben i et tilstødende tom brønd.
- Således at skabelonen til at absorbere cellesuspensionen i 10 min.
- Der tilsættes 5 ml medier derefter til brønden, der oprindeligt blev fyldt med cellesuspensionen.
- Replenish mediet i begge brønde hver 2 eller 3 dage til 7 dage er gået.
- Fastlægge effekten af celle mobilitet ved hematoxylin og eosinfarvning 11.
- Fikseres cellerne og stillads ved at nedsænke i 100% EtOH i 20-30 min.
- Pletten med Hematoxylin for 1-2 min.
- Skyl med destilleret vand i 1-2 min for to gange.
- Dehydrere ved nedsænkning i 70%, så 95%, så 100% EtOH for 1-2 min hver.
- Pletten med eosin for 20-30 sek.
- Skyl med destilleret vand i 12 min til to gange.
- Dehydrere ved nedsænkning i 70%, 80%, 90% og 100% EtOH i 1-2 minutter hver.
- Integrer stilladset i en akryl harpiks til sektionering og billedbehandling.
- Bestem cellelevedygtigheden med 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) celleviabilitetstest og live / dead assay (Live / døde celler farvning kit MPTP) på tidspunkter af dag 3 og 7 11.
Bemærk: Ordningen af knogle-lignende skabelon fabrikation protokoller er repræsenteret i "Repræsentative resultater" session.
Representative Results
Den overordnede struktur af BMT udviser en unik tredimensionel skabelon med trabekulær knogle-lignende interne strukturer. Den BMT indeholder makro-porer, mikro-kanaler, og nano-porer. Klare konfigurationer af fuldt sammenkoblede makro-porer (gennemsnitlig størrelse på 320 um), mikro-kanaler (gennemsnitlig diameter på 50 pm) og nano-porer (gennemsnitlig størrelse på 100 nm) blev verificeret med en scanning elektron mikroskop (EVO-40; ZEISS) samt gennem mikro-tomografi.
Figur 1 viser trinvise detaljerede protokoller, at skabe en BMT. Gennem præcis styring af protokollerne fra udarbejdelsen af PU svampe til sintringsprocessen (P1 - P7, figur 1), kan følgende funktioner opnås: en meget tæt og glat overflade efter HA-coating og tørring; en præcist formet og dimensioneret 3-D skabelon; et fuldt sammenkoblet porøst trabekulære netværk, der svarer til trabekulær knogle; og mikro-kanaler within hver trabecula der efterligner intraossøse kanaler såsom Haversk kanaler og Volkmann kanaler (figur 2 & 3). Endvidere relativt høj mekanisk styrke (~ 3.8 MPa), der svarer til human trabekulær knogle blev målt ved en trykstyrke test. Meget lignende histomorfometriske parametre med de menneskelige lændehvirvler knogletrabecula blev bekræftet af mikro-CT-analyse 12. Forskellige størrelser af kapillarvirkning blev demonstreret gennem forskellige kapillære diametre i figur 4 ved hjælp af beregningsmæssige simulering. Gennem disse simuleringer, vi forventede, at BMT ville udvise varierende absorption satser inden for de primære-porer (300-400 um) og mikro-kanaler (25-70 um) baseret på diametre. Mindre kapillærer udstillet stærkere absorptionskapacitet. Denne antagelse blev bekræftet ved dette forsøg som vist i figur 5.
BMT udviste meget effektivvæskeabsorption og fastholdelse gennem kapillarvirkning af mikro-kanal strukturer; stevenel blå plet blev anvendt som det flydende medium for nemt at spore flow (figur 5). Baseret på computersimuleringer, blev BMT med disse konfigurationer ses at absorbere og tilbageholde cellesuspensioner op til 8,5 cm i samlede afstand inden for 10 sek. På grund af en stærk kapillarvirkning induceret af de interne strukturer, den farvede medium nåede den modsatte ende af en 3 cm (højde) x 4 cm (længde) x 1 cm (bredde) broformet skabelon i 1 min og 40 sek. Endvidere blev aktive celle mobilisering og inkorporering i BMT observeret (figur 6). Efterfølgende homogene celle mobilisering og vedhæftning resulteret i øget spredning og matrix dannelse i en jævnt fordelt formation. Endvidere blev lange afstande (~ 10 cm) migration af celler gennem BMT valideret umiddelbart efter BMT blev mættet med cellesuspensionen. Se eded celler overlevede i skabelonen segment, der blev udsat for luft og ikke nedsænket i dyrkningsmediet. I dette eksperiment blev dyrkningsmediet leveres til cellerne ved udelukkende i brøndene rører kun benene på stilladset. Kapillarvirkningen udvises af mikrokanaler derefter lov til frisk medium for at nå toppen, brodel af stilladset. Efter 3 dages kultur, blev skabelonen optaget hurtigt prolifererende celler. Efter 7 dages dyrkning blev hver trabecula indpakket ekstra cellulære matricer og indlejret med celler 13.
Figur 1. Den samlede knoglelignende skabelon fabrikation protokol fra forbehandling af PU svamp (P1) til afsluttende varmebehandling (P7). Holde præcise sintring profil efter P7 er afgørende for opnåelsen af en gunstig mekanisk styrke.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2 Repræsentant stereomikroskop (AmScope, SM-2TZ-M) billeder (x4) af en 80 ppi størrelse PU svamp (til venstre), HA belagt og tørret BMT (midten), og sintret BMT (til højre) (Dimension: 3. cm i højden x 4 cm i længde x 1 cm i bredden). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. SEM og mikro-CT-billeder af en biogene skabelon: (A) et samlet billede af en biogent skabelon,
. Figur 4. Computational beregning af kapillarvirkning med forskellige kanaldiametre inden for samme tidsrum (0,4 ms), mens den største kapillær (d = 300 um: refererer til primær-pore) absorberes mediet (blå) op til 0,16 mm i højde, den mindste kapillær (d = 30 um: refererer til mikro-kanal) absorberede mediet op til 0,415 mm i højden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Billeder viste forskelle i absorption kapaciteter af kapillarvirkning baseret på forskellige størrelser af primær-porer og mikro-kanaler (primær-porestørrelse refererer til den gennemsnitlige diameter: 60 ppi ≈ 470 um, 80 ppi ≈ 320 um, 100 ppi ≈ 200 um). De gule linjer repræsenterer kapillarvirkning induceret af kombinationen af primary porer og mikrokanaler. De røde linjer repræsenterer kapillarvirkning induceret af hovedsageligt mikro-kanaler udstillet i hvert trabecula. Som vist i (F), 100 ppi skabelon inducerede den stærkeste kapillarvirkning, hvilket resulterer i fuldstændig mætning af skabelonen inden for 39 sek. De 80 ppi og 60 ppi skabeloner blev testet derefter. (B) 0 sek, (C) 0,5 sek, (D) 1,5 sek, (E) 17,0 sek, (F) 39,0 sek, (G) 50,0 sek og (H) 1 min 18 sek efter neddykning. (Skabelon dimension: 1cm x 1 cm x 4 cm i højden terningformet). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. indtrængning og indvandring af celler fra seedede brønde (del I) til podede brønde (del V) gennem de biogene skabeloner induceret af kapillarvirkning. De oprindeligt podede celler nået slutningen af den upodede ben (del V) umiddelbart efter fuld mætning. Efter 3 dage, var tydelig sammenløbet af cellerne i hele skabelonen. Efter 7 dage spatiotemporale collagenmatrix dannelsen forekom inden for de cellepopulationer (H & E stain). (Template dimension: 3 cm i højden x 4 cm i længde x 1 cm i bredden). Venligst click her for et større version af dette tal.
Discussion
En multikomponent skabelon herunder celler, vækstfaktorer, næringsstoffer osv er nødvendig for en vellykket knogleregeneration og funktionelle genoprettelse af kritiske størrelse store knogledefekter. Inden for disse faktorer, anatomisk overensstemmende biologiske egenskaber er afgørende. For at opnå biologisk funktionalitet, skal skabelonen udvise biokompatibilitet, osteokonduktivitet, mekaniske integritet, et areal, en tilstrækkelig overflade tekstur, og midlerne til ilt og næringsstoffer transport. På celleniveau, følgende funktioner er særligt afgørende for funktionel genopretning af massive knogledefekter: lettet indtrængen i skabelonen (aktiv rekruttering), ensartet fordeling i hele skabelonen (fastholdelse), accelereret proliferation og høj levedygtighed (beboelse). Endelig den efterfølgende dannelse af betydelige ekstra cellulær matrix og udløsning af genekspression er afgørende for fundamentale biologiske processer, såsom hurtig vaskularisering ennd osteogenese.
Mange forskellige typer af syntetiske erstatninger er blevet foreslået at erstatte auto- / tildelinger knogletransplantater. Men den nuværende stillads organisationen ikke udviser en intern mikromiljø indeholder mikro-kanaler og nano-porer, og derfor ikke aktivt fremmer celle infiltration, distribution og inhabitance dybt ind de syntetiske substitutter, der er større end 10 mm. De giver ikke fysiske signaler til banebrydende celler til effektivt, hurtigt og ensartet vandrer dybt i knoglen skabelonen. I stedet, den begrænsede passive rekruttering af celler skaber en ulige fordelt cellepopulationer mellem de ydre og indre områder af stilladset. Dette forværrer ikke kun den indledende udfordring i de celler der strækker den indre kerne af skabelonen, men hindrer også næringsstoffer flow og celle kommunikation med den anden ende af det syntetiske stedfortræder. Denne type af uforholdsmæssig celle rekruttering og inhabitation resulterer i celle death og ufuldstændig knoglevækst efter stilladset er implanteret i kroppen 14,15.
Således har vi indført begrebet kapillarvirkningen som den primære fysiske cue til at løse disse hindringer. Vi har grundigt manipuleret mikro-kanaler i BMT at inducere kapillær handling, der vil tegne sig for den primære trække kraft ansvarligt for aktivt at rekruttere celler dybt ind i BMT.
PU svamp coating teknik viser en række unikke egenskaber. For det første giver mulighed for en nem tilberedning af velkontrollerede porøse trabekulære strukturer, som selv afhænger af de foruddefinerede skabelon strukturer (dvs. 80 pore per tomme skabelon til 300-400 um). Dette er meget vigtigt for at optimere porestørrelse for osteoblast infiltration 15. For det andet, den teknik muliggør konstruktionen af indbyrdes forbundne mikro-kanaler, der tegner sig for den betydelige rolle initialisering celle udflytning 11. For det tredje, er der næsten ingen begrænsninger, når du bruger PU svamp i form af oprettelse af brugerdefinerede former og størrelser af skabelonerne. Maker kan bruge en saks til simple former eller endda beregnet laserskæring for komplekse geometrier. Ved hjælp af disse præcist kontrollerede teknologier, vi skabte BMT. HA blev valgt som udgangsmateriale på grund af dets biokompatibilitet og osteokonduktive kapacitet 17.
I denne undersøgelse er der flere vigtige skridt, der skal fremhæves. Under HA slemmeriet, hvis temperaturen er for høj, og omrøringshastigheden er for lav, vil HA opslæmningen sætte sig fast på bundkanterne af bægerglasset og tør op. Efter coatingprocessen når blæser ud af det overskydende HA opslæmning, kan for høj en lufttryk inducere revner på overfladen af BMT. Det er vigtigt at holde lufttrykket relativt lav til korrekt luft ud overskydende HA opslæmning alene. Endelig det andet og tredje trin i sintringsprocessener mest afgørende (Heat 1 ° C / min, indtil 280 ° C og opvarmes 0,5 ° C / min, indtil 400 ° C). I dette temperaturområde vil PU svamp helt brænde ud, mens HA bliver tæt. Hvis denne protokol ikke er fulgt nøje, vil BMT blive kollapsede eller smuldret efter sintring.
Beskrevet i denne undersøgelse BMT giver flere fordele. Først de indbyrdes forbundne makro-porer (300-400 um) efterligner dem af menneskelig trabekulære knogle og giver mulighed for jævn knoglemarv flow. For det andet, er skabelonerne består af mikro-kanaler (25-50 um) inden for hver trabekulære septum at fremskynde den oprindelige indtrængning af knogleceller via kapillarvirkning. Som påvist ved hjælp af computersimuleringer 13, hvis skabelonen kun havde 300 um porer (primær porer), og ingen mikrokanaler, ville være utilstrækkelig til fuldstændig mætning af skabelonen med knoglemarv kapillarvirkning. Dette vil især være tilfældet for store størrelse defekter, der ville kræve large størrelse skabeloner. Mikrometer størrelse kanaler udviser flydende absorption yderst effektiv, og forventes således vi mikrokanalerne at være hovedansvarlig for kapillarvirkningen i vores undersøgelse. For det tredje har vores BMTs strategisk placeret nano-porer. Data fra litteraturen indikerer, at celler er særligt følsomme over for nano-mønstre 18,19; derfor forventede vi nano-porerne på væggene i mikrokanalerne at spille en rolle ved at øge cellebinding. Nanostørrelse porer (100-400 nm) på overfladen af det trabekulære septa tilladt immobiliserede celler til anker. Samlet set den kombinerede effekt af disse tre interne strukturer resulterede i øget celle mobilisering og vedhæftning i hele skabelonen. Der er dog nogle begrænsninger i protokollen og de kritiske trin at fremstille perfekte BMT. For eksempel er der ofte en stor mængde af HA opslæmning fremstillet på grund af vanskeligheden ved at bevare en homogen viskositet, mens coating. Der er også en begrænsning i at gøreskabeloner større end 5 cm 3 i volumen på grund af arbejdstiden, mens belægning. Belægningen tykkelse er kritisk, som varierer afhængigt Maker'ens teknikker.
Resultaterne af vores undersøgelse tyder på, at BMT i stand til at absorbere og tilbageholde celler vil tilbyde potentielle fordele i forhold til konventionelle alloplastic (eller syntetiske) stilladser. En prospektiv undersøgelse overvejes at kontrollere fordelene ved BMT på osteogenese og / eller angiogenese sammen med knogle-relaterede vækstfaktorer. Derfor er vi hævder, at vores unikke featured BMT stillads kan tage fat på de store barrierer af utilstrækkelig knoglemarv infiltration i de syntetiske konstruktioner og ufuldstændig knogle regeneration i store defekter.
Det endelige mål med denne undersøgelse er at forenkle den nuværende paradigme bioteknologi i knoglerekonstruktion og funktionel genopretning i kritisk størrelse knoklede defekter ved at eliminere behovet for tids- / arbejdskrævende knoglemarvsstromaL-celler isolation og ekspansion processer. Endelig ønsker vi at udnytte anatomisk overensstemmende 3D-konstruktioner med mikro-kanaler og nano-porer, som inducerer hurtig celle absorption, homogen fordeling, og inhabitance til rekonstruktion af knogle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyurethan sponge | Plastifoam | PU-3215 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 167176 | |
| Hydroxyapatite Powder | Ossgen | ||
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| Carboxymethyl cellulose sodium salt | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| ammonium polyacrylate | Vanderbilt | DARVAN 821A | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G2289 |
References
- Petrie Aronin, E. C., et al. Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).
- Guzmán, R., et al. Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration. PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).
- Cha, J. K., et al. Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs. J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).
- Manassero, M., et al. Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).
- Reichert, J. C., et al. A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds. Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).
- Woodard, J. R., et al. The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity. Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).
- Correia, C., et al. Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).
- Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).
- Oh, D. S., et al. Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept. Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).
- Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J. Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).
- Volkmer, E., et al. Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone. Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).
- Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues. Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).
- Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method. Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).
- Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. 3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).
- Wan, Y., et al. Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide). Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).
- Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions. Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).
